張 婧,鄒玉安,董曉華,馬 飛,王歡歡,劉東艷,郭 姮
(1.河北北方學院,河北 張家口 075000;2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 張家口 075000;3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院檢驗科,北京 10070)
缺血預(yù)處理降低腦缺血再灌注損傷及TLR4、TNF-α mRNA的表達
張 婧1,鄒玉安2,董曉華1,馬 飛1,王歡歡1,劉東艷3,郭 姮3
(1.河北北方學院,河北 張家口 075000;2.河北北方學院附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,河北 張家口 075000;3.北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院檢驗科,北京 10070)
目的 觀察Toll樣受體4(TLR4)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)的表達變化,探討缺血預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用。方法 36只SPF級健康雄性SD大鼠隨機分為缺血預(yù)處理組(CIP組)、缺血再灌注組(I/R組)和假手術(shù)組(Sham組)各12只;I/R組采用線栓法阻斷大腦中動脈(MCAO)2 h建立模型,CIP組先給予MCAO阻斷10 min,再灌注72 h后給予與I/R組相同的處理,假手術(shù)組僅分離血管。均于術(shù)后1 d取材,TTC染色法檢測腦梗死體積,Zea Longa評分標準對神經(jīng)功能評分,熒光實時定量PCR(Real-time Quantitative polymerase chain reaction)法測定TLR4和TNF-α mRNA表達水平。結(jié)果 缺血再灌注1 d后,CIP組大鼠腦梗死體積、神經(jīng)功能缺損評分明顯低于I/R組,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05);TLR4、TNF-α mRNA CIP組與I/R組表達水平明顯高于Sham組,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01),CIP組表達水平明顯低于I/R組(P<0.05)。結(jié)論 缺血預(yù)處理能改善由再灌注損傷引起的腦損傷與功能障礙,可能與下調(diào)促炎因子的表達、減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。
大鼠;缺血預(yù)處理;缺血再灌注損傷;Toll樣受體4;腫瘤壞死因子-α
腦缺血預(yù)處理(cerebral ischemic preconditioning,CIP)能夠減輕缺血再灌注對腦組織造成的損傷,是一種強有力的內(nèi)源性神經(jīng)保護機制[1]。炎癥反應(yīng)在再灌注損傷這一動態(tài)過程中起著關(guān)鍵性作用,減輕炎癥反應(yīng)是治療缺血性腦血管病的重要環(huán)節(jié)[2-3]。腦缺血預(yù)處理對腦組織有保護作用,但機制尚未完全闡明。炎癥的作用機制及信號通路極其復雜,本研究通過建立大鼠局灶性腦缺血預(yù)處理模型,采用實時熒光定量PCR法,探討了Toll樣受體4(Toll-like receptors,TLR4)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)在腦缺血預(yù)處理中的生物學作用與調(diào)控機制。
1.1 材料與試劑
清潔級健康雄性Sprague Dawley大鼠36只,3~4月齡,體質(zhì)量(250±30)g,購于北京華阜康生物科技股份有限公司,實驗動物許可證:SCXK(京)2014-0004,合格證號:NO11401300034129。
RNAiso Plus試劑(TaKaRa,Japan)、DL2000 DNA Ladder(北京索萊寶科技有限公司)、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(Amresco,美國)、PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa,Japan)、DEPC水、SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa,Japan)、引物及內(nèi)參序列合成(寶生物工程大連有限公司)。
1.2 方法
1.2.1 實驗動物分組 36只SD大鼠于屏障動物實驗室適應(yīng)性飼養(yǎng)觀察1周,術(shù)前禁食12 h,可自由飲水。隨機分為缺血預(yù)處理組(CIP組)、缺血再灌注組(I/R組)和假手術(shù)組(Sham組)各12只,每組隨機選取6只用于腦梗死體積測定。
1.2.2 模型建立 采用改良Zea Longa法制備大鼠MCAO模型。CIP組:采用大腦中動脈二次線栓法[4]制備缺血預(yù)處理模型,10%水合氯醛(350 mg·kg-1)大鼠腹腔注射,麻醉成功后仰臥位固定,頸部剃毛,常規(guī)碘伏消毒,取頸正中縱向切口,鈍性分離右頸總動脈、右頸內(nèi)動脈、右頸外動脈及迷走神經(jīng),右頸總動脈下方穿一根引線,結(jié)扎右頸外動脈并離斷為近心端及遠心端,動脈夾夾閉頸總動脈,在頸內(nèi)動脈上打一活結(jié)暫時阻斷血流,在右頸外動脈近心端距頸總動脈分叉4~5 mm處用眼科剪剪一約0.2 mm小口,將頸外動脈近心端拉至與頸內(nèi)動脈成一條直線,將直徑0.26 mm尼龍栓線通過上述小口緩慢插入右頸外動脈,經(jīng)右頸總動脈分叉處進入右頸內(nèi)動脈,插入深度約18 mm,稍感阻力時停止,以免阻塞大腦前動脈。將右頸外動脈近心端及栓線一并結(jié)扎,小心松開右頸內(nèi)動脈處的活結(jié)及動脈夾,10 min后輕輕將尼龍栓線拔出至右頸外動脈斷端,完成缺血預(yù)處理??p合切口,給予抗生素預(yù)防性處理。術(shù)后3 d相同時間點再次向右頸內(nèi)動脈插入尼龍栓線,2 h后輕輕拔出尼龍栓線,將右頸外動脈近心端及尼龍栓線一并結(jié)扎,切口消毒縫合。I/R組:僅向右頸內(nèi)動脈插入尼龍栓線2 h后輕輕拔出尼龍栓線,具體操作步驟見CIP組。Sham組僅分離頸總動脈,不給予栓塞處理。
