槲皮素抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖和遷移的機制

魏建宏 喬麗萍

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200)

槲皮素抑制口腔鱗癌細(xì)胞增殖和遷移的機制

魏建宏 喬麗萍1

(山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院，山西 汾陽 032200)

目的 探討槲皮素對人類口腔鱗癌(SAS)細(xì)胞增殖和遷移的影響及其作用機制。方法 體外培養(yǎng)SAS細(xì)胞，分別加入不同濃度的槲皮素進(jìn)行處理后用MTT實驗檢測細(xì)胞增殖抑制情況；采用涂有Matrigel膠的Transwell 小室模型對SAS細(xì)胞進(jìn)行體外侵襲力檢測；劃痕實驗研究槲皮素對SAS細(xì)胞遷移的影響；明膠酶譜法測定SAS細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的活性；蛋白質(zhì)印跡法研究槲皮素與SAS細(xì)胞遷移和侵入相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的關(guān)系。結(jié)果 槲皮素可以濃度、時間依賴性抑制SAS細(xì)胞的增殖；劃痕實驗、Transwell小室遷移實驗中，隨著槲皮素濃度提高，SAS細(xì)胞遷移數(shù)目呈遞減趨勢、細(xì)胞侵襲能力呈遞減趨勢；槲皮素可以顯著抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)；槲皮素抑制SAS細(xì)胞中核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB蛋白的表達(dá)。結(jié)論 槲皮素抑制SAS細(xì)胞生長能力，通過抑制MMP-2和MMP-9的蛋白表達(dá)以及NF-κB蛋白的表達(dá)阻斷SAS細(xì)胞遷移、運動以及侵襲。

口腔鱗癌細(xì)胞；核轉(zhuǎn)錄因子；基質(zhì)金屬蛋白酶；槲皮素

口腔鱗癌(SAS)發(fā)生于口腔，是頭頸部常見的惡性腫瘤〔1〕。與SAS相關(guān)的因素有吸煙、飲酒、咀嚼檳榔、病毒感染、營養(yǎng)不良、飲食習(xí)慣和局部刺激等，其中吸煙、飲酒的危險性最大；在中國臺灣地區(qū)，咀嚼檳榔與口腔癌的發(fā)生率關(guān)系最為密切〔2〕。手術(shù)(放療或化療)是目前治療口腔癌的最主要手段，但是手術(shù)后的生存率與預(yù)后往往不能使口腔癌患者滿意，并且癌細(xì)胞還會轉(zhuǎn)移到其他器官或組織中。癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中涉及細(xì)胞的骨架蛋白，改變細(xì)胞的黏附能力，從而影響細(xì)胞的運動，包括腫瘤細(xì)胞的侵入和遷移。文獻(xiàn)〔3〕表明，癌細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)移時，與細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和尿激酶纖溶酶原激活物(uPA)會過分表達(dá)，因此，使用藥物來抑制MMP和uPA(12-14)的表達(dá)或MMP酶活性(9-11)可預(yù)防癌癥的轉(zhuǎn)移。

槲皮素是一種多羥基黃酮類化合物，具有抗氧化、抗腫瘤等生物學(xué)活性及很高的醫(yī)藥用途〔4〕。槲皮素可抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)凋亡。研究表明〔5〕，槲皮素能通過降低凋亡抑制基因β淋巴細(xì)胞瘤(Bcl)-2表達(dá)、增加促凋亡蛋白(Bax)的數(shù)量、上調(diào)腫瘤細(xì)胞抑癌基因PTEN表達(dá)及抑制環(huán)氧合酶(COX)-2的表達(dá)來發(fā)揮誘導(dǎo)凋亡作用；槲皮素亦能通過表皮生長因子受體(EGFR)介導(dǎo)抑制腫瘤細(xì)胞中MMP-9的分泌，從而抑制腫瘤細(xì)胞侵襲能力。本文旨在探討槲皮素如何抑制人SAS細(xì)胞遷移和侵襲。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑 槲皮素、二甲基亞砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)、核糖核酸酶-A、考馬斯藍(lán)和Tris-HCl購自Sigma-Aldrich Corp.(St.Louis，MO，USA)。Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、L-谷氨酰胺、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶-乙二氨四乙酸(EDTA)購自Life Technologies(Carlsbad，CA，USA)。MMP-9(cat.AB19016)購自Merck Millipore(Billerica，MA，USA)，MMP-2、MMP-7、COX-2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、活化B細(xì)胞的核因子κ輕鏈增強子(NF-κB)和二級抗體購自Cruz Biotechnology，Inc(Santa Cruz，CA，USA)，使用前在PBSTween-20中稀釋。

