響應(yīng)面法優(yōu)化機(jī)械力輔助提取千里光酚類

俞靜波,王英瑤,蘇為科

(浙江工業(yè)大學(xué)綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310014)

?

響應(yīng)面法優(yōu)化機(jī)械力輔助提取千里光酚類

俞靜波,王英瑤,蘇為科*

(浙江工業(yè)大學(xué)綠色制藥協(xié)同創(chuàng)新中心,浙江杭州 310014)

以綠原酸和金絲桃苷為得率指標(biāo),考察機(jī)械球磨參數(shù)和提取參數(shù),通過響應(yīng)面法優(yōu)化,獲得機(jī)械力輔助提取千里光酚類的最佳工藝條件。結(jié)果表明:最佳提取工藝參數(shù)為填充率27.6%,轉(zhuǎn)速308 r/min,球磨時(shí)間11.5 min。隨后經(jīng)單次水提10 min,綠原酸得率為(5.040±0.042) mg/g,金絲桃苷得率為(0.485±0.004) mg/g。與乙醇熱回流和水煎法相比,機(jī)械力輔助提取法能在較低的溫度,無需使用有機(jī)溶劑下即可快速高效地獲得酚類化合物,同時(shí)大大提高金絲桃苷的得率,減少提取物中吡咯里西啶類生物堿殘留。

千里光,酚類,機(jī)械球磨提取,響應(yīng)面優(yōu)化

千里光(SenecioscandensBuch-Ham.)為菊科千里光屬多年生草本植物,主要分布于我國(guó)浙江、江蘇、安徽等地[1],具有清熱解毒、殺蟲、明目、涼血、生肌、祛風(fēng)除濕等功效[2]。其主要成分為富有生物活性的酚類物質(zhì)和黃酮[3],包括以綠原酸為主的酚酸[4]及以金絲桃苷[5]為主的黃酮。此外,千里光植物中通常含有肝毒性吡咯里西啶類生物堿[3,6],可被醇和酸水提取[7-8],影響千里光提取物的安全使用,中國(guó)藥典規(guī)定千里光草藥中阿多尼弗林堿含量不超過0.004%[7]。酚酸和黃酮兩類物質(zhì)多采用熱醇回流[9-10]和水煎法[11-12]直接提取獲得,或采用超聲法[13-14]和微波[15-16]輔助提取獲得,目前尚未見采用機(jī)械球磨輔助提取千里光酚類物質(zhì)的研究報(bào)道。傳統(tǒng)醇提耗時(shí)久廢液多且成本高;水煎提取時(shí),由于綠原酸穩(wěn)定性差,在水中加熱時(shí)易發(fā)生酯鍵遷移形成其同分異構(gòu)體,聚合成二咖啡?？鼘幩?或者降解為咖啡酸[17],使其含量減少。超聲提取與微波提取對(duì)設(shè)備要求較高,不利于產(chǎn)業(yè)化,因此迫切需要開發(fā)綠色高效的千里光黃酮與酚酸提取方法。機(jī)械力輔助提取不但能夠避免使用有機(jī)溶劑、顯著縮短提取時(shí)間,還能降低提取溫度,大大減少綠原酸在提取過程中的不穩(wěn)定變化。本實(shí)驗(yàn)將研究一種高效環(huán)保的機(jī)械球磨輔助提取千里光酚酸和黃酮的方法,以代表性酚酸(綠原酸)和代表性黃酮苷(金絲桃苷)得率為指標(biāo),采用響應(yīng)面法優(yōu)化機(jī)械球磨輔助提取千里光的酚類的工藝,并將優(yōu)化后的提取工藝與傳統(tǒng)加熱回流提取及水煎提取工藝進(jìn)行對(duì)比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

千里光干品 購(gòu)于江西膨氏國(guó)藥堂飲片有限公司,制成粗粉(過40目篩)備用;綠原酸對(duì)照品、金絲桃苷對(duì)照品 購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院;阿多尼弗林堿對(duì)照品 購(gòu)于北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司;Ehrlich試劑 購(gòu)于上海遠(yuǎn)幕生物科技有限公司;其它試劑 購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)。