1.2.3 腦梗死體積測定方法 再灌注1 d后,CIP組、I/R組及Sham組各取6只大鼠,深度麻醉后迅速斷頭取腦,立即在-20 ℃冰箱冷凍約15~20 min,切除額極及枕極,放入冠狀位腦切片模具中,切成5片厚度均勻的腦片,置于2% TTC磷酸鹽緩沖溶液中,37 ℃水浴箱避光孵育30 min,4%多聚甲醛中4 ℃固定24 h。染色后腦組織非梗死區(qū)為紅色,梗死區(qū)為白色,數(shù)碼相機拍照后采用圖像分析腦梗死體積。
1.2.4 神經(jīng)功能行為缺陷評分/神經(jīng)功能學評價方法 按照Zea Longa 5級評分標準[5]采取雙盲法進行評分,評分標準:0分:未觀察到神經(jīng)功能缺損癥狀;1分:不能完全伸展左前肢(輕度局灶性神經(jīng)功能缺損);2分:向左側(cè)轉(zhuǎn)圈,出現(xiàn)追尾現(xiàn)象(中度神經(jīng)功能缺損);3分:行走時向左側(cè)傾倒或打滾(重度神經(jīng)功能缺損);4分:不能自發(fā)行走,重度意識障礙。1~3分者為手術(shù)成功,0分和4分均剔除。
1.2.5 大鼠大腦皮層TLR4和TNF-α mRNA表達檢測方法 采用SYBR?GREENⅠ熒光嵌合實時熒光定量PCR法檢測大鼠大腦皮層TLR4和TNF-α mRNA的表達。分別于術(shù)后1 d斷頭處死動物,快速分離并取出右側(cè)大腦皮層,約100 mg,Triozl法提取總RNA,紫外分光光度計測定A260/A280比值、RNA濃度值,1%瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整性,并對總RNA進行去gDNA純化處理。引物合成:TLR4上游:GCCGGAAAGTTATTGTGGTGGT,下游:ATGGGTTTTAGGCGCAGAGTTT;TNF-α上游:ACCGCAGAA AGAAGCCGTGG,下游:TGCCCCGCTTACAGTTCCTC;內(nèi)參(β-actin)上游:GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA,下游:GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG。反應(yīng)體系均為20 μL,其中SYBR Premix Ex Taq II 10 μL,上下游引物各0.8 μL,ROX Reference Dye 0.4 μL,cDNA 2μL,加RNase Free水至20 μL,反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 31 s,40個循環(huán)。目的基因與β-actin基因同時進行Real-time PCR反應(yīng),每個樣本均設(shè)3個平行對照反應(yīng)孔,對所得CT值取均值,并通過分析溶解曲線,排除非特異擴增。TLR4和TNF-α mRNA相對表達量的計算方法采用相對定量2-△△CT法[6]。
1.3 統(tǒng)計學方法
2.1 腦梗死體積測定
再灌注后1 d的大鼠,Sham組未見梗死灶,CIP組與I/R組均出現(xiàn)白色不規(guī)則梗死灶,腦梗死體積分別為(19.04±1.65)mm3和(34.55±4.78)mm3。I/R組腦梗死體積高于Sham組(P<0.01);CIP組腦梗死體積與I/R組比較顯著減小(P<0.05)(見圖1)。
2.2 神經(jīng)功能學評價
術(shù)后1 d評價神經(jīng)功能行為缺陷,Sham組大鼠無神經(jīng)功能障礙,評分為0分;CIP組與I/R組大鼠均出現(xiàn)不同程度的手術(shù)對側(cè)肢體癱瘓,CIP組神經(jīng)功能評分(1.8±0.4)低于I/R組(2.8±0.4),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。
2.3 大鼠大腦皮層TLR4、TNF-α mRNA的表達
圖1 腦梗死體積比較
TLR4TNF?α Sham組4 68±0 203 71±0 14 IR組7 19±0 07?8 45±0 32?? CIP組6 87±0 16?△5 26±0 09??△
注:與sham組比較*P<0.05,**P<0.01;與I/R組比較△P<0.05。
CIP組與I/R組TLR4、TNF-α mRNA表達水平明顯高于Sham組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,P<0.01);CIP組表達水平明顯低于I/R組(P<0.05)。
近年來,對于缺血預(yù)處理對腦缺血再灌注損傷的保護作用已有一定程度的認識[7]。急性腦梗死在時間窗(發(fā)病后3~4.5 h)內(nèi)給予藥物溶栓或者急診機械取栓是治療腦梗死的有效治療方案[8],而再灌注損傷作為一種應(yīng)激狀態(tài),本身可導致細胞壞死及組織的不可逆損傷,是腦缺血的惡性延續(xù),炎癥反應(yīng)在這一過程發(fā)揮的作用近年來關(guān)注較多[8]。研究發(fā)現(xiàn),TLR4參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)病過程,且發(fā)揮著重要作用,TLR4/核因子κB信號傳導通路的激活,可導致其下游炎癥細胞因子表達上調(diào)[9]。TNF-α作為重要的初級炎癥因子之一,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞中表達,可激活中性粒細胞并使其聚集于缺血腦組織,激發(fā)炎癥級聯(lián)反應(yīng),還可直接損傷血管內(nèi)皮細胞及毛細血管,改變其通透性,加重腦組織水腫[10-12]。因此減輕炎癥反應(yīng)已成為缺血性腦血管病治療的重要組成部分。
本實驗在成功制備大鼠MCAO模型的基礎(chǔ)上,采用了實時定量PCR技術(shù),通過檢測熒光信號,可快速對目的基因及內(nèi)參基因進行定量分析,較半定量PCR技術(shù)更為精準。本研究發(fā)現(xiàn)TLR4、TNF-α mRNA在CIP組與I/R組的表達水平明顯高于Sham組,而二者在CIP組的表達水平明顯低于I/R組,提示TLR4和TNF-α與再灌注損傷關(guān)系密切,缺血預(yù)處理可能通過下調(diào)促炎因子的表達減輕腦組織缺血再灌注損傷,從而減輕炎癥反應(yīng)。
