微生物發(fā)酵法制備鐵皮石斛多糖及抗氧化活性的研究

安全++許丹妮++李光敏++王連春++李萌++蘇寧++王昌濤

摘要：采用微生物發(fā)酵法提取鐵皮石斛中的多糖，探討料液比和pH對多糖提取率的影響，并評價多糖的體外抗氧化活性。2因素3水平正交法優(yōu)化的鐵皮石斛多糖提取，料液比為1∶90（g/mL），pH為5，在此條件下的多糖提取率為42.86%；探究微生物發(fā)酵鐵皮石斛多糖對羥自由基和DPPH自由基的清除作用，結(jié)果顯示，微生物發(fā)酵法制備的鐵皮石斛粗多糖具有一定的抗氧化性，且自由基清除率在一定范圍內(nèi)隨濃度增加而增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；多糖；微生物發(fā)酵；抗氧化活性

中圖分類號：S567.23+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）10-1934-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.10.033

Study on the Extraction and Antioxidant Activity of Dendrobium candidum Polysaccharides Obtained by Microbial Fermentation

AN Quan1，XU Dan-ni2，LI Guang-min2，WANG Lian-chun2，LI Meng2，SU Ning3，WANG Chang-tao2

（1. Yunnan Baiyao Group Co.， Ltd.， Kunming 650504，China； 2. Beijing Industry and Commerce University Faculty of Science/Beijing Municipal Key Laboratory of Plant Resources Research and Development， Beijing 100048，China； 3. Cosmetics Technology Center of China Inspection and Quarantine Institution， Beijing 100176，China）

Abstract： Using microbial fermentation method to extract polysaccharides from Dendrobium candidum，solid-liquid ratio and fermentation pH were selected as single factors for polysaccharides extraction，and to evaluate the antioxidant activity of polysaccharides in vitro. The optimum conditions obtained by two factors and three levels orthogonal method of Dendrobium candidum polysaccharides extraction were as follows：the solid-liquid ratio was 1∶90，the pH value was 5，the polysaccharides extraction ratio in this condition was 42.86%；experiments were operated on scavenging the hydroxyl radical，DPPH radical and superoxide anion radical of the polysaccharides extract by microbial fermentation， results showed that crude Dendrobium candidum polysaccharides had certain antioxidant activity and the antioxidant activity showed dose-effect relationship at selected concentrations.

Key words： Dendrobium candidum； polysaccharides； microbial fermentation； antioxidant activity

石斛是中國傳統(tǒng)名貴藥材，有較好的藥用價值。鐵皮石斛為其中之極品，為蘭科石斛屬附生草本植物類[1]。鐵皮石斛中含有的主要活性成分為石斛多糖、石斛堿、氨基酸、芪類及其衍生物以及多種揮發(fā)性成分，多糖是其最主要的有效成分，具有增強(qiáng)免疫、抗疲勞、抗氧化、降血壓、降血糖、抗腫瘤等作用[2-4]，在化妝品原料開發(fā)中具有很好的應(yīng)用前景[5]。石斛多糖是鐵皮石斛中最重要的有效成分。提取鐵皮石斛多糖有酶提法、酸提法、堿提法、水提法、超聲提取等方法[6-8]。本試驗采用微生物發(fā)酵法研究鐵皮石斛多糖的最佳提取條件。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

鐵皮石斛，浙江義烏鮮禾有限公司；乳酸菌，北京川秀科技有限公司；氫氧化鈉、鹽酸、苯酚、濃硫酸、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸、DPPH、無水乙醇、抗壞血酸、弱堿性（Tris-HCL）緩沖液、鄰苯三酚、D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

DHG-9030A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TB-214分析天平，北京富?？萍加邢薰?；RJ-TDL-5A低速臺式大容量離心機(jī)；LDZX-50FBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；PHS-3CpH計；UVmini-1240紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司；YT-CJ-IND超凈工作臺，北京亞泰科技儀器技術(shù)公司。

1.3 鐵皮石斛多糖提取與測定

1）材料預(yù)處理。將鐵皮石斛樣品洗凈、晾干，切成1～2 cm長的細(xì)段，于60 ℃的烘箱中烘干至恒重。粉碎，過40目分子篩，備用。

2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確稱取無水葡萄糖0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g加水溶解，于10 mL容量瓶中定容，吸取1 mL各濃度葡萄糖溶液，加入1 mL 5%苯酚溶液，搖勻，加入5 mL濃硫酸，搖勻。5 min后封管，置沸水浴中1 h，取出，冷卻至室溫，用去離子水代替待測液做空白對照，于490 nm下測其吸光度，以濃度為縱坐標(biāo)，吸光度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）生物轉(zhuǎn)化法提取鐵皮石斛多糖工藝流程。準(zhǔn)確稱取一定量的鐵皮石斛于錐形瓶中，置于高溫滅菌鍋中滅菌25 min，于超凈臺內(nèi)按照1∶100用量添加乳酸菌，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，滅菌，待其冷卻至室溫，進(jìn)行汁渣分離，棄沉淀，得多糖粗提液。從上述粗提液中，取2 mL于離心管中，加入10 mL無水乙醇。冷藏靜置1 h，離心10 min，棄上清液。沉淀以80%乙醇溶液洗滌2次，棄上清液，加水溶解，定容至50 mL，得鐵皮石斛多糖溶液。

4）鐵皮石斛多糖含量的測定（苯酚-硫酸法）。吸取待測液2 mL，另取2 mL去離子水做空白對照，于具塞試管中分別依次添加1.0 mL 5%苯酚溶液，混勻后加入5.0 mL濃硫酸，再次混勻，5 min后封管沸水浴1 h。取出后冷卻至室溫，在490 nm處測吸光度。