PM 200行星式球磨儀,不銹鋼球磨罐50 mL,不銹鋼球磨珠10 mm 德國(guó)Retsch;島津LC-20AT型高效液相色譜儀(色譜柱:Inertsi ODS-3 反相柱、4.6 mm×25 mm、5 μm,DAD檢測(cè)器)、UV1800紫外分光光度計(jì) 日本島津;SIGMA 3-18KS型高速臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)Sartorius;AS200振蕩篩分儀 德國(guó)Retsch。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 機(jī)械化學(xué)輔助提取千里光酚類 取千里光粉末3 g,球磨(考察球磨球填充率、球磨轉(zhuǎn)速、球磨時(shí)間),粉末充分轉(zhuǎn)移出后精密加入一定體積溶劑,提取(考察不同濃度的醇溶液、料液比、提取時(shí)間、提取溫度),過濾,得提取液并測(cè)量體積。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按1.2.1方法,以機(jī)械球磨參數(shù)與溶劑提取參數(shù)為實(shí)驗(yàn)因素,分別以綠原酸和金絲桃苷得率以及原料粉末粒度(D50)為實(shí)驗(yàn)指標(biāo),做單因素實(shí)驗(yàn),按1.2.5方法測(cè)定,對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2.1 機(jī)械球磨參數(shù)考察 在固定的提取條件(料液比1∶30 g/mL,室溫水提20 min)下考察機(jī)械球磨各參數(shù)的影響。

轉(zhuǎn)速:固定填充率(20.4%),球磨時(shí)間(10 min),考察球磨轉(zhuǎn)數(shù)(200、300、400、500 r/min)對(duì)綠原酸和金絲桃苷得率以及原料粉末粒度(D50)的影響。

球磨時(shí)間:固定填充率(20.4%),轉(zhuǎn)速(300 r/min),考察球磨時(shí)間(5、10、15、20、25 min)對(duì)綠原酸和金絲桃苷得率以及原料粉末粒度(D50)的影響。

填充率:固定轉(zhuǎn)速(300 r/min),球磨時(shí)間(10 min),考察磨球填充率(9.6%、20.4%、30%、39.6%)對(duì)綠原酸和金絲桃苷得率以及原料粉末粒度(D50)的影響。

1.2.2.2 提取參數(shù)考察 在固定的機(jī)械球磨條件(填充率30%,轉(zhuǎn)速300 r/min,球磨時(shí)間10 min)下考察各提取條件的影響。

提取溶劑:固定料液比(1∶30 g/mL),提取溫度(室溫),提取時(shí)間(10 min),考察提取溶劑乙醇濃度(0%、19%、38%、57%、76%、95%)對(duì)綠原酸和金絲桃苷得率的影響。

提取時(shí)間:固定料液比(1∶30 g/mL),提取溫度(室溫),提取溶劑(水),考察提取時(shí)間(5、10、20、30、40、50 min)對(duì)綠原酸和金絲桃苷得率的影響。

提取溫度:固定提取溶劑(水),料液比(1∶30 g/mL),提取時(shí)間(10 min),考察提取溫度(25、35、40、50、60 ℃)對(duì)綠原酸和金絲桃苷得率的影響。

料液比:固定提取溶劑(水),提取溫度(室溫),提取時(shí)間(10 min),考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 g/mL)對(duì)綠原酸和金絲桃苷得率的影響。

提取次數(shù):固定提取溶劑(水),料液比(1∶40 g/mL),提取溫度(室溫),提取時(shí)間(10 min),重復(fù)提取2次,分別測(cè)提取1、2次的綠原酸和金絲機(jī)苷得率。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選擇對(duì)綠原酸和金絲桃苷得率影響顯著的三個(gè)因素:填充率(A)、球磨時(shí)間(B)、轉(zhuǎn)速(C),每個(gè)因素設(shè)定三個(gè)水平進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。采用Box-Behnken Design進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),因素水平編碼見表1,以綠原酸和金絲桃苷得率為評(píng)價(jià)指標(biāo),其他條件均取實(shí)驗(yàn)條件下最優(yōu)。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of Box-behnken design

1.2.4 三種提取方法對(duì)比

1.2.4.1 熱回流提取法 綠原酸提取中常用的醇濃度為70%,根據(jù)文獻(xiàn)[9,18]選取優(yōu)化的熱回流提取方法:取粉末3 g,加70%乙醇90 mL,85 ℃回流2次,分別為2 h和1 h,過濾,得提取液,測(cè)量體積,冷凍干燥后稱重。

