十八碳烯酸對人MGC-803細胞毒性作用機制研究

俞發(fā)榮，楊 博，連秀珍，謝明仁，李登樓，張詩爽，陳望軍，郭蘊萱

(甘肅省證據(jù)科學技術研究與應用重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

◇研究簡報◇

十八碳烯酸對人MGC-803細胞毒性作用機制研究

俞發(fā)榮，楊 博，連秀珍，謝明仁，李登樓，張詩爽，陳望軍，郭蘊萱

(甘肅省證據(jù)科學技術研究與應用重點實驗室， 甘肅 蘭州 730070)

人類與癌癥的斗爭已兩千多年，至今已取得了突破性的進展。但是，癌癥的危害仍未得到充分遏制。癌癥不僅發(fā)病率、死亡率上升迅猛，而且發(fā)病年齡明顯降低。癌癥已由死因的第3位升至第1位，超過了腦血管病和心臟病，成為人類的“第一殺手”。尋找有效的抗癌癥藥物與方法, 徹底攻克癌癥, 已成為無數(shù)科學家和臨床醫(yī)生夢寐以求的理想。從2002年開始至今，我們與美國佛羅里達大學生物技術研究中心合作，在前期研究的基礎上，通過改進實驗條件和方法，將甘肅貓兒眼(甘遂Euphorbiaceae:Euphorbiakansui)提取分離出十八碳烯酸，給予人胃癌細胞，研究對腫瘤細胞增殖的抑制作用及其機制，為甘肅貓兒眼的進一步研究開發(fā)和臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑和儀器 十八碳烯酸:由蘭州大學化工學院天然植物研究所從甘肅天水產的貓兒眼提取分離制得，其組分由中國科學院蘭州化學物理研究所采用GC-MS(HP6890/5973)分離，鑒定為十八碳烯酸(octadecenoic acid)，分子式：C18H32O2，分子質量：280.43，純度:98.13%,為無色透明液體。實驗時，用二甲基亞砜(DMSO)助溶加RPMI 1640培養(yǎng)液配制成所需濃度(DMSO含量為30 μl·L-1)；5-氟尿嘧啶(5-FU)：上海旭東海普藥業(yè)有限公司生產，批號20150409. RPMI 1640：Grand Island N.Y.14072 USA； 胎牛血清：中美合資蘭州民海生物工程有限公司生產，批號：20150603； 噻唑藍(MTT)：上海生工生物工程技術服務有限公司提供；酶聯(lián)免疫檢測儀：購于上海雷勃分析儀器有限公司(MULTISKAN MK3)；流式細胞儀：Coulter EPICS XL型，USA； 96孔板：Costar 3599，Corning，NY14831，USA。

1.2 細胞系 人胃癌細胞系，由甘肅省醫(yī)學科學研究院藥理毒理實驗中心惠贈。全部實驗在甘肅省證據(jù)科學技術研究與應用重點實驗室完成。

1.3 人胃癌細胞培養(yǎng) 將復蘇的人胃癌細胞置于內含10%的胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，5%CO2，37℃，飽和濕度條件中傳代培養(yǎng)。

1.4 十八碳烯酸對人胃癌細胞毒性作用實驗 取人胃癌細胞濃度為2×107個·L-1，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔90 μL。十八碳烯酸：設3個濃度(0.2、0.4、0.8 mg·L-1，PBS液配制)，每孔加10 μL；5-FU組：每孔加5-FU(10 mg·L-1，PBS液配制)10 μL；對照組加等量PBS液。各設4個重復孔。置5%CO2孵育箱中37℃，飽和濕度條件培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)6、12、18、24和48 h各取1板加0.4%臺盼藍每孔10 μL，用血球計數(shù)板在光鏡下計活細胞數(shù)，取平均值，以時間為橫坐標，活細胞數(shù)為縱坐標作圖。

1.5 十八碳烯酸對人胃癌細胞增殖的影響 將人胃癌細胞置于內含10%的胎牛血清、2 mmol·L-1谷氨酰胺、1×105U·L-1青霉素、1×105U·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液，5%CO2，37℃，飽和濕度條件中培養(yǎng)。當細胞增殖生長到對數(shù)期，取培養(yǎng)細胞以2×107個·L-1的密度分別接種于96孔板，其中每孔加RPMI1640培養(yǎng)液180 μL。給藥組：設3個濃度(0.2、0.4、0.8 mg·L-1，PBS液配制)，每孔加藥20 μL；5-FU組：每孔加5-FU(10 mg·L-1，PBS液配制)20 μL；對照組加等量PBS液。每組4個重復孔。培養(yǎng)48 h后，加MTT(5 g·L-1，PBS液配制)每孔10 μL，孵育4 h，每孔加DMSO 100 μL，振蕩10 min，用酶聯(lián)免疫檢測儀在494 nm處測其OD值，計算細胞增殖抑制率(IR%)。

