氨茶堿對SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響

張洋洋，楊林瀛，龐桂芬，劉 娜，姜 鋒

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

氨茶堿對SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞增殖能力的影響

張洋洋，楊林瀛，龐桂芬△，劉 娜，姜 鋒

（承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北承德 067000）

目的:探討氨茶堿對SD大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞（ASCs）增殖能力的影響。方法：分離培養(yǎng)SD大鼠ASCs，取第3代ASCs，不同濃度氨茶堿（0μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）作用ASCs 48h，臺盼藍(lán)染色檢測各組細(xì)胞的存活率，MTT法繪制細(xì)胞生長曲線。結(jié)果：不同濃度氨茶堿組ASCs存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；相同培養(yǎng)時(shí)間、不同濃度氨茶堿組ASCs增殖能力比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：在體外培養(yǎng)條件下，治療濃度的氨茶堿對ASCs的存活率和增殖無明顯影響。

氨茶堿；脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞；細(xì)胞增殖；細(xì)胞培養(yǎng)

【KEY WORDS】 Aminophylline; Adipose tissue-derived stem cells; Proliferation; Cell culture

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是來源于中胚層的成體干細(xì)胞，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)和促進(jìn)組織修復(fù)等作用。脂肪來源的MSCs（ASCs）易于分離和純化，是較為理想的MSCs來源[1]。目前，MSCs對腦卒中、心肌梗死等疾病的治療已進(jìn)行到臨床試驗(yàn)階段，而亦有多項(xiàng)臨床前研究顯示，MSCs對慢性阻塞性肺疾?。–OPD）可能具有潛在的治療意義[2-4]。氨茶堿是國內(nèi)治療COPD的常用藥物之一，如治療需要同時(shí)應(yīng)用ASCs和氨茶堿，應(yīng)明確二者是否存在相互作用，但目前國內(nèi)外尚無相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究。本研究擬通過體外研究初步探討茶堿對ASCs的存活及增殖的影響，對未來臨床應(yīng)用ASCs提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與試劑 4周齡SPF級健康雄性SD大鼠4只，體重60-80g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司（許可證號：SCXK(京)2012-0001）。實(shí)驗(yàn)中對動物的處置遵守《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的指導(dǎo)性意見》相關(guān)要求。主要試劑：ASCs專用培養(yǎng)基（Sciencell，美國），Ⅰ型膠原酶、臺盼藍(lán)染液（Sigma，美國），0.25%胰蛋白酶-EDTA（北京索萊寶科技有限公司），MTT（Amerison，美國）。

1.2 方法

1.2.1 SD大鼠ASCs的分離培養(yǎng)和傳代：SD大鼠頸椎脫臼處死，75%乙醇消毒10min后剪開腹部皮膚，剪取腹部后外側(cè)皮下脂肪組織，無菌PBS沖洗3次，去除血管和纖維成分后充分剪碎，加入約10倍體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃水浴震蕩消化30min，1000r/min離心10min棄上清，PBS洗滌后再次離心棄上清，ASCs專用培養(yǎng)基重懸，接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48h后首次換液，以后每3天換液1次。細(xì)胞長至約80%融合，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化1min，加入含血清的培養(yǎng)液中和胰蛋白酶終止消化，以1:3傳代培養(yǎng)。

1.2.2 ASCs存活率檢測：取第3代ASCs，消化后以1×104個(gè)/孔接種于6孔板，48h后進(jìn)行藥物處理，分為氨茶堿0μg/ ml（對照組）、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml 4組，每組3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后消化、離心及重懸細(xì)胞，取細(xì)胞懸液各5μl與5μl體積分?jǐn)?shù)0.4%臺盼藍(lán)染液混合，1min后滴入細(xì)胞計(jì)數(shù)板。顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)，死細(xì)胞被染成淡藍(lán)色，活細(xì)胞拒染。細(xì)胞存活率（%）=活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。每組取3個(gè)復(fù)孔的平均值。