1.2.4.2 水煎提取法 根據(jù)文獻(xiàn)[11,19]選取優(yōu)化的水煎提取法:取粉末3 g,加水60 mL,60 ℃加熱20 min,提取2次。過濾,得提取液,測(cè)量體積,冷凍干燥后稱重。

1.2.4.3 機(jī)械力輔助提取法 取粉末3 g,于填充率27.6%,轉(zhuǎn)速308 r/min條件下,球磨時(shí)間11.5 min,加水120 mL,室溫提取10 min,過濾,得提取液,測(cè)量體積,冷凍干燥后稱重。

1.2.5 綠原酸和金絲桃苷含量的測(cè)定

1.2.5.1 色譜條件 流速:1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):325、360 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量10 μL;流動(dòng)相:A:0.05%甲酸溶液;B:乙腈;梯度洗脫:0～20 min、B 13%～15%,20～30 min、B 15%～17%,分析45 min;流速:1 mL/min。

1.2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 精密稱取綠原酸對(duì)照品7.1 mg,金絲桃苷對(duì)照品4.3 mg,分別用甲醇溶解并定容至10 mL,制得質(zhì)量濃度為0.71 mg/mL的綠原酸對(duì)照品溶液和0.43 mg/mL的金絲桃苷對(duì)照品溶液。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL稀釋至10 mL,按1.2.5.1色譜條件測(cè)定。

圖1 對(duì)照品和提取液HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of the standards and extract注:對(duì)照品:325 nm(A),360 nm(B),提取液:325 nm(C),360 nm(D);綠原酸(a),金絲桃苷(b)。

回收率測(cè)定:取樣品3份,每份3 g,分別加入80%、100%、120%的綠原酸和金絲桃苷對(duì)照品,球磨后(填充率20.4%,300 r/min,10 min),加90 mL水,室溫下提取10 min,提取液按1.2.5.1中色譜條件測(cè)定樣品中綠原酸和金絲桃苷的量，根據(jù)公式：回收率(%)=(C-A)/B×100(A:樣品中被測(cè)成分含量;B:加入對(duì)照品量;C:實(shí)測(cè)值),計(jì)算回收率。

表2 相關(guān)物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 2 Standard curve of standard substances

1.2.5.3 得率計(jì)算 提取液樣品稀釋一倍后過0.45 μm膜,按1.2.5.1條件測(cè)定。綠原酸和金絲桃苷得率計(jì)算公式:

式(1)

式中,C1:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得綠原酸/金絲桃苷的濃度(mg/mL);N:稀釋倍數(shù);V:提取液體積(mL);M:千里光質(zhì)量(g)。

1.2.6 千里光粉末粒度測(cè)定 采用AS200振蕩篩分儀，選用孔徑400、250、200、150、100、65 μm篩對(duì)球磨后的千里光粉末進(jìn)行篩分15 min，振幅為1 mm，取篩上和容器內(nèi)粉末與樣品的質(zhì)量比例對(duì)篩徑做篩上累計(jì)分布圖，用中位徑(D50)表示粉末的粒度大小[20]。

1.2.7 吡咯里西啶生物堿含量測(cè)定 吡咯里西啶生物堿(PAs)含量測(cè)定方法參照文獻(xiàn)[21]進(jìn)行。以吸光度A為縱坐標(biāo)，濃度X(μg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吡咯里西啶生物堿回歸方程：Y=0.0494X+0.0023(R2=0.999)，濃度在0.808～8.08 μg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

式(2)

式中,C2:根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得PAs的濃度(mg/mL);N:稀釋倍數(shù)；V：提取液體積(mL);m:提取物質(zhì)量(g)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,數(shù)據(jù)取平均值,采用Excel,Design Expert 8.0.6軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖和統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠原酸和金絲桃苷的含量測(cè)定方法

綠原酸和金絲桃苷對(duì)照品的液相圖譜如圖1(A、B),提取液圖譜如圖1(C、D)。分別選取綠原酸的紫外最大吸收波長(zhǎng)325 nm和金絲桃苷的紫外最大吸收波長(zhǎng)360 nm為分析波長(zhǎng),在上述色譜條件下,綠原酸和金絲桃苷峰形對(duì)稱,尖銳,響應(yīng)高。提取液圖譜干擾峰少。以綠原酸和金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品的液相峰面積Y為縱坐標(biāo),濃度X(mg/mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到綠原酸回歸方程:Y=1.76×107X-6.49×104,金絲桃苷回歸方程:Y=2.4227×107X-58602。綠原酸和金絲桃苷濃度分別在0.0142～0.071 mg/mL,0.0086～0.043 mg/mL范圍內(nèi),峰面積與濃度線性關(guān)系良好,綠原酸R2=0.9998,金絲桃苷R2=0.9997(表2),且具有較好的回收率(表3)。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)Table 3 Recovery rate experiment

