產(chǎn)L-肉堿的大腸桿菌基因工程改造及生物轉(zhuǎn)化

楊月英，黃嬌芳，史吉平，王紅英

(1.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210; 2.大連工業(yè)大學(xué),遼寧大連 116034;3.上?？萍即髮W(xué),上海 201210)

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產(chǎn)L-肉堿的大腸桿菌基因工程改造及生物轉(zhuǎn)化

楊月英1,2，黃嬌芳1,3,*，史吉平1，王紅英2

(1.中國科學(xué)院上海高等研究院,上海 201210; 2.大連工業(yè)大學(xué),遼寧大連 116034;3.上海科技大學(xué),上海 201210)

L-肉堿在脂肪代謝中起重要的作用,本文構(gòu)建了T7啟動(dòng)子控制下的過表達(dá)質(zhì)粒pET28a-caiBCD和pACYCD-caiF-caiT,并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)(簡寫DE3)中,得到基因工程菌BL21(DE3)/caiBCD+caiF+caiT(簡寫DE3/BCD+F+T)。將此菌株接種到生長培養(yǎng)基中,并用終濃度為1 mmol/L的 IPTG(異丙基硫代半乳糖苷)誘導(dǎo)培養(yǎng),然后收集菌體細(xì)胞加入到含有巴豆甜菜堿鹽酸鹽的轉(zhuǎn)化液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果顯示,IPTG誘導(dǎo) 4 h比誘導(dǎo)10 h后轉(zhuǎn)化得到的L-肉堿量要高,轉(zhuǎn)入了過表達(dá)質(zhì)粒的工程菌DE3/BCD+F+T(7.244 g/L)比野生型DE3(0.5 g/L)提高了15倍。該巴豆甜菜堿鹽酸鹽轉(zhuǎn)化生成L-肉堿的反應(yīng)在2 h后基本達(dá)到穩(wěn)定。

L-肉堿,巴豆甜菜堿,大腸桿菌,生物轉(zhuǎn)化,基因工程

肉堿,即3-羥基-4-三甲基銨丁酸(L-β-Hydroxy-γ-Butyrobetaine),具有L和D兩種異構(gòu)體,其中只有L-肉堿具有參與脂肪氧化的生理功能,特別是在脂肪的β-氧化過程中作為載體將長鏈脂肪酸轉(zhuǎn)入線粒體膜內(nèi)參與脂肪酸的氧化。此外,L-肉堿還具有多種生理功能,具有抗疲勞功能[1];保護(hù)神經(jīng)作用[2],L-肉堿是一種有效的抗氧化劑(自由基清除劑)[3-4];研究報(bào)道L-肉堿具有清除超氧游離子、過氧化氫和螯合過渡金屬離子的能力和對內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)起保護(hù)的作用[5-6];治療先天性神經(jīng)代謝疾病[7]和提高男性精子質(zhì)量[8-9],對延遲患阿爾茨海默癥的病癥也具有重要作用[10],根據(jù)以上多種功能,目前L-肉堿已廣泛應(yīng)用于減肥食品、嬰兒食品、運(yùn)動(dòng)員飲料、動(dòng)物飼料以及藥物方面。

目前L-肉堿的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)合成法、直接提取法、微生物發(fā)酵法和全細(xì)胞粗酶轉(zhuǎn)化法[11]。大多數(shù)微生物細(xì)胞都有能將巴豆甜菜堿、γ-丁基甜菜堿等作為前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為L-肉堿的能力[12]。目前,Arense P和Kmlmlla H等人報(bào)道了大腸桿菌和農(nóng)桿菌分別能將巴豆甜菜堿和γ-丁基甜菜堿轉(zhuǎn)化生成L-肉堿[13-14]。微生物在轉(zhuǎn)化巴豆甜菜堿合成L-肉堿的途徑中起關(guān)鍵作用的酶有:底物輔酶A轉(zhuǎn)移酶、底物輔酶A連接酶、輔酶A水合酶,此外還有轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,這些酶和蛋白分別由基因caiBCD、caiT以及操縱子caiF表達(dá)[13],本文構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-caiBCD和pACYCD-caiF-caiT,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DE3中,利用T7啟動(dòng)子對基因caiBCD、caiF和caiT進(jìn)行過表達(dá)后,發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生型。

