穩(wěn)定過表達生長分化因子5基因大鼠脂肪干細胞系的建立

王會仁， 曹 露， 江立波， 林 紅， 李熙雷， 董 健

復旦大學附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032

·論 著·

穩(wěn)定過表達生長分化因子5基因大鼠脂肪干細胞系的建立

王會仁， 曹 露， 江立波， 林 紅， 李熙雷， 董 健*

復旦大學附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032

目的： 探討慢病毒介導的穩(wěn)定過表達生長分化因子5(GDF-5)基因大鼠脂肪干細胞(ASCs)的構建條件和方法。方法： 取大鼠腹股溝脂肪墊組織，采用Ⅰ型膠原酶消化貼壁法分離培養(yǎng)大鼠ASCs。倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，CCK-8法測定細胞生長曲線，流式細胞儀鑒定細胞表型。制備帶GDF-5/GFP融合基因的慢病毒載體系統(tǒng)，探索不同感染復數(shù)(MOI=1、5、10、20、40、60、80、100)的轉染效率，選擇最佳MOI，采用流式細胞儀檢測轉染效率。對轉染細胞行流式細胞篩選，測定篩選后轉染細胞的陽性率。篩選出的細胞行細胞爬片，DAPI染色，形態(tài)學上進一步驗證細胞陽性率；并采用CCK-8法檢測轉染后細胞活力。結果： 成功培養(yǎng)大鼠ASCs，流式細胞免疫表型鑒定：間充質干細胞表面抗原(CD90、CD29、CD44、CD105)表達陽性，造血細胞表面抗原(CD45、CD34)和骨髓干細胞表面抗原(CD106)表達陰性。成功構建GDF-5過表達慢病毒載體系統(tǒng)，慢病毒轉染大鼠ASCs最佳MOI為40，轉染率為65%。采用GFP熒光流式細胞篩選技術篩選后陽性率可提高至96%。CCK-8法顯示，轉染后細胞活力、生長曲線與未轉染細胞無明顯差異。結論： 膠原酶消化法可成功培養(yǎng)大鼠ASCs，流式細胞篩選技術可顯著提高轉染細胞陽性率，且對細胞系活力無顯著影響。

脂肪干細胞；慢病毒；生長分化因子5；轉染

椎間盤退變重要的原因是椎間盤髓核細胞退變及細胞外基質(extracellular matrix, ECM)成分的改變[1]。補充髓核細胞數(shù)目和提高細胞活力是抗椎間盤退變的關鍵。脂肪來源干細胞(adipose-derived stem cells，ASCs)與髓核細胞同發(fā)生于中胚層，具有同源性，與骨髓間充質干細胞(BMSCs)相比，可避免骨髓取材帶來的諸多問題[2]。多種細胞因子，如轉化生長因子(TGF-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)、胰島素樣生長因子(IGF-1)、Sox-9、生長分化因子 5(growth differentiation factor-5，GDF-5)等被證實具有促進蛋白多糖和Ⅱ型膠原合成的作用，其中GDF-5對椎間盤髓核細胞的促進增殖和改善活力最為顯著[3]。但GDF-5是水溶性誘導因子，半衰期相對較短，且易擴散。通過基因轉染使負責表達誘導因子的基因轉入靶細胞中，使其持續(xù)表達，產(chǎn)生相應的誘導因子，從而達到持續(xù)誘導作用。