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 機(jī)械球磨參數(shù)考察

2.2.1.1 球磨轉(zhuǎn)速的影響 結(jié)果見圖2、圖3,植物粉末粒度隨球磨轉(zhuǎn)速的提高而減小,當(dāng)轉(zhuǎn)速超過400 r/min時(shí),粉末粒度減小趨勢(shì)漸緩(圖2)。然而,綠原酸和金絲桃苷的得率隨轉(zhuǎn)速的增加均呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì),當(dāng)轉(zhuǎn)速為300 r/min時(shí)兩種成分得率均達(dá)到最佳(圖3)。隨著球磨轉(zhuǎn)數(shù)增大,供能增加,利于細(xì)胞壁破碎釋放有效成分,粉末粒度減小,提取率提高;然而轉(zhuǎn)速過高則產(chǎn)生過多能量,致使體系溫度升高,破壞有效成分,降低提取率。

圖2 轉(zhuǎn)速對(duì)粒度的影響Fig.2 Effect of milling speed on the grain size of plant powders

圖3 轉(zhuǎn)速對(duì)提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.3 Effect of milling speed on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.1.2 球磨時(shí)間的影響 結(jié)果見圖4、圖5,球磨時(shí)間延長(zhǎng),植物粉末粒度逐漸減小,但趨勢(shì)較平緩(圖4)。綠原酸和金絲桃苷含量隨球磨時(shí)間的增加均呈現(xiàn)先增加后下降趨勢(shì),球磨10 min兩種成分得率均達(dá)到最佳(圖5)。雖然延長(zhǎng)球磨時(shí)間有利于充分球磨,減小粉末粒度,但也會(huì)導(dǎo)致體系內(nèi)熱量聚集,繼而破壞有效成分。

圖4 球磨時(shí)間對(duì)粒度的影響Fig.4 Effect of milling time on the grain size of plant powders

圖5 球磨時(shí)間對(duì)提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.5 Effect of milling time on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.1.3 磨球填充率的影響 結(jié)果見圖6、圖7,填充率對(duì)粒度的影響明顯,當(dāng)填充率較小時(shí),球磨作用有限,粒度減小緩慢;當(dāng)填充率超過20.4%時(shí),球磨作用增強(qiáng),粒度減小明顯;進(jìn)一步增加填充率達(dá)39.6%時(shí),磨球運(yùn)動(dòng)空間減小,粒度減小趨勢(shì)相對(duì)減緩(圖6)。綠原酸的得率隨填充率增加而增加,當(dāng)填充率超過30%時(shí),得率幾乎不再增加;金絲桃苷的得率隨填充率的增加呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)(圖7)。隨著磨球填充率增大,球磨效果提升,粉末粒度減小,提取物得率增加。然而,填充率過大時(shí),磨球運(yùn)動(dòng)空間減小,球磨效果增加有限,且摩擦生熱增加,不利于提取物獲得。

圖6 填充率對(duì)粒度的影響Fig.6 Effect of filling degree on the grain size of plant powders

圖7 填充率對(duì)提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.7 Effect of filling degree on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2 提取條件參數(shù)考察結(jié)果

2.2.2.1 提取溶劑的影響 結(jié)果見圖8,在0%～76%乙醇下,綠原酸的得率有微量差異,可能由于不同濃度乙醇溶劑對(duì)植物細(xì)胞的滲透作用強(qiáng)弱不同,但總體差異不大。當(dāng)醇濃度為95%時(shí),綠原酸的得率明顯下降。金絲桃苷的得率在不同醇濃度下變化趨勢(shì)不明顯?？紤]成本及環(huán)境因素選用水為提取溶劑。

圖8 醇濃度對(duì)提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.8 Effect of ethanol concentration on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2.2 提取時(shí)間的影響 結(jié)果見圖9,當(dāng)提取時(shí)間過短時(shí),不利于綠原酸和金絲桃苷的提取。隨著提取時(shí)間延長(zhǎng),綠原酸和金絲桃苷的得率均有所下降,可能與其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有關(guān),因此優(yōu)選提取時(shí)間為10 min。