1 材料和方法

1. 1 材料與儀器

菌株E.coliBL21(DE3)(F-ompT gal dcm lon hsdSB(r-B m-B)λ(DE3[lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5])和E.coliDH5α(F-endA1 glnV44 thi-1 recA1 relA1 gyrA96 deoR nupG φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169,hsdR17(r-k m+k),λ-) 本實(shí)驗(yàn)室保存;質(zhì)粒:pACYCDuet-1(Clmr,4008 bp)和pET28a(vector carries an N-terminal His Tag,Kanr,5,369 bp) 購自Novagen?公司;pMD18-T simple(Ampr,TA cloning vector,2,692 bp) 購自Takara公司;質(zhì)粒pET-caiBCD(pET28a carries caiBCD,over expression under T7 promoter,Kanr,8.8 kbp)和pACYCD-caiF-caiT(caiF and caiT overexpression under T7 promoter,Clmr,6 kbp) 均有實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;引物caiBCD-F:CAGGCCCAT ATGGATCATCTACCCA TGCC;caiBCD-R:CAGCTCGAGTTAACGTCCTTTCC ACACCG;caiF-F:CACGCCCATATGTGTGAAGGAT ATGTTGAAAAAC caiF-R:CAGCTCGAGTTAACGAC GCATACTCTTTGACAA;caiT-FGGGGAATTCATGAA GAATGAAAAGAGAAAAACGG;caiT-R:GCCAAGCTT TTAATCTTTCCAGTTCTGTTTCGCG 均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成;各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA凝膠回收試劑盒 均購自大連寶生物工程有限公司;酵母粉、蛋白胨 購自O(shè)xoid(英國)公司;其它試劑 均為國產(chǎn)分析純;L-肉堿、乙酰 CoA、肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT) 購自Sigma公司;LB培養(yǎng)基 蛋白胨10 g/L,酵母粉5 g/L,氯化鈉10 g/L,添加1.5%瓊脂為LB固體培養(yǎng)基;生長培養(yǎng)基 蛋白胨12 g/L,酵母粉24 g/L,甘油4 mL/L,KH2PO42.312 g/L,K2HPO4·3H2O 16.37 g/L,富馬酸一鈉12.5 mmol/L,巴豆甜菜堿鹽酸鹽5 mmol/L,pH7.0。

S1000TmThermal Cycler PCR儀 購自USA(Thermo);Gel.Doc.TmXR+電泳成像儀 USA(Bio-RAD);DUR730紫外分光光度計(jì) Germany;NaNoDrop 2000C超微量樣本分光光度計(jì) US/Thermal;PB-10 pH計(jì) 德國賽多利斯。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化液的準(zhǔn)備 轉(zhuǎn)化液由20 g/L巴豆甜菜堿鹽酸鹽溶液和50 mmol/L 的磷酸鉀緩沖液組成,其中巴豆甜菜堿鹽酸鹽溶液用CaCO3調(diào)至pH5.0±0.3,再加入到終濃度為50 mmol/L(pH7.6)的磷酸鉀緩沖液,此時(shí)轉(zhuǎn)化液的pH7.0[15]。

1.2.2 L-肉堿檢測方法 DNTB法檢測,其反應(yīng)原理[16]:

配制左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)母液(0.05 g/mL),然后稀釋五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)濃度0.002、0.005、0.008、0.01和0.015 g/mL。取1 mL配制好的上述標(biāo)本,加入0.1 mol/L HEPES(pH8.0)緩沖液200 μL,加入50 mmol/L EDTA 100 μL,再加入25 μL 10 mmol/L DNTB溶液,最后加入20 μL 12 mmol/L乙酰輔酶A,混勻反應(yīng)3～5 min后,再加入10 μg肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT),用水定容至2 mL,反應(yīng)10 min后在OD412下測定吸光值。根據(jù)以上實(shí)驗(yàn)得出L-肉堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=52.143x+0.0223,R2=0.9997,式中x:L-肉堿濃度,g/L,y:412 nm處吸光值。用同樣方法測定實(shí)驗(yàn)中L-肉堿的量。

