云南中蜂蜂箱寄居節(jié)肢動(dòng)物種類及中蜂囊狀幼蟲病病毒檢測(cè)

宋文菲，梁 鋮，苗春輝，張學(xué)文，羅衛(wèi)庭，楊 爽,2*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

云南中蜂蜂箱寄居節(jié)肢動(dòng)物種類及中蜂囊狀幼蟲病病毒檢測(cè)

宋文菲1，梁 鋮1，苗春輝1，張學(xué)文1，羅衛(wèi)庭1，楊 爽1,2*

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶桑蜜蜂研究所，云南 蒙自 661101； 2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

為了解中蜂蜂箱內(nèi)寄居節(jié)肢動(dòng)物種類及其感染中蜂囊狀幼蟲病病毒的情況，采集中蜂箱內(nèi)的主要寄居節(jié)肢動(dòng)物，并利用RT-PCR技術(shù)對(duì)這些節(jié)肢動(dòng)物樣品進(jìn)行CSBV帶毒情況檢測(cè)。結(jié)果顯示，云南省中蜂蜂箱內(nèi)主要的寄居節(jié)肢動(dòng)物有7種，都不同程度地感染了CSBV，且平均感染率為68.57%。研究表明，中蜂蜂箱內(nèi)節(jié)肢動(dòng)物可成為CSBV的攜帶者，可將病毒傳播給其他蜂群。

中蜂； 中蜂囊狀幼蟲病病毒； 蜂箱； 寄居節(jié)肢動(dòng)物； 間接傳播

中蜂囊狀幼蟲病簡(jiǎn)稱中囊病，是由中蜂囊狀幼蟲病病毒(Chinese Sacbrood Virus，CSBV)感染引起的腸道傳染性疾病，發(fā)病快，傳播迅速，嚴(yán)重影響了中蜂的生產(chǎn)。該病是中蜂的主要病害之一，一旦感染，很難治愈，死亡率高達(dá)60%～90%。疾病的傳播方式是其擴(kuò)大感染范圍的有效途徑，一般昆蟲病毒性疾病的傳播方式分為水平傳播和垂直傳播兩種，近些年來，蜜蜂病毒性疾病的傳播方式也被西方學(xué)者廣泛研究，這些研究證實(shí)了蜜蜂病毒性疾病的傳播方式也分為水平傳播和垂直傳播[1]。水平傳播是指病毒在同一世代的蜜蜂個(gè)體中進(jìn)行傳播，可分為直接與間接兩種，直接傳播包括空氣傳播感染、食物傳播感染、交尾傳播感染；間接傳播是指通過起媒介作用的生物宿主進(jìn)行傳播。垂直傳播則是發(fā)生在親代與子代間的傳播，即可通過親代的卵把病毒傳播給子代。

蜂箱這個(gè)大環(huán)境里不僅住著蜜蜂，還住著許多其他的節(jié)肢動(dòng)物，而這