1.2.3 ASCs增殖能力檢測：取第3代ASCs，消化后以1×103個(gè)/200μl/孔接種于96孔板，24h后進(jìn)行藥物處理，分組同前，每組5個(gè)復(fù)孔。每天取1塊96孔板，共7天，每孔加入20μl MTT，孵箱中孵育4h后吸去培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，搖床振蕩10min，酶標(biāo)儀490nm處測定吸光值（A值），繪制細(xì)胞生長曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，多組間計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ASCs存活率檢測結(jié)果 氨茶堿0μg/ml組、5μg/ml組、10μg/ml組、20μg/ml組ASCs存活率分別為（95.65±1.23）%、（95.60±1.32）%、（95.54±2.27）%、（95.72±2.76）%，各組ASCs存活率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 ASCs增殖能力檢測結(jié)果 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，各組細(xì)胞吸光度值逐漸升高，第1-5天吸光度值升高幅度較快，第5天后吸光度值升高速度減慢，提示細(xì)胞進(jìn)入增殖平臺期。相同培養(yǎng)時(shí)間、不同濃度氨茶堿組ASCs吸光度值比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見附表：

附表 ASCs不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光度值（±s，n=5）

附表 ASCs不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光度值（±s，n=5）

氨茶堿濃度0μg/ml 5μg/ml 10μg/ml 20μg/ml 1d 0.193±0.003 0.192±0.003 0.192±0.001 0.190±0.002 2d 0.293±0.008 0.298±0.015 0.294±0.005 0.291±0.007 3d 0.418±0.006 0.418±0.006 0.416±0.014 0.414±0.013 4d 0.632±0.010 0.634±0.012 0.632±0.005 0.631±0.012 5d 0.706±0.006 0.707±0.014 0.705±0.009 0.705±0.005 6d 0.716±0.008 0.717±0.004 0.715±0.006 0.714±0.006 7d 0.724±0.013 0.726±0.019 0.722±0.009 0.721±0.009培養(yǎng)時(shí)間

3 討論

COPD以持續(xù)性、進(jìn)展性氣流受限為特征，與氣道和肺臟對吸入的有害氣體或顆粒的慢性炎癥反應(yīng)增強(qiáng)有關(guān)，嚴(yán)重危害人們的身體健康。據(jù)全球疾病負(fù)擔(dān)研究項(xiàng)目估計(jì)，2020年COPD將位居全球死亡原因的第3位。最新一項(xiàng)Meta分析顯示[5]，中國40歲以上人群COPD的患病率為9.9%。茶堿類藥物應(yīng)用于COPD、哮喘等呼吸道疾病已有70余年，雖然副作用較多，中毒濃度（＞20-25μg/ml）接近治療濃度（10-20μg/ml），但我國COPD指南中指出血液中茶堿濃度＞5μg/ml即有治療作用，可在COPD患者中應(yīng)用。

氨茶堿為茶堿和乙二胺的復(fù)合物，約含茶堿77%-83%。茶堿為甲基黃嘌呤類藥物，能抑制磷酸二氫酶，降低環(huán)磷酸腺苷（cAMP）的水解速度，從而提高平滑肌細(xì)胞內(nèi)cAMP的濃度，cAMP/cGMP比值升高開放鈣激活的鉀通道，從而松弛支氣管平滑??；茶堿還可影響內(nèi)源性兒茶酚胺的釋放，激活β2受體而舒張支氣管平滑肌。治療濃度氨茶堿的主要作用是舒張氣道、改善肺通氣，在較低的血漿濃度（5-10μg/ml）時(shí)具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用，如：①能夠抑制中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞等炎癥細(xì)胞的活化[6];②抑制IL-4、組胺等炎癥介質(zhì)的釋放，以減輕氣道高反應(yīng)性[7];③減少炎癥介質(zhì)對氣道上皮的刺激[6-8],減少TGF-β1的分泌， 可能具有延緩氣道重塑的作用[6,8-9]。