圖9 提取時(shí)間對(duì)提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.9 Effect of extract time on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2.3 提取溫度的影響 結(jié)果見圖10,綠原酸和金絲桃苷的得率受提取溫度影響較小:在球磨粉碎后,植物細(xì)胞壁破裂,有效成分能夠充分釋放,此時(shí),在足量的提取液中,金絲桃苷和綠原酸成分均能在短時(shí)間內(nèi)(10 min)充分溶出,提取溫度對(duì)兩種成分的溶解度未有明顯影響。因此,優(yōu)選提取溫度為25 ℃(室溫)。

圖10 溫度對(duì)提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.10 Effect of temperature on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2.4 料液比的影響 結(jié)果見圖11,隨著料液比增加,綠原酸和金絲桃苷得率逐漸增加,至1∶40(g/mL)后不再發(fā)生明顯變化,因此,優(yōu)選料液比為1∶40(g/mL)。

圖11 料液比對(duì)提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.11 Effect of solid-liquid ratio on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.2.2.5 提取次數(shù)的影響 結(jié)果見圖12,一次提取即能較為充分地提取出兩種成分,由于植物在球磨處理后,細(xì)胞壁破碎,細(xì)胞內(nèi)成分在一次提取下就能得到有效溶出。因此,優(yōu)選提取次數(shù)為一次。

圖12 提取次數(shù)對(duì)提取液綠原酸和金絲桃苷得率的影響Fig.12 Effection of extract times on the yield of chlorogenic acid and hyperoside

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

2.3.1 響應(yīng)面結(jié)果 如表4所示,進(jìn)行17個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)(5個(gè)中心點(diǎn))的響應(yīng)曲面分析。將實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行多元回歸擬合,獲得綠原酸和金絲桃苷得率對(duì)填充率(A)、轉(zhuǎn)速(B)、球磨時(shí)間(C)的二次多項(xiàng)式回歸方程為:

綠原酸得率(Y1)=5.00-0.11A+0.12B+0.14C+3.674E-003AB-0.013AC-0.041BC-0.26A2-0.16B2-0.094C2。

金絲桃苷得率(Y2)=0.49-5.770E-003A-3.292E-003B+5.245E-003C-0.011AB-3.647E-003AC-3.224E-003BC-0.025A2-0.039B2-0.024C2。

表4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)和結(jié)果表Table 4 Experimental design and results table

表5 綠原酸得率的二次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table 5 Analysis of variance table for quadratic model for chlorogenic acid yield

注:**p<0.01為極顯著,*p<0.05為顯著;表6同。

表6 金絲桃苷得率的二次多項(xiàng)式回歸模型的方差分析Table 6 Analysis of variance table for quadratic model for hyperoside yield

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析和系數(shù)顯著性檢驗(yàn),結(jié)果如表5及表6。模型極顯著,方程失擬項(xiàng)不顯著,表明所建立的二次多項(xiàng)式回歸模型成立。其中因素A、B、C、A2、B2對(duì)綠原酸得率影響均極顯著,C2影響顯著，影響大小為轉(zhuǎn)速>球磨時(shí)間>填充率。其中因素A、B、C、AB、A2、B2、C2對(duì)金絲桃苷得率影響均極顯著,AC、BC對(duì)金絲桃苷得率影響顯著,影響大小為填充率>轉(zhuǎn)速>時(shí)間。

圖13 交互項(xiàng)對(duì)綠原酸得率(A,B,C)和金絲桃苷得率(D,E,F)影響的響應(yīng)面圖Fig.13 Response surfaces representations for chlorogenic acid yield(A,B and C)and hyperoside yield(D,E,F)

如圖13所示,根據(jù)Design Expert 8.0.6獲得響應(yīng)面的3D曲面,分析各因素對(duì)綠原酸和金絲桃苷的得率的影響和各因素的交互作用。如圖13A～C,分別固定球磨時(shí)間、轉(zhuǎn)速、填充率為零水平,考察其余兩個(gè)條件對(duì)綠原酸得率的相互作用。由圖可得,各因素間交互作用的響應(yīng)面圖呈似山丘狀曲面,存在極大值,各因素對(duì)綠原酸得率影響明顯(p<0.05),但因素間兩兩交互作用對(duì)綠原酸得率影響不明顯。如圖D～F,分別固定球磨時(shí)間、轉(zhuǎn)速、填充率為零水平,考察其余兩個(gè)因素對(duì)金絲桃苷得率的相互作用,因素間兩兩交互作用對(duì)金絲桃苷的得率影響顯著(p<0.05)。