慢病毒作為一種高效穩(wěn)定的轉錄載體系統(tǒng)，常被用于建立穩(wěn)定表達特定蛋白因子的細胞系[4]。但目前GDF-5基因慢病毒載體轉染ASCs效率和穩(wěn)定性不高。因此，本研究進一步利用GDF-5與綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)組成嵌合基因，通過流式細胞篩選技術篩選出穩(wěn)定轉染的陽性細胞，建立GDF-5基因高純度穩(wěn)定轉染細胞系，為后續(xù)研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑及器材 清潔級2個月齡SD大鼠(復旦大學動物實驗部)，Ⅰ型膠原酶、L-DMEM、胎牛血清(Gibco，美國)，青、鏈霉素(上海國藥集團)，CCK-8(日本同仁化學研究所)，0.25%胰酶-EDTA消化液(Sigma，美國)，過表達GDF-5基因慢病毒載體系統(tǒng)(上海吉凱生物基因公司構建)，F(xiàn)ITC同型對照抗體、PE同型對照抗體(BioLegend，美國)，CD29、CD45、CD90抗體(BioLegend，美國)，CD44抗體(eBioscience，美國)， CD34抗體(Novus Biologicals，美國)，CD105抗體(Bioss Inc.，美國)，CD106抗體(Raybiotech，美國)，CO2培養(yǎng)箱(NAPCO，Model 5410)，DL-5型低速離心機(上海安亭科學儀器廠)，倒置相差顯微鏡(CKX31；Olympus，日本)，正置熒光顯微鏡(BX41；Olympus，日本)，流式細胞儀FACSclibur(Becton Dickinson公司，美國)。

1.2 大鼠脂肪來源干細胞(ASCs)的分離與培養(yǎng) 參照文獻[5]，采用膠原酶消化貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠ASCs。2個月齡SD大鼠無菌條件下取腹股溝脂肪組織，剔除筋膜和毛細血管，PBS液沖洗，剪碎至糊狀，0.1%Ⅰ型膠原酶溶液消化。濾網(wǎng)過濾消化液，收集濾液，離心，棄上清。將細胞接種于L-DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清，青霉素100 U/mL，鏈霉素1 mg/mL)培養(yǎng)瓶(25 cm2)中，置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3 d換液1次，待細胞融合成單層后傳代培養(yǎng)。在倒置相差顯微鏡下觀察細胞情況。細胞生長融合至80%～90%時可進行傳代。按照說明書方法采用CCK-8法檢測細胞生長曲線。

1.3 細胞表型鑒定 取第3代生長接近融合的細胞，用PBS溶液洗滌細胞2次，0.25%胰蛋白酶消化，收集細胞。每個樣品收集細胞數(shù)量約1×106，離心，PBS洗滌細胞。細胞重懸，在細胞沉淀中(細胞數(shù)量約1×106)分別加入PE-CD44熒光抗體、FITC-CD29熒光抗體、FITC-CD105熒光抗體、FITC-CD90熒光抗體、FITC-CD45熒光抗體、FITC-CD34熒光抗體、FITC-CD106熒光抗體及同型對照抗體，各2 μL，37℃溫箱中孵育30 min。再離心，PBS緩沖液清洗，重復2遍洗去殘存的未與細胞結合的抗體。最后沉淀加入100 μL預冷的PBS，搖勻使細胞重懸。上機測定抗原的陽性率。

1.4 慢病毒轉染ASCs的最適感染復數(shù)(MOI)的確定 慢病毒轉染前24 h，將第2代ASCs以1×105/孔鋪到24孔板中。細胞接種后第2天，觀察細胞形態(tài)，若細胞形態(tài)良好，用含有6 μg/mL polybrene的2 mL新鮮不含血清的L-DMEM培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基，加入不同濃度的病毒液(MOI分別為1、5、10、20、40、60、80、100)。置培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，用新鮮L-DMEM全培養(yǎng)基替換含有病毒的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。轉染后96 h，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光情況，選取熒光最佳時的MOI的病毒液在培養(yǎng)瓶中感染ASCs。96 h后流式細胞儀檢測轉染效率。