1.6 十八碳烯酸對人胃癌細胞凋亡的影響 取15 mL培養(yǎng)瓶7個，每瓶加RPMI1640培養(yǎng)液6 mL，加人胃癌細胞液2 mL(細胞密度為2×107個·L-1)，給藥組分別加入十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-Fu各0.8 mL；空白對照組加等量的PBS，培養(yǎng)48 h后，離心收集細胞，PBS洗滌2次，加入70%冷乙醇固定24 h，離心棄乙醇，加PBS洗1次，加入Rnase(200 mg·L-1) 0.5 mL,37℃放置4 h，離心，棄上清，PBS洗一次，加0.5 mL碘化丙啶(propidium iodine, PI,20 mg·L-1),4℃，避光染色30 min，用流式細胞儀測定凋亡率。

1.7 統(tǒng)計學處理 實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。十八碳烯酸對人胃癌細胞毒性作用以百分比表示，組間差異采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 十八碳烯酸對人胃癌細胞毒性作用 分別給予人胃癌細胞5-FU和十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1培養(yǎng)48 h，在光鏡下計數(shù)活細胞，結果發(fā)現(xiàn)活細胞數(shù)隨給藥濃度的增加和作用時間的延長而減少。

2.2 十八碳烯酸對人胃癌細胞增殖的抑制作用 分別給予人胃癌細胞十八碳烯酸0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-FU培養(yǎng)48 h，用MTT法測定，人胃癌細胞增殖抑制率分別為46.48%、62.99%、74.92%和60.55%，半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.21 mg·L-1。

2.3 十八碳烯酸對人胃癌細胞凋亡的影響 分別給予人胃癌細胞十八碳烯酸 0.2、0.4、0.8 mg·L-1和5-FU培養(yǎng)48 h，用流式細胞儀測得凋亡率分別為16.42%、21.26%、25.64%和18.23%。見Tab 1。

Tab 1 Effects of octadecenoic acid on MGC-803 cell apoptosis

3 討論

十八碳烯酸是從甘肅貓兒眼(甘遂)中提取分離出的多不飽和脂肪酸[1]。多不飽和脂肪酸是人體必需的不飽和脂肪酸[2]，是重要的營養(yǎng)物質[3]。多不飽和脂肪酸能通過誘導細胞凋亡[4]，抑制腫瘤細胞的增殖[5]和血管生成[6]，并能抑制腫瘤細胞的侵襲[7]和轉移[8]。本文將十八碳烯酸給予人胃癌細胞分別于培養(yǎng)6、12、18、24和48 h，臺盼藍染色(正常的活細胞，胞膜結構完整，能夠排斥臺盼藍，使之不能夠進入胞內；細胞膜結構破環(huán)，通透性增加，可被臺盼藍染成藍色)、MTT法檢測(活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜并沉積在細胞中，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其吸光度，活細胞越多，吸光度就越高；若線粒體結構損傷，不能將外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲臜，吸光度就隨之降低)和光學顯微鏡觀察結果，隨給藥濃度的增加和培養(yǎng)時間的延長，破裂死亡的細胞數(shù)增多，細胞增殖的抑制率就越高；流式細胞儀檢測結果顯示，給藥組G0期和G1期細胞數(shù)比對照組明顯升高，G2期和M期細胞明顯減少，細胞阻滯于G0期和G1期，進入G2期和M期的細胞減少,起到抑制細胞分裂增殖和促進細胞凋亡的作用。

以上結果表明，十八碳烯酸對人胃癌細胞具有明顯的毒性作用，其機制與十八碳烯酸破壞細胞膜結構，抑制細胞分裂，損傷線粒體結構，導致細胞凋亡、破裂、死亡等有關。實驗結果為進一步研究開發(fā)和十八碳烯酸的臨床應用提供了實驗依據(jù)。

[1] 王向群，陳麗娟，吳 丹. N-3多不飽和脂肪酸抗腫瘤機制的研究進展[J].實用癌癥雜志，2011，26(3)：321-4.