1.2.3 構(gòu)建基因工程菌DE3/BCD+F+T

1.2.3.1 pET28a-caiBCD質(zhì)粒的構(gòu)建 大腸桿菌自身體內(nèi)存在caiBCD操縱子,在大腸桿菌W3110基因組上通過PCR擴(kuò)增得到基因片段caiBCD,然后將其克隆到pMD18-T中,測序驗(yàn)證后將pMD18-caiBCD經(jīng)Nde I/XhoI雙酶切后,與同樣經(jīng)Nde I/XhoI雙酶切的載體pET28a DNA片段連接,構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒pET28a-caiBCD。

1.2.3.2 pACYCD-caiF-caiT質(zhì)粒的構(gòu)建 從大腸桿菌W3110基因組擴(kuò)增出基因片段caiF和caiT。然后片段caiF與載體pACYCD DNA經(jīng)Xho I單酶切后在KOD酶的作用下進(jìn)行融合PCR,構(gòu)建得到pACYCD-caiF過表達(dá)質(zhì)粒,再將此質(zhì)粒用HindⅢ/EcoR I雙酶切后與同樣經(jīng)HindⅢ/EcoR I雙酶切后的片段caiT連接,構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒pACYCD-caiF-caiT。

1.2.4 大腸桿菌培養(yǎng)方法與IPTG的誘導(dǎo)條件確定 普通大腸桿菌的培養(yǎng)條件為37 ℃,150～200 r/min的生長環(huán)境,測定生長OD600值(OD600值表示微生物在600 nm波長下的吸光值,其間接反應(yīng)了微生物細(xì)胞的生長在溶液中達(dá)到的濃度值)。IPTG誘導(dǎo)條件:用終濃度為1 mmol/L的IPTG在菌體培養(yǎng)液中進(jìn)行4 h(培養(yǎng)基中糖分物質(zhì)基本消耗完)或10 h(培養(yǎng)基中糖分物質(zhì)已經(jīng)消耗完)誘導(dǎo)培養(yǎng)[17],然后在低溫下收集菌體細(xì)胞,用中性的磷酸緩沖液洗滌2次,得到干凈菌體細(xì)胞,將干凈菌體細(xì)胞加入到轉(zhuǎn)化液中,在30～37 ℃(根據(jù)菌體細(xì)胞生長溫度推測30～37 ℃應(yīng)是其最佳酶活(胞內(nèi)酶)反應(yīng)溫度)振蕩反應(yīng)2～4 h,測定轉(zhuǎn)化液中L-肉堿的生成量[17]。

1.2.5 重組質(zhì)粒在大腸桿菌DE3中的表達(dá)對L-肉堿產(chǎn)量的影響 將質(zhì)粒pET-caiBCD和pACYCD-caiF-caiT分別或同時(shí)轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DE3中得到基因工程菌DE3/BCD+F+T,在1 mL液體LB培養(yǎng)基中活化1 h后,涂布卡那霉素和氯霉素雙抗平板。挑單克隆接到3 mL LB中過夜活化,再按1%轉(zhuǎn)接至含有50 mg/L 卡那霉素(Kan)和30 mg/L 氯霉素(Clm)的液體生長培養(yǎng)基中,通過收集菌體細(xì)胞加入到轉(zhuǎn)化液中測定其生成的L-肉堿量。

1.2.6 基因工程菌轉(zhuǎn)化底物生成L-肉堿的穩(wěn)定性測定 將大腸桿菌工程菌DE3/BCD+F+T和野生型 DE3在生長培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)至OD600達(dá)到10后,再用終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h并收集菌體細(xì)胞,加到含有20 g/L的巴豆甜菜堿的液中進(jìn)行轉(zhuǎn)化,不同時(shí)間段進(jìn)行取樣測定生成的L-肉堿量。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

根據(jù)以上方法得出L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)曲線,見圖1,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=53.123x+0.012,R2=0.9992,其中,x:L-肉堿濃度,g/L;y:OD412吸光值。