1.5 流式細胞儀篩選轉染后細胞 按照BD公司流式細胞儀FACSclibur細胞篩選操作說明進行。準備足量的無菌PBS(約3 L)和去離子水(約10 L)。細胞收集區(qū)、上樣區(qū)及管道先行消毒，調整機器參數(shù)：Precision Mode設置為purify，Target Events設置為continuous，獲取速度為每秒2 000～4 000 events，調節(jié)drop delay，使屏幕左邊方框中的數(shù)值為98%以上。轉染后的ASCs胰酶消化、離心、洗滌后，加1 mL PBS重懸，轉入無菌流式細胞儀試管，上機進行篩選。裝有3 mL L-DMEM完全培養(yǎng)基的無菌離心管作為接受管。篩選完畢后，進行流式細胞檢測。篩選后細胞按5×104/mL細胞密度接種。置于37℃、5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。8 h后換液去除未貼壁細胞。篩選后細胞爬片，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察細胞熒光情況。

1.6 Real-time PCR檢測 GDF-5基因轉染后表達效果 細胞分為兩組，ASCs-GDF-5組：流式細胞儀篩選后轉染GDF-5/GFP嵌合基因的ASCs；ASCs-GFP組：作為空白對照，只轉染GFP，不轉染GDF-5基因。根據(jù)Invitrogen公司的TRIzol操作說明書進行總RNA抽提，RNA反轉錄獲cDNA，置于-80℃保存?zhèn)溆谩肞rimer 5.0，設計檢測基因引物，內參基因為β-actin。分別檢測6個樣本，每個樣本重復3次，進行結果分析。β-actin引物序列，F(xiàn)：5′-GTA AAG ACC TCT ATG CCA ACA-3′，R：5′-GGA CTC ATC GTA CTC CTG CT-3′；GDF-5引物序列F：5′-GGT CAC AGC GGC AGA TAA-3′，R：5′-CCG AAC ATA CGA TTG GGT-3′。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0(IBM SPSS公司，USA)統(tǒng)計軟件，組間比較采用t檢驗。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察大鼠ASCs 形態(tài) 倒置相差顯微鏡下見培養(yǎng)的大鼠ASCs細胞傳代前已達90%融合，見細胞呈紡錘形或短梭形，有一定極性，細胞排列成螺旋形(圖1)。ASCs體外可正常傳代至少5代。

2.2 CCK-8法測定ASCs生長曲線 結果(圖2)表明：P1、P3、P5ASCs細胞生長曲線相似，均為“S”型，細胞在接種當天處于適應期，接種后1 d進入加速生長期，接種后2 d為對數(shù)生長期，3 d為減速生長期，4 d后進入平臺期。因此采用細胞數(shù)1∶2～1∶3傳代時，可在第3天再次傳代。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察第3代大鼠ASCs

B為A虛線方框內的放大觀. Original magnification： ×100(A)；×200(B)

圖2 CCK-8法測定細胞生長曲線

2.3 流式細胞儀檢測ASCs細胞表型 細胞表型鑒定結果(圖3)表明：間充質干細胞標志物CD90、CD29、CD44、CD105表達呈陽性，而造血干細胞標志物CD45、CD34和骨髓干細胞標志物CD106呈陰性。各種標志物表達率分別為：CD90 96.76% 、CD29 95.12% 、CD44 95.67% 、CD105 88.42%、 CD45 4.62% 、CD34 4.86% 、CD106 4.93%。

2.4 不同MOI慢病毒轉染96 h后熒光表達情況 倒置熒光顯微鏡觀察結果(圖4)表明：當MOI=1時，ASCs幾乎無熒光；MOI=5時，少許ASCs表達GDF-5，并且熒光強度較弱；MOI=10時，陽性ASCs數(shù)目和熒光強度均增加；當MOI=20時，熒光強度和陽性ASCs數(shù)仍在增加；當MOI=40時，熒光強度和陽性細胞數(shù)顯著增加，并且陽性細胞仍保持了紡錘形或短梭形形態(tài)，細胞融合后呈螺旋形排列，細胞活力好；當MOI=60時，熒光強度和陽性細胞數(shù)無明顯增加；當MOI=80和MOI=100時，轉染的ASCs形態(tài)發(fā)生改變，死亡細胞增多，且陽性細胞數(shù)和熒光強度無明顯增加。結果提示，MOI=40時，慢病毒轉染大鼠ASCs的轉染率較高。流式細胞儀測定MOI=40時的轉染率，結果(圖5)可見，流式細胞圖呈雙峰，表明流式細胞儀檢測有效，但轉染率為65.3%，遠低于穩(wěn)定轉染陽性率要求。