ASCs是近年研究較多的成體干細(xì)胞，因來源豐富，易于分離和純化，成為目前細(xì)胞治療的理想細(xì)胞來源之一。藥物可能會影響MSCs的增殖、凋亡等生物學(xué)特性，如他汀類藥物在體外可抑制MSCs的增殖[10]。作為國內(nèi)治療COPD的常用藥物，氨茶堿與ASCs之間是否存在相互作用，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)研究報(bào)道。為此，本研究初步探討了治療濃度的氨茶堿對ASCs存活和增殖能力的影響。結(jié)果顯示，與對照組比較，不同濃度氨茶堿（5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml）作用ASCs后，細(xì)胞存活率無明顯差異；并且發(fā)現(xiàn)，相同培養(yǎng)時(shí)間、不同濃度氨茶堿組ASCs增殖能力亦無明顯差異。本研究提示，治療濃度的氨茶堿在體外對ASCs的存活和增殖無明顯影響。關(guān)于氨茶堿與MSCs的其它相互作用，本課題組將進(jìn)一步深入探討。

[1]Oberbauer E, Steffenhagen C, Wurzer C, et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art[J]. Cell Regen(Lond), 2015, 4: 7.

[2]Liu X, Fang Q, Kim H. Preclinical Studies of Mesenchymal Stem Cell (MSC) Administration in Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD): A Systematic Review and Meta-Analysis[J]. PLoS One, 2016, 11(6):e0157099.

[3]Sharma RR, Pollock K, Hubel A, et al. Mesenchymal stem or stromal cells: a review of clinical applications and manufacturing practices[J]. Transfusion, 2014, 54(5): 1418-1437.

[4]Antunes MA, Abreu SC, Cruz FF, et al. Effects of different mesenchymal stromal cell sources and delivery routes in experimental emphysema[J]. Respiratory research, 2014, 15:118.

[5]包鶴齡，萬利文，王臨虹.1990-2014年中國40歲及以上人群慢性阻塞性肺疾病患病率Meta分析[J].中華流行病學(xué)雜志，2016，37(1)：119-124.

[6]Coward WR, Sagara H, Church MK. Asthma, adenosine, mast cells and theophylline[J]. Clin Exp Allergy, 1998, 28 Suppl 3:42-46.

[7]Tohda Y, Nakahara H, Kubo H, et al. Theophylline suppresses the release of interleukin-4 by peripheral blood mononuclear cells[J]. Int Arch Allergy Immunol, 1998, 115(1): 42-46.

[8]Tomita K, Chikumi H, Tokuyasu H, et al. Functional assay of NF-kappaB translocation into nuclei by laser scanning cytometry: inhibitory effect by dexamethasone or theophylline[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 1999, 359(4): 249-255.

[9]劉平莉，呂麗麗，夏春偉，等.小劑量茶堿對哮喘小鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)化生長因子-β1表達(dá)的影響[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2008，24（1）：27-29.

[10]Beak KH, Lee WY, Oh KW, et al. The effect of simvastatin on the proliferation and differentiation of human bone marrow stromal cells[J]. J Korean Med Sci, 2005, 20(3): 438-444.

EFFECT OF AMINOPHYLLINE ON PROLIFERATION OF ADIPOSE TISSUE-DERIVED STEM CELLS OFSD RATS

ZHANG Yang-yang, YANG Lin-ying, PANG Gui-fen, et al
(the Affiliated Hospital of Chengde Medical College, Hebei Chengde 067000, China)

Objective: To explore the effects of aminophylline on proliferation of adipose tissue-derived stem cells (ASCs) of SD rats. Methods: ASCs of SD rats were isolated and cultured to the third generation. Trypan blue staining was used to detect the survival rate of ASCs, MTT methods to draw growth curve after the ASCs were cultured with aminophylline of different concentration (0μg/ml, 5μg/ml, 10μg/ml, 20μg/ml) for 48h. Results: There was no signif i cant difference about survival rate of ASCs in different concentration aminophylline group (P＞0.05). There was no significant difference about proliferation of ASCs at same culture time and of different concentration of aminophylline (P＞0.05). Conclusions: Treatment concentration of aminophylline has no obvious effects on survival rate and proliferation of ASCs in vitro.

R974

A

1004-6879（2017）03-0183-03

2016-09-13）

△ 通訊作者