圖1 DTNB法繪制L-肉堿的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of L-carnitine in DTNB method

2.2 工程菌DE3/BCD+F+T的構(gòu)建

2.2.1 重組表達(dá)質(zhì)粒pET28a-caiBCD的構(gòu)建 經(jīng)相應(yīng)的酶切酶連法構(gòu)建質(zhì)粒pET28a-caiBCD,構(gòu)建過程如圖2所示。由圖3可知,雙酶切后的凝膠電泳結(jié)果顯示載體大小(5369 bp)和目的片段大小(3759 bp)與預(yù)期值相符,表明重組的質(zhì)粒pET28a-caiBCD構(gòu)建正確。

圖2 重組質(zhì)粒pET28a-caiBCD的構(gòu)建Fig.2 Construction of the plasmid pET28a-caiBCD

圖3 重組質(zhì)粒pET28a-caiBCD經(jīng)NdeI/XhoI雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PET28a-caiBCD digested by NdeI/XhoI注:M為 DNA Mark DL10000;泳帶1和2為酶切過后的質(zhì)粒pET28a-caiBCD。

2.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒pACYCD-caiF-caiT的構(gòu)建 構(gòu)建過程如圖4所示,圖5表示酶切質(zhì)粒pACYCD-caiF的凝膠驗(yàn)證圖,結(jié)果與預(yù)期值(4404 bp)相符,表明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。再用相應(yīng)的酶雙切和連接后構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒pACYCD-caiF-caiT,過程如圖4所示,圖6表示用HindⅢ酶切重組質(zhì)粒與對照質(zhì)粒的凝膠電泳圖,重組質(zhì)粒大小為5894 bp與所預(yù)期得值相符,表明重組質(zhì)粒pACYCD-caiF-caiT也構(gòu)建正確。

圖4 重組質(zhì)粒pACYCD-caiF-caiT的構(gòu)建Fig.4 Construction of the plasmid of pACYCD-caiF-caiT

圖5 通過融合PCR得到重組質(zhì)粒pACYCD-caiF用XhoI酶切后的瓊脂糖凝膠電泳Fig.5 Agarose gel electrophoresis of pACYCD-caiF digested by XhoI注:M為DNA Mark DL10000;泳帶1表示用XhoI 酶切后的質(zhì)粒pACYCD-caiF的條帶;泳帶2表示用XhoI 酶切后的質(zhì)粒pACYCD-1。

圖6 重組質(zhì)粒pACYCD-caiF-caiT經(jīng)HindⅢ/EcoRI雙酶切的瓊脂糖凝膠電泳Fig.6 Agarose gel electrophoresis of pACYCD-caiF-caiT digested by HimdⅢ/EcoRI注:M表示DNA Mark DL10000;泳帶1表示HindⅢ酶切后的質(zhì)粒pACYCD-caiF條帶;泳帶2表示HindⅢ酶切后的質(zhì)粒pACYCD-caiF-caiT。

2.3 大腸桿菌培養(yǎng)方法與IPTG的誘導(dǎo)條件確定

2.3.1 不同IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對產(chǎn)L-肉堿量的影響 如圖7所示,基因工程菌DE3/BCD+F+T加IPTG誘導(dǎo)4 h的L-肉堿的產(chǎn)量高于誘導(dǎo)10 h的表達(dá)量。

圖7 大腸桿菌分別加IPTG誘導(dǎo)4 h和10 h后產(chǎn)L-肉堿的量Fig.7 L-carnitine production in wt and recombinant strain after 4 h and 10 h induction with IPTG

2.3.2 重組質(zhì)粒在大腸桿菌DE3中的表達(dá)對L-肉堿產(chǎn)量的影響 大腸桿菌DE3/BCD+F+T、DE3/BCD和野生型DE3三種菌分別培養(yǎng)、收集后進(jìn)行轉(zhuǎn)化。結(jié)果如圖8所示,在大腸桿菌DE3中過表達(dá)了基因caiBCD后的工程菌產(chǎn)L-肉堿的量大于野生型,同時(shí)過表達(dá)了caiBCD和caiFcaiT的工程菌產(chǎn)量大于只過表達(dá)了基因caiBCD的菌株。