1.2 SAS細(xì)胞的培養(yǎng) SAS細(xì)胞系購自上海酶研生物科技有限公司，將細(xì)胞立即置于75 cm2組織培養(yǎng)瓶中，用含有10% FBS、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素的2 mmol/L L-谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基，然后37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，直到細(xì)胞生長至約50%～70%融合。接種于12孔板中24 h，每孔2×105個細(xì)胞，待細(xì)胞單層貼壁后，用濃度為25、50、100、150、200和400 μmol/L槲皮素處理24 h。然后收取細(xì)胞并用PI(4 μg/ml)染色，通過流式細(xì)胞術(shù)(FACS calibur流式細(xì)胞儀；BD Biosciences，San Jose，CA，USA)進(jìn)行分析。

1.3 劃痕實驗 細(xì)胞在6孔板中以5×105個細(xì)胞/孔形成融合單層，然后采用Lai等〔6〕方法，用200 μl移液管尖端使細(xì)胞受傷，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，將培養(yǎng)皿中的所有細(xì)胞用濃度為0、25、50 μmol/L的槲皮素處理，然后在含有1% FBS的新鮮DMEM培養(yǎng)基中溫育24 h。使用相差顯微鏡拍攝照片，于24 h觀察細(xì)胞遷移情況。通過倒置顯微鏡(OlympusIX71，Tokyo，Japan)觀察和測量每種處理的培養(yǎng)皿中空白區(qū)域，細(xì)胞遷移計算為剩余空白區(qū)域與初始傷口面積相比的百分比，每個測試進(jìn)行3次。

1.4 Transwell體外遷移實驗 使用約30 μgⅠ型膠原(Merck Millipore)包被8 μm孔過濾器(Cat。PIEP12R48；Merck Millipore)1 h，將DMEM培養(yǎng)基中的細(xì)胞以2.5×104細(xì)胞/孔的密度置于Transwell上室中并加入0.5%DMSO(對照)和25、50 μmol/L槲皮素分別處理24、48 h。取出小室，取下濾膜，4℃下用5%戊二醛固定10 min，然后用2%結(jié)晶紫染液在水平搖床上染色30 min，PBS漂洗3次，棉簽擦除膜上層未穿過的細(xì)胞，將Transwell小室底面朝上置200倍顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照計數(shù)。以上實驗獨立重復(fù)3次。

1.5 Transwell體外侵襲實驗 細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，3 000 r/min離心，去除培養(yǎng)液，PBS清洗2次，用含0.1% FBS的DMEM培養(yǎng)為懸浮細(xì)胞，濃度5×104細(xì)胞/孔，置于Transwell的上室中并用0.5%DMSO(作為對照)、槲皮素(25和50 μmol/L)處理。將含有10%FBS的培養(yǎng)基置于下室中，然后將細(xì)胞在37℃，5%CO2中孵育24 h，用棉簽擦除Matrigel以及上室內(nèi)細(xì)胞，室溫下多聚甲醛固定10 min，并用2%結(jié)晶紫染色10 min，清水漂洗4遍，將Transwell小室底面朝上置200倍顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況并拍照計數(shù)。