表7 三種提取方法對(duì)比Table 7 Comparison of the three extract methods

以綠原酸得率為指標(biāo)時(shí),經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化,得最佳提取工藝條件:填充率27.61%,轉(zhuǎn)速327.5 r/min,球磨時(shí)間13.55 min,此條件下綠原酸得率為5.083 mg/g;以金絲桃苷得率為指標(biāo)時(shí),得最佳提取工藝條件:填充率28.83%,轉(zhuǎn)速296.8 r/min,球磨時(shí)間10.6 min,此條件下金絲桃苷得率為0.486 mg/g。兩者的最優(yōu)條件有少許差異?？赡芘c兩者的溶解度差異及其在千里光中含量不同有關(guān)。在Design Expert 8.0.6軟件中設(shè)定綠原酸和金絲桃苷的得率均為最大值,得最佳提取工藝條件:填充率28.05%,轉(zhuǎn)速308.3 r/min,球磨時(shí)間11.57 min,此條件下綠原酸得率為5.059 mg/g,金絲桃苷得率為0.485 mg/g。

2.3.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證回歸模型的可靠性,響應(yīng)面法優(yōu)化千里光中綠原酸和金絲桃苷提取工藝的可行性,在模型所得最優(yōu)工藝條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)際操作中,采用填充率27.6%,轉(zhuǎn)速308 r/min,球磨時(shí)間11.5 min,預(yù)測(cè)綠原酸得率為5.042 mg/g,金絲桃苷得率為0.486 mg/g,三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)際值為綠原酸得率為(5.040±0.042) mg/g,金絲桃苷得率為(0.485±0.004) mg/g。與理論值偏差較小,重復(fù)性好。

2.4 幾種提取方法的對(duì)比

采用優(yōu)化后的機(jī)械球磨輔助提取方法與熱回流醇提取法及水煎提取法對(duì)比。結(jié)果見表7,球磨輔助提取綠原酸及金絲桃苷的得率均優(yōu)于其他兩種方法,其中金絲桃苷得率優(yōu)勢(shì)顯著,并且提取液中毒性吡咯里西啶類生物堿(PAs)含量最少。

3 結(jié)論

通過Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),建立了千里光中酚類和黃酮提取工藝參數(shù)的二次多項(xiàng)式回歸模型。方差分析結(jié)果表明,該模型準(zhǔn)確可靠,可用于千里光綠原酸和金絲桃苷提取得率的預(yù)測(cè)和分析。優(yōu)化得到千里光中綠原酸和金絲桃苷的最佳工藝條件為:填充率27.6%,轉(zhuǎn)速308 r/min,球磨時(shí)間11.5 min,此條件下綠原酸得率為(5.040±0.042) mg/g,金絲桃苷得率為(0.485±0.004) mg/g。與加熱回流提取和水煎提取法相比,機(jī)械球磨提取不但能夠獲得較高得率的綠原酸和金絲桃苷有效成分,還能大大縮減提取時(shí)間,提高提取效率,降低提取物中毒性生物堿殘留量。對(duì)千里光酚類提取物的應(yīng)用開發(fā)具有較大的指導(dǎo)意義。

[1]程剛,夏東勝,李馨齡,等. 千里光的安全性研究現(xiàn)狀及其對(duì)策探討[J]. 中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2004,11(7):569-571.

[2]全國(guó)中草藥匯編編寫組. 全國(guó)中草藥匯編[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1975:112.

[3]胡軍. 千里光屬植物化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J]. 中成藥,2007,29(5):567-571.

[4]李梅,萬遠(yuǎn)芳. 千里光的研究進(jìn)展[J]. 國(guó)際中醫(yī)中藥雜志,2011,33(8):754-757.

[5]程衛(wèi)強(qiáng),隋長(zhǎng)惠,衰久志,等. 羽葉千里光黃酮類成分的研究[J]. 中草藥,1999,30(10):727-730.

[6]曾美怡,李敏民,趙秀文.含吡咯雙烷生物堿中草藥的毒性[J].中藥新藥與臨床藥理,1996,7(3):44.