圖8 不同菌株產(chǎn)L-肉堿的量Fig.8 L-carnitine production by different strains

2.3.3 基因工程菌轉(zhuǎn)化底物生成L-肉堿的穩(wěn)定性測定 如圖9所示,當(dāng)轉(zhuǎn)化相同的底物時(shí),工程菌DE3/BCD+F+T產(chǎn)L-肉堿量在7 g/L以上,遠(yuǎn)大于野生型DE3(0.5 g/L)。此外,工程菌在1 h后達(dá)到穩(wěn)定后的產(chǎn)量為7.244 g/L,且穩(wěn)定不變。摩爾轉(zhuǎn)化率(L-肉堿摩爾數(shù)與底物巴豆甜菜堿摩爾數(shù)之比)為41%。

圖9 大腸桿菌野生型和工程菌產(chǎn)L-肉堿量Fig.9 L-carnitine production by wild-type strain and recombinant strain

3 結(jié)論

L-肉堿在脂肪氧化過程中起重要的載體作用,對神經(jīng)類疾病具有良好的預(yù)防作用,并且有一定的抗氧化作用。目前L-肉堿的巨大市場需求對其生產(chǎn)方法和技術(shù)提出了更高的要求,許多研究者都在探索除化學(xué)合成法之外更先進(jìn)、安全、高效的方法。本實(shí)驗(yàn)通過對大腸桿菌DE3體內(nèi)相關(guān)L-肉堿合成的基因進(jìn)行改造后得到大腸桿菌工程菌DE3/BCD+F+T,當(dāng)菌體生長到一定密度時(shí)加IPTG誘導(dǎo),能調(diào)控菌株產(chǎn)生與L-肉堿相關(guān)的酶然后進(jìn)行全細(xì)胞催化底物生產(chǎn)L-肉堿。相比野生菌(L-肉堿的產(chǎn)量不到0.5 g/L)構(gòu)建的工程菌DE3/BCD+F+T產(chǎn)量提高了(15倍)。然而由于巴豆甜菜堿轉(zhuǎn)化成L-肉堿是一個(gè)可逆反應(yīng)的過程,其在轉(zhuǎn)化2 h后就基本達(dá)到穩(wěn)定不反應(yīng)的狀態(tài)。因此,下一步實(shí)驗(yàn)要?jiǎng)?wù)則是移除產(chǎn)物使反應(yīng)繼續(xù)向生成L-肉堿生成方向移動(dòng),以進(jìn)一步提高產(chǎn)量。

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Genetically engineeringEscherichiacolistrain and its optimized bioconversion for L-carnitine production

YANG Yue-ying1,2,HUANG Jiao-fang1,3,*,SHI Ji-ping1,WANG Hong-ying2

(1.Shanghai Advanced Research Institute,Shanghai 201210,China; 2.Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China; 3.Shanghai Tech University,Shanghai 201210,China)

L-carnitine plays an important role in fatty acids metabolism. Here a recombinant L-carnitine production strain had been constructed carrying two expression plasmids,pET28a-caiBCD and pACYCD-caiF-caiT,under the control of T7 promoter. This strain was genetically stable and can programmably produce L-carnitine with IPTG induction. 1 mmol/L IPTG was added to induce enzymes expression,after 4 hours induction,cells were collected for the bioconversion of crotonobetaine to L-carnitine. Compared with wild-type strain,the conversion amount of recombinant strain was increased by 15 times. And it took about two hours for the conversion of crotonobetaine to L-carnitine.

L-carnitine;crotonobetaine;Escherichiacoli;bioconversion;biological engineering

2016-11-04

楊月英(1989-)，女，碩士研究生，研究方向：微生物基因工程，E-mail：qhyyy0323@163.com

*通訊作者:黃嬌芳(1982-)，女，博士，助理研究員，研究方向：微生物基因工程，E-mail：huangjf@shanghaitech.edu.cn。

國家自然科學(xué)基金 (31400042)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)10-0163-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.10.023