綜上,缺血預(yù)處理能改善由再灌注損傷引起的功能障礙,可能通過下調(diào)TLR4和TNF-α的表達從而起到腦保護作用。然而缺血預(yù)處理的相關(guān)機制及通路之間關(guān)系復雜,調(diào)控二者表達的確切機制仍待進一步研究。
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[責任編輯:李薊龍 英文編輯:劉彥哲]
Alleviation of Ischemic Preconditioning on Ischemia-Reperfusion Injury and Expressions of TLR4 and TNF-α mRNA
ZHANG Jing1,ZOU Yu-an2,DONG Xiao-hua1,MA Fei1,WANG Huan-huan1,LIU Dong-yan3,GUO Heng3
(1.Graduate School,Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China;2.Department of Neurology,The First Affiliated Hospital of Hebei North University,Zhangjiakou,Hebei 075000,China;3.Department of Laboratory Medicine,Dongzhimen Hospital of Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100700,China)
Objective To explore the protection of cerebral ischemic preconditioning on ischemia-reperfusion injury by observing the expression changes of TLR4 and TNF-α in cerebral cortex of rats.Methods 36 SPF healthy male SD rats were randomized into three groups:cerebral ischemic preconditioning group(CIP group,n=12),ischemia-reperfusion group(I/R group,n=12),and sham group(Sham group,n=12).The I/R group were subjected to 2 hours of right middle cerebral artery occlusion(MCAO) with suture-occluded method to establish focal cerebral ischemia-reperfusion injury model.The CIP group were given ten-minute suture-occluded MCAO,then the same treatment as the I/R group 72 hours after reperfusion.The Sham group were only given the carotid artery separation.On one day after surgery,the animals were sacrificed.The infarction volume was evaluated by the method of TTC staining,the neural behavioral score were measured by Zea Longa assessment criteria and the expression levels of TLR4 and TNF-α mRNA were assessed by the method of real-time quantitative PCR(polymerase chain reaction).Results On one day after ischemia,the infarct volume and neural behavioral scores of the CIP group were lower than those of the I/R group,with statistically significant difference(P<0.05).The mRNA expression of TLR4 and TNF-α in the CIP group and the I/R group were both significantly higher than those of the sham group(P<0.05,P<0.01),and the expressions of both in the CIP group were significantly lower than those of the I/R group(P<0.05).Conclusion Cerebral ischemic preconditioning can ameliorate the dysfunction produced by ischemia-reperfusion injury,which may be associated with down-regulated expression of proinflammatory factors and alleviate inflammatory response.
rat;ischemic preconditioning;ischemia-reperfusion injury;Toll-like receptors 4;tumor necrosis factor-α
河北省醫(yī)學科學研究重點課題計劃(No.20150054);河北省高等學校科學技術(shù)研究重點項目(No.ZD2014065)
張婧(1989-),女,河北北方學院2014級碩士研究生,主要從事缺血性腦血管病方向研究。
鄒玉安(1957-),男,主任醫(yī)師,碩士生導師。
R 541
A
10.3969/j.issn.1673-1492.2017.04.002
來稿日期:2016-08-29