[7]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典 2010 年版(一部)[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:32.

[8]劉珂.大花千里光中吡咯里西啶生物堿的分離與鑒定[J].中成藥,1996,27(4):203-205.

[9]王雅,趙萍,趙坤,等. 沙米綠原酸提取工藝優(yōu)化及抗氧化性能研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2007,33(10):131-135.

[10]林建原,季麗紅. 響應(yīng)面優(yōu)化銀杏葉中黃酮的提取工藝[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2013,13(2):83-91.

[11]饒建平,王文成,李國(guó)輝. 響應(yīng)面法優(yōu)化咖啡生豆水提綠原酸工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技,2016,31(22):298-333.

[12]王元清,嚴(yán)建業(yè),陳志文. 均勻設(shè)計(jì)優(yōu)選玉米須中總黃酮和多糖的水提工藝[J]. 食品與機(jī)械,2010,26(2):104-107.

[13]劉亞敏,劉玉民,李瓊,等.超聲波輔助提取山銀花綠原酸工藝及其抗氧化性研究[J].食品工業(yè)科技,2014,37(1):186-191.

[14]岳秀潔,李超,扶雄.超聲提取辣木葉黃酮優(yōu)化及其抗氧化活性[J].食品工業(yè)科技,2016,37(1):226-231.

[15]舒孝順,卿婉華,許凱揚(yáng). 微波法輔助提取紅腺忍冬花綠原酸[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(10):250-254.

[16]羅堾子,張弘,鄭華,等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化微波提取密蒙花總黃酮工藝[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2011,11(8):79-87.

[17]張倩,張加余,隋丞琳,等. HPLC-DAD-ESI-MS/MS 研究金銀花水提工藝中綠原酸類成分的變化規(guī)律[J]. 中國(guó)中藥雜志,2012,32(36):3654-3659.

[18]韓賀東,胡海清,林燕,等. 雙花千里光總黃酮的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2013,39(7):232-236.

[19]魏銳,田惠玲,周建軍,等. 響應(yīng)面分析法優(yōu)化杜仲葉中綠原酸水提工藝[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(7):3965-3967.

[20]崔德福. 藥劑學(xué)[M]. 第二版. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2011：95-98.

[21]梁威,宋志釗,文志云.比色法測(cè)定廣西產(chǎn)千里光藥材中吡咯里西啶生物堿的含量[J]. 藥學(xué)研究,2016,35(9):517-519.

Optimization of mechanically assisted extraction of phenolic compounds inSenecioscandensBuch.-Ham. by response surface methodology

YU Jing-bo,WANG Ying-yao,SU Wei-ke*

(Collaborative Innovation Center of Yangtze River Delta Region Green Pharmaceuticals,Zhejiang University of Technology,Huangzhou 310014,China)

Mechanical parameters and extraction parameters were studied by using the yields of chlorogenic acid and hyperoside as indicators,which afforded the optimal mechanically-assisted extraction condition for phenolic compounds fromSenecioScandensBuch.-Ham. by further employing response surface methodology. The results showed that the optimal mechanical parameters were as follows:milling ball filling degree 27.6%,milling speed 308 r/min and milling time 11.5 min,followed by single extraction in water for 10 min to give chlorogenic acid and hyperoside in (5.040±0.042) mg/g and (0.485±0.004) mg/g yield,respectively. Compared with heat reflux extraction and decoction,mechanically-assisted extraction was more efficient for rapid extraction of phenolic compounds at low extraction temperature without using organic solvent. Besides,the yield of hyperoside was increased substantially with obvious decrease of the residual pyrrolizidine in the extracts.

SenecioScandensBuch.-Ham.;phenolic compounds;mechanically-assisted extraction;response surface methodology

2016-12-12

俞靜波(1985-)，女，博士，講師，主要從事藥物綠色制備技術(shù)及機(jī)械化學(xué)反應(yīng)技術(shù)方面的研究，E-mail：yjb@zjut.edu.cn。

*通訊作者:蘇為科(1961-)，男，博士，教授，主要從事綠色制藥技術(shù)方面的研究，E-mail：pharmlab@zjut.edu.cn。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21406201)；2015浙江省博士后科研項(xiàng)目擇優(yōu)資助。

TS201.1

B

1002-0306(2017)10-0257-08

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.041