[1] Wang X Q, Chen L J,Wu D. The research progress of n-3 polyunsaturated fatty acids antitumor mechanism[J].PractJCancer, 2011,26(3)：321-4.

[2] 劉 蓮,俞 靜. ω-3多不飽和脂肪酸在非小細胞肺癌病人中的應用[J].腸外與腸內營養(yǎng),2016，23(2)：112-5.

[2] Liu L,Yu J. The application of Omega-3 polyunsaturated fatty acids in non-small cell lung cancer patients [J].ParentEnterNutr, 2016，23(2)：112-5.

[3] Swiatkiewicz S, Swiatkiewicz M, Arczewska-Wosek A, et al. The use of genetic engineering techniques to improve the lipid composition in meat, milk and fish products: A review[J].Animal, 2015,9(4):696-706.

[4] 王寶貴，張 暉，丁學偉，等.ω-3多不飽和脂肪酸對胃癌細胞系生長抑制作用及其機制的研究[J].中華腫瘤防治雜志, 2011,18(5)：336-8.

[4] Wang B G, Zhang H, Ding X W, et al. The mechanism of omega-3 polyunsaturated fatty acids on gastric cancer cell growth inhibition[J].ChinJCancerPreventTreat, 2011,18(5)：336-8.

[5] Tan Y Z，Huang W G，Chen F Y. N-3 Polyunsaturated fatty acids enhance the antitumor effect of 5-fluorouracil by inhibiting bcl-2 and mutant-p53[J].EurJLipidSciTechnol，2013，115(12)：1483-91.

[6] 虞 迪,朱峰妍,曹志飛，等.毛茛有效部位D1對人胃癌細胞MGC803血管生成擬態(tài)的作用及其機制[J].中國藥理學通報,2013，29(2)：261-5.

[6] Yu D, Zhu F Y, Cao Z F, et al. D1 of Buttercup effective parts on human gastric cancer cells MGC803 vasculogenic mimicry and its mechanism[J].ChinPharmacolBull, 2013，29(2)：261-5.

[7] 何 慧,馬艷華,蘇 波，等.二烯丙基二硫對人胃癌MGC803細胞Rac1-Pak1/Rock1通路的影響[J].中國藥理學通報,2014，30(3)：349-54.

[7] He H, Ma Y H, Su B, et al. Effect of diallyl disulfide on gastric carcinoma MGC803 cells Rac1-Pak1/Rock1 pathways [J].ChinPharmacolBull, 2014，30(3)：349-54.

[8] Fukui M, Kang K S, Okada K. EPA, an omega-3 fatty acid, induces apoptosis in human pancreatic cancer cells: Role of ROS accumulation, caspase-8 activation, and autophagy induction[J].JCellularBiochem,2013,114(1):192-203.

Toxicity mechanism of octadecenoic acid on MGC-803 cells

YU Fa-rong, YANG Bo, LIAN Xiu-zhen, XIE Ming-ren, LI Deng-lou, ZHANG Shi-shuang, CHEN Wang-jun， GUO Yun-xuan

(KeyLaboratoryofEvidenceofScienceandTechnologyResearchandApplication,GansuProvince,Lanzhou730070,China)

甘肅貓兒眼；十八碳烯酸; 人胃癌細胞；毒性作用; 細胞增殖; 細胞凋亡

maoeryan of Gansu origin； octadecenoic acid; MGC-803 cells; toxic effect；cell proliferation；cell apoptosis

時間：2017-5-25 17:44 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20170525.1744.056.html

201701-03，

2017-02-18

甘肅省基礎研究創(chuàng)新群體項目(No 145RJIA333)；蘭州市科技計劃項目(No 2014-1-182; 2015-3-80)；蘭州市人才創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目；甘肅省高?？萍紕?chuàng)新團隊項目(No 2016C-09)；西北民族地區(qū)偵查理論與實務研究中心項目；甘肅政法學院重大科研項目

俞發(fā)榮(1959-)，男，博士，研究員,研究方向：腫瘤藥物學、行為心理學,E-mail: tim9898@163.com; 謝明仁(1977-),男，碩士，副教授，研究方向：物證科學技術,通訊作者，E-mail: xmr7600@gsli.edu.cn

10.3969/j.issn.1001-1978.2017.06.028

A

1001-1978(2017)06-0887-02

R282.71；R329.24；R329.25；R735.202.2