2.5 流式細胞儀篩選建立穩(wěn)定轉染ASCs 單純慢病毒轉染大鼠ASCs效率僅為65%，達不到后續(xù)實驗要求，利用轉染后ASCs自發(fā)綠色熒光，可使用流式細胞儀篩選技術對其篩選(fluorescence activated cells sorting，F(xiàn)ACS)，提高轉染細胞純度。篩選后傳代細胞爬片的DAPI復染后，熒光照片可見轉染后表達GFP-5的ASCs比例接近100%，細胞形態(tài)形態(tài)良好，仍為紡錘形或短梭形，螺旋形排列；流式細胞儀檢測示轉染率高達96%(圖6)。

圖3 流式細胞儀檢測培養(yǎng)的ASCs細胞表型圖

圖4 不同MOI慢病毒轉染96 h后ASCs GDF-5表達情況

圖5 流式細胞儀測定MOI=40時轉染率

2.6 流式細胞儀篩選后轉基因ASCs的光鏡下形態(tài)觀和細胞生長曲線測定 流式細胞儀篩選轉基因ASCs后，于細胞接種第3天在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，可見細胞形態(tài)無明顯變化，仍呈紡錘形，有細胞極性，細胞生長狀況良好，視野內無明顯死細胞或異型細胞(圖7A)。CCK-8法測定篩選后細胞生長曲線，并與非轉染細胞生長曲線作對比，可見篩選后的細胞(ASCs-GDF-5組)與未轉染細胞(ASCs組)生長曲線無明顯改變，篩選后細胞生長曲線仍呈“S”型，在接種后第2天進入對數(shù)生長期，接種后第3天，進入減速生長期，第4天后進入平臺期(圖7B)。結果表明經(jīng)慢病毒轉染及流式細胞儀篩選后，細胞活力和生長未造成明顯影響。

圖6 篩選后傳代細胞DAPI復染免疫熒光染色及流式細胞儀鑒定

圖7 轉基因ASCs光鏡觀察及CCK-8法測定細胞生長曲線

A：轉基因ASCs第3天光鏡照片；B：CCK-8法測定篩選后轉染細胞與非轉染細胞生長曲線. Original magnification:×100(A)

2.7 Real-time PCR檢測5代后ASCs-GDF-5的GDF-5基因表達 結果(圖8)表明：ASCs-GDF-5組的GDF-5基因的轉錄水平較未轉染組升高了約20倍，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。結果提示目的轉錄的GDF-5基因表達有效，成功建立穩(wěn)定過表達GDF-5基因的ASCs。

圖8 Real-time PCR檢測結果n=3,

3 討 論

椎間盤退變的病理生理機制復雜。椎間盤內髓核細胞數(shù)目減少、活力降低，引起細胞外基質，如Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等合成減少和成分改變，是導致椎間盤退變的病理基礎[1]。研究[6]表明，在退變腰椎間盤中，髓核細胞的凋亡率達(61.3±24.5)%，而正常椎間盤中髓核細胞凋亡率僅為(5.6±6.8)%。因此，補充細胞數(shù)目，改善細胞活力，是治療退變性椎間盤疾病的關鍵。

ASCs是一種極具前景的應用于修復椎間盤退變的種子細胞， 具有取材方便、來源充分、分離容易，擴增速度快的優(yōu)點[5, 7-10]。與骨髓基質干細胞相比，ASCs在骨科臨床應用中有較大優(yōu)勢，可避免骨髓取材帶來的諸多問題。而且體外大量實驗也證實，脂肪來源干細胞可以轉化為髓核樣細胞[11-12]。研究還發(fā)現(xiàn)，脂肪來源間充質干細胞分化為髓核細胞在細胞表型檢測上優(yōu)于傳統(tǒng)的骨髓間充質干細胞[11]。本研究中采用脂肪組織塊酶消化貼壁法成功培養(yǎng)了大鼠ASCs，經(jīng)CCK-8方法測定，培養(yǎng)的ASCs活力好、增殖快，在體外培養(yǎng)5代時細胞形態(tài)和細胞活力無明顯改變。流式細胞儀鑒定細胞表面抗原標志物也表明，培養(yǎng)的ASCs間充質干細胞表面標志物(CD90、CD29、CD44、CD105)表達呈陽性，而造血干細胞標志物(CD45、CD34)表達陰性，排除了造血干細胞污染的可能，同時骨髓間充質標志物CD106表達陰性，也排除了骨髓來源可能。這與文獻[7,12-13]報道類似。通過膠原酶消化脂肪組織貼壁法雖然可獲得脂肪多能干細胞，但其實是混合細胞群，主要為ASCs，同時還有極少量的造血細胞、內皮細胞、平滑肌細胞和周圍細胞，但隨著不斷傳代，這些混雜的非間充質干細胞類型細胞會消失，尤其是造血細胞和內皮細胞。本研究培養(yǎng)的ASCs經(jīng)流式細胞儀鑒定表明非間充質干細胞類型較少，可能是以下原因：在取材過程中盡可能減少血液污染脂肪組織標本，PBS液反復沖洗脂肪組織塊，顯微鏡下盡可能將脂肪組織中的血管和筋膜組織剔除干凈。

雖然多項研究表明，ASCs具有分化為髓核樣細胞的能力，但尋找合適的誘導因子對ASCs定向分化過程極為重要。在多個細胞因子中GDF-5對椎間盤髓核細胞的促進增殖和改善活力最為顯著[3,14-15]。此外，GDF-5還可促進蛋白多糖和Ⅱ型膠原的生成，同時提高髓核和纖維環(huán)細胞增生活力[14]。Walsh等[15]發(fā)現(xiàn)，GDF-5主要作用于內層纖維環(huán)細胞，并可使其向髓核細胞方向分化。用GDF-5處理人退變髓核細胞可以增強蛋白聚糖和Ⅱ型膠原的表達[16]。更值得一提的是，GDF-5作用于人間充質干細胞后，不表達成骨細胞表型，因此不必擔心成骨問題[17]。因此，相比較其他細胞因子，GDF-5可能會成為臨床上應用生物方法抑制或逆轉椎間盤退變的一種理想細胞因子。

細胞因子直接注射于椎間盤髓核內進行修復存在一定的弊端，如：直接注射到退變髓核內，在未與退變細胞有機結合之前有些細胞因子已經(jīng)滲漏出來；這些蛋白有半衰期，不能起到長期作用效果，需要反復注射，會大大增加椎間盤退變的風險。借助載體可在退變椎間盤內持續(xù)表達細胞因子，因此轉基因技術治療成為了熱點[18]。慢病毒載體近年來在腫瘤治療研究、轉基因動物制作、蛋白生產(chǎn)及疫苗開發(fā)中得到了廣泛應用。慢病毒載體具有轉移基因片段容量大、無毒性且不易誘發(fā)宿主免疫反應，安全性較好，不僅能轉染分裂細胞，且能轉染終末分化細胞和非分裂細胞，可使整合于靶細胞基因組的目的基因長期、穩(wěn)定表達[19-20]。本研究成功構建了攜帶GDF-5/GFP嵌合基因的慢病毒載體系統(tǒng)，并發(fā)現(xiàn)轉染大鼠ASCs最佳MOI為40。但由于大鼠ASCs難以轉染，流式細胞儀檢測轉染效率僅為65%，需要對轉染細胞進行篩選和純化。

本研究未采用傳統(tǒng)的藥物壓力篩選，如G418篩選等，主要是考慮到此方法需要細胞多次傳代進行篩選，會造成ASCs的分化功能降低，且藥物本身會對細胞活力產(chǎn)生一定影響。本研究通過流式細胞儀熒光細胞篩選技術，對GFP陽性細胞進行篩選，對轉染GDF-5基因的細胞進行純化，發(fā)現(xiàn)可大大提高篩選效率，不需多次傳代，且對細胞活力影響較小。經(jīng)流式細胞儀篩選后，GFP陽性細胞率可高達96%，且可穩(wěn)定傳代。本研究體外傳代5代后仍能高表達GDF-5，基本建立了穩(wěn)定轉染的ASCs細胞系。因流式篩選后GFP陽性細胞比例已很高，本研究未對篩選后的細胞進行單克隆化，盡量減少對細胞的影響和干擾。通過CCK-8法檢測及顯微鏡下觀察，流式細胞儀篩選后的轉染GDF-5基因ASCs細胞活力無明顯改變。對于轉染GDF-5對ASCs分化的影響，我們后續(xù)將進一步通過分析過表達GDF-5的ASCs在體外培養(yǎng)過程中細胞形態(tài)及髓核細胞相關基因蛋白表達情況來探討。此外，后續(xù)研究會將細胞與溫敏性水凝膠支架結合構建仿生髓核，進行體內實驗嘗試修復大鼠退變椎間盤。

綜上所述，通過慢病毒轉染結合流式細胞篩選技術可得到高純度的穩(wěn)定過表達GDF-5基因的ASCs，且對細胞活力和形態(tài)無顯著影響，為后續(xù)組織工程技術奠定了基礎。

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[本文編輯] 廖曉瑜， 賈澤軍

Establishment of stable GDF-5 gene over-expressed rat adipose stem cells

WANG Hui-ren, CAO Lu, JIANG Li-bo, LIN Hong, LI Xi-lei, DONG Jian*

Department of Orthopaedic Surgery, Zhongshan Hospital, Fudan University, Shanghai 200032, China

Objective： To explore the construction conditions and methods of lentivirus-mediated GDF-5 gene over-expressed rat adipose stem cells (ASCs-GDF-5). Methods： Rat ASCs were isolated and cultured using collagenase digestion method. The cell morphology was observed with the growth curve being tested. Besides, the cell phenotypes were identified. Lentiviral vector system with GDF-5/GFP chimeric gene was prepared and the infection efficiency was explored under series of MOI (1, 5, 10, 20, 40, 60, 80, 100). The optimal MOI was determined and the infection efficiency was tested using FCM. High-purified ASCs-GDF-5 were obtained through fluorescence activated cell sorting with FCM. The positive rate of infected cells was verified further with DAPI staining. The viability of infected cells was evaluated with CCK-8 assay. Results： Rat ASCs were successfully isolated and cultured. The markers (CD90, CD29, CD44, CD105) expressed in mesenchymal stem cell were positive in cultured cells. In contrast, the hematopoietic cell surface antigens (CD45, CD34) and bone marrow stem cell surface antigen (CD106) were negative. GDF-5 gene over-expressed lentiviral vector system was successfully constructed. The optimal MOI was 40, with the infection rate of 65%. The positive rate of infected cells was increased to 96% through fluorescence activated cell sorting using FCM. There was no significant difference in the viability and growth curve between infected and non-infected cells with CCK-8 assay. Conclusions： Rat ASCs can be cultured using collagenase digestion method. Without significant effect on cell viability, the positive rate of infected cells can be significantly increased through fluorescence activated cell sorting using FCM.

adipose-derived stem cells; lentivirus; growth and differentiation factor-5; transfection

2017-02-06 [接受日期] 2017-02-22

國家自然科學基金(31170925)，國家重點基礎研究發(fā)展計劃子課題(2009CB930002). Supported by National Natural Science Foundation of China (31170925) and National Basic Research Program of China (973 Program,2009CB930002).

王會仁，博士，住院醫(yī)師. E-mail: wanghuiren340@163.com

*通信作者(Corresponding author). Tel: 021-64041990, E-mail: dong.jian@zs-hospital.sh.cn

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20170084

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