1.4 鐵皮石斛多糖抗氧化性的測定

1）對羥自由基清除作用的測定（水楊酸法）。在25 mL比色管中加入2 mmol/L FeSO4 3 mL、 1 mmol/L H2O2 3 mL，搖勻；其中H2O2最后加入并啟動整個反應(yīng)。接著加入6 mmol/L水楊酸3 mL，搖勻；于37 ℃水浴加熱15 min后取出，測其吸光度（A0）；然后分別加入一定濃度的待測液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL；再分別加入蒸餾水0.8、0.6、0.4、0.2、0.0 mL，搖勻，繼續(xù)水浴加熱15 min，取出測其吸光度（AX）。為消除后加的共1.0 mL待測液和蒸餾水所造成的體系吸光度的降低，方法同上，恒溫15 min后測其吸光度（A00），加入1 mL蒸餾水，搖勻后再測一次吸光度（AXX），即A降低=A00-AXX。

羥自由基清除率=[（A0-AX-A降低）/A0]×100%

2）對DPPH自由基清除作用的測定（DPPH法）。取等體積的待測液與2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻（A1）；取等體積的無水乙醇（待測物溶劑）與2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻（A2）；取等體積的無水乙醇與待測液混勻（A3）；反應(yīng)30 min后，在517 nm下測A1、A2、A3管吸光度。

DPPH自由基清除率=[（A2+A3）-A1]/A2×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用紫外-分光光度法測葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品不同濃度下的吸光度，由葡萄糖吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程y=0.100 2x-0.005，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，表明0.2～1.0 mg/mL葡萄糖濃度與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.2 生物轉(zhuǎn)化法中單因素對鐵皮石斛多糖提取率的影響

2.2.1 料液比對多糖提取率的影響 選用乳酸菌為發(fā)酵菌種，調(diào)節(jié)pH至5.6，設(shè)置料液比為1∶60、1∶70、1∶80、1∶90、1∶100（g/mL，下同）共5個梯度，3個平行組。由圖2可知，隨著料液比中石斛樣品的增加，多糖提取率上升。故取料液比1∶80、1∶90、1∶100做后續(xù)正交試驗。

2.2.2 pH對多糖提取率的影響 以乳酸菌為發(fā)酵菌種，料液比為1∶100，設(shè)置pH為3、4、5、6、7共5個梯度，3個平行組。由圖3可知，pH為3時多糖提取液出現(xiàn)明顯沉淀物，影響試驗結(jié)果，故作為誤差點(diǎn)舍去。隨著pH的增加，多糖提取率上升。故取pH為5、6、7作為后續(xù)探究試驗的條件。

2.2.3 探究生物轉(zhuǎn)化法提取鐵皮石斛多糖最佳工藝條件 以微生物發(fā)酵鐵皮石斛單因素試驗結(jié)果為依據(jù)，以料液比（A）、pH（B）為考察因素，以鐵皮石斛多糖提取率為考察指標(biāo)，根據(jù)正交試驗設(shè)計（表1）進(jìn)行L9（32）試驗，按照表1中的因素設(shè)計并進(jìn)行正交試驗，結(jié)果見表2、表3。

由表2、表3可知，通過比較極差大小R值可以看出對鐵皮石斛多糖提取率的影響因素A>B，即料液比對提取率影響大于pH。各因素最佳提取工藝為A2B1，即料液比為1∶90、pH為5，此條件下多糖得率為42.86%。

2.3 鐵皮石斛抗氧化性結(jié)果分析

2.3.1 對羥自由基的清除作用 由圖4可知，鐵皮石斛多糖對羥自由基具有清除作用，且隨濃度的增加，清除率趨近向直線式增長，表現(xiàn)出一定的抗氧化性功效。

2.3.2 對DPPH自由基的清除作用 由圖5可知，微生物發(fā)酵法制備的鐵皮石斛多糖對DPPH自由基的清除作用明顯，且清除率隨濃度的增加而增強(qiáng)，具有較好的抗氧化能力。

3 結(jié)論

本試驗通過探究微生物發(fā)酵法提取鐵皮石斛多糖最佳工藝條件并研究鐵皮石斛生物粗多糖抗氧化活性得出結(jié)論，在料液比為1∶90，pH為5時，生物轉(zhuǎn)化法提取鐵皮石斛多糖最高提取率為42.86%；鐵皮石斛多糖表現(xiàn)出一定的抗氧化活性，對羥自由基和DPPH自由基均有一定的清除作用。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 娟，李順祥，黃 丹，等.鐵皮石斛資源、化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].科技導(dǎo)報，2011，29（18）：74-79.

[2] 劉靜平，朱先紅，賈景明.正交試驗優(yōu)選鐵皮石斛類原球莖多糖的提取純化工藝[J].中國藥房，2011，22（15）：1378-1380.

[3] 包英華.鐵皮石斛種質(zhì)資源的鑒定與評價研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[4] 呂圭源，顏美秋，陳素紅，等.鐵皮石斛功效相關(guān)藥理作用研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)藥雜志，2013，38（4）：489-493.

[5] 陳 默，孫 懿，趙 亞，等.鐵皮石斛提取物保濕性能研究[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2015，29（6）：70-73.

[6] 黃曉君，聶少平，王玉婷，等.鐵皮石斛多糖提取工藝優(yōu)化及其成分分析[J].食品科學(xué)，2013，34（22）：21-26.

[7] 王建明，古 力，康智明，等.鐵皮石斛多糖的提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013（12）：143-148.

[8] 尚喜雨.水提法·酶法提取鐵皮石斛多糖的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（18）：9787-9788.