1.6 MMP-2/-9活性測定 通過明膠酶譜法測定SAS細(xì)胞中MMP-2和MMP-9的活性。將細(xì)胞(2×106個細(xì)胞/孔)接種在6孔板中，并分別在濃度為10、15、20、25和50 μmol/L的槲皮素?zé)o血清DMEM培養(yǎng)基中溫育24 h，離心收集樣品，然后在含有0.1%明膠的10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上電泳分離，然后25℃下將凝膠在2.5%Triton X-100的dH2O中浸泡2次，共60 min，然后37℃下在底物緩沖液(50 μmol/L Tris HCl、5 mmol/L CaCl2、0.02%NaN3和1%Triton X-100、pH8.0)中孵育18 h。0.3%考馬斯藍(lán)在50%甲醇和10%乙酸中的陰性染色與MMP-2和-9的活性條帶進(jìn)行對比。

1.7 Western印跡分析 將SAS細(xì)胞(1×106個細(xì)胞/孔)置于6孔板中，然后加入槲皮素(25和50 μmol/L)溫育(24 h、48 h)，當(dāng)與培養(yǎng)物達(dá)到80%融合時收取細(xì)胞，重懸于PRO-PREP TM蛋白提取溶液(iNtRON Biotechnology，Seongnam-si，Gyeonggi-do，Korea)中。將每個樣品的勻漿于4℃下以3 000 r/min離心10 min除去細(xì)胞碎片并收集上清液，使用Bio-Rad蛋白測定試劑盒(Hercules，CA，USA)測量每個上清液樣品的總蛋白。提取總蛋白，測定蛋白濃度后每孔按40 μg蛋白上樣。將蛋白經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移到Immobilon-P膜上(IPVH00010；Merck Millipore)。使用一抗雜交1 h，漂洗后二抗染色，使用Immobilon Western化學(xué)發(fā)光辣根過氧化物酶(HRP)底物(WBKLS0500；Merck Millipore)和X射線膠片(GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA)進(jìn)行蛋白分析并拍照。

1.8 共聚焦激光掃描顯微鏡顯示SAS細(xì)胞中的蛋白質(zhì)易位 將細(xì)胞(5×104個細(xì)胞/孔)置于4孔板上，將濃度為25 μmol/L的槲皮素加入細(xì)胞中孵育24 h。孵育結(jié)束后，載玻片上的細(xì)胞用PBS中的4%甲醛固定15 min，然后使用2%BSA封閉非特異性結(jié)合位點，用PBS中的0.3%Triton-X 100透化1 h。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件行t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 槲皮素對SAS細(xì)胞存活率的影響 與對照組〔(100.0±3.8)%〕相比，槲皮素處理過的SAS細(xì)胞存活明顯減少〔25、50、100、150、200、400 μmol/L組存活率分別為(82.5±6.4)%、(58.8±7.1)%、(42.5±6.6)%、(33.2±5.8)%、(31.2±7.3)%、(18.5±4.6)%,P<0.05〕，并且隨著槲皮素濃度的增加，凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯增加，說明槲皮素與細(xì)胞凋亡數(shù)具有濃度依賴性。

2.2 槲皮素對SAS細(xì)胞遷移和侵襲的影響 見圖1。細(xì)胞遷

圖1 槲皮素對SAS細(xì)胞遷移和侵襲的影響(×200)

移實驗結(jié)果表明，與對照組(100%)相比，濃度為25、50 μmol/L槲皮素對細(xì)胞遷移具有顯著的抑制作用，并且當(dāng)細(xì)胞分別用槲皮素處理24和48 h后，細(xì)胞遷移率分別為〔(56.4±4.2)%、(42.8±5.0)%〕和〔(51.9±4.4)%、(30.6±5.3)%〕，與對照組相比具有極顯著差異(P<0.001)。細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果表明，與對照組相比，濃度為25、50 μmol/L槲皮素對細(xì)胞侵襲具有顯著的抑制作用，并且當(dāng)細(xì)胞分別用槲皮素處理24、48 h后，細(xì)胞遷移率分別為〔(35.7±8.8)%、(24.5±2.8)%〕和〔(41.6±5.5)%、(35.1±4.8)%〕，與對照組相比具有極顯著差異(P<0.001)。且槲皮素對SAS細(xì)胞遷移和侵襲的抑制與濃度、作用時間有依賴性，濃度越大、作用時間越長槲皮素對SAS細(xì)胞遷移和侵襲的抑制能力越強。

2.3 槲皮素對SAS細(xì)胞劃痕的影響 見圖2。SAS細(xì)胞在0、25和50 μmol/L槲皮素中溫育0、12和24 h。與對照組相比，槲皮素處理組的SAS細(xì)胞劃痕面積較大，且不同濃度、不同作用時間槲皮素處理的SAS細(xì)胞劃痕具有顯著差異，濃度越大、作用時間越長槲皮素抑制SAS細(xì)胞劃痕的愈合能力越強。

圖2 槲皮素對SAS細(xì)胞劃痕的影響(×40)

2.4 槲皮素對SAS細(xì)胞中MMP-2和MMP-9活性的影響 槲皮素能夠抑制SAS細(xì)胞的MMP-9和MMP-2活性，并且濃度越大、作用時間越長抑制能力越強。見圖3。

2.5 槲皮素對與SAS細(xì)胞遷移和侵入相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響 槲皮素能夠降低MMP-2、-7、-9、-10和VEGF的表達(dá)，降低NF-κB p65、iNOS、COX-2和uPA的表達(dá)。見圖4,圖5。

2.6 槲皮素對SAS細(xì)胞中NF-κB表達(dá)的影響 SAS細(xì)胞在含有25 μmol/L槲皮素條件下溫育24 h，然后用NF-κB p65標(biāo)記的二抗(綠色熒光)染色，并且通過激光共聚焦顯微鏡(比例尺20 μm)檢測蛋白表達(dá)情況。結(jié)果顯示槲皮素抑制SAS細(xì)胞中NF-κB蛋白的表達(dá)。見圖6。

圖3 槲皮素對SAS細(xì)胞中MMP-2和MMP-9活性的影響

圖4 槲皮素對與SAS細(xì)胞遷移相關(guān)的蛋白質(zhì) 表達(dá)水平的影響

圖5 槲皮素對與SAS細(xì)胞侵入相關(guān)的蛋白質(zhì) 表達(dá)水平的影響

圖6 槲皮素對SAS細(xì)胞中NF-κB表達(dá)的影響(×400)

3 討 論

淋巴結(jié)擴散和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的高發(fā)生率是導(dǎo)致SAS預(yù)后不良的根本原因。槲皮素是一種在自然界廣泛分布的黃酮類化合物，其抗腫瘤及抗氧化方面的作用受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。近年來研究發(fā)現(xiàn)〔7〕，槲皮素能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞的分裂和增殖，通過多種途徑促進(jìn)其凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲。但對SAS癌細(xì)胞遷移轉(zhuǎn)移能力的影響以及機制研究較少，因此，本研究探討了槲皮素對SAS口腔癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響，測定SAS口腔癌細(xì)胞遷移潛力，為抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)其凋亡、抗腫瘤血管生成等提供科學(xué)依據(jù)。

有研究表明〔8〕，癌細(xì)胞的遷移和侵入涉及MMP的表達(dá)，MMP-2和MMP-9可以降解Ⅳ型膠原，破壞細(xì)胞外基質(zhì)的降解平衡，使癌細(xì)胞容易突破細(xì)胞外基質(zhì)以及基底膜，從而使癌細(xì)胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，抑制MMP-2和MMP-9表達(dá)或酶活性可以用作預(yù)防癌癥轉(zhuǎn)移的早期靶標(biāo)。本實驗發(fā)現(xiàn)，槲皮素對SAS細(xì)胞的抑制作用具有濃度和時間依賴性，濃度越高、時間越

長其抑制能力越強，并且槲皮素通過抑制MMP-2和MMP-9的活性和表達(dá)來抑制SAS細(xì)胞的遷移和侵襲，從而抑制了腫瘤的轉(zhuǎn)移。

NF-κB家族中p65的含量最豐富，p65/p50最早被發(fā)現(xiàn)而且也是存在最廣泛的二聚體形式，可以調(diào)控下游多種靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，參與細(xì)胞多種重要的生命活動〔9〕。細(xì)胞在靜息狀態(tài)下處于無活性狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞受到如寄生蟲、病毒等生物因素刺激時，p50/p65 釋放出來進(jìn)入細(xì)胞核中，與基因上κB 結(jié)合位點特異性結(jié)合，成為活化的NF-κB信號通路，并且上調(diào)下游的靶基因環(huán)氧化酶(COX)-2，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖和分化。本研究表明，槲皮素能夠減少NF-κB蛋白的表達(dá)水平，使NF-κB信號通路的活性降低，并且下調(diào)下游的靶基因COX-2的活性，阻斷信號通路，從而抑制了SAS口腔癌細(xì)胞的增殖和分化。

綜上所述，槲皮素以濃度、時間依賴性方式抑制MMP-2和-9的活性，從而抑制SAS細(xì)胞中遷移和侵入的可能信號途徑；槲皮素通過減少NF-κB蛋白的表達(dá)水平，阻斷COX-2的信號通路，從而抑制了SAS細(xì)胞的增殖和分化。

1 Sanjiv K，Su TL，Suman S，etal.The novel DNA alkylating agent BO-1090 suppresses the growth of human oral cavity cancer in xenografted and orthotopic mouse models〔J〕.Int J Cancer，2012；130(6)：1440-50.

2 Liu S Y，Lu CL，Chiou CT，etal.Surgical outcomes and prognostic factors of oral cancer associated with betel quid chewing and tobacco smoking in Taiwan.〔J〕.Oral Oncol，2010；46(46)：276-82.

3 Gullu IH，Kurdoglu M，Akalin I.The relation of gelatinase(MMP-2 and-9)expression with distant site metastasis and tumour aggressiveness in colorectal cancer〔J〕.Br J Cancer，2000；82(1)：249.

4 孫 涓，余世春.槲皮素的研究進(jìn)展〔J〕.現(xiàn)代中藥研究與實踐，2011；25(3)：85-8.

5 王 剛，杜士明，楊光義，等.槲皮素抗腫瘤的分子機制研究進(jìn)展〔J〕.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2011；31(4)：322-4.

6 Lai KC，Huang AC，Hsu SC，etal.Benzyl isothiocyanate(BITC)inhibits migration and invasion of human colon cancer HT29 cells by inhibiting matrix metalloproteinase-2/-9 and urokinase plasminogen(uPA)through PKC and MAPK signaling pathway〔J〕.J Agric Food Chem，2010；58(5)：2935-42.

7 孫 怡，顧 君.槲皮素抑制乳腺癌細(xì)胞遷移侵襲及分子機制研究〔J〕.中國中藥雜志，2015；40(6)：1144-50.

8 Coussens LM，Werb Z.Matrix metalloproteinases and the development of cancer〔J〕.Chem Biol，1996；3(11)：895-904.

9 楊 雪，歐俐蘋，王曉榮，等.PLCε基因通過NF-κB/p65途徑抑制腎癌786-0細(xì)胞的增殖〔J〕.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2014；36(19)：2010-5.

〔2017-01-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

魏建宏(1972-)，男，碩士生導(dǎo)師，副教授，主要從事神經(jīng)毒理研究。

R73

A

1005-9202(2017)11-2646-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.11.020

1 山西省汾陽醫(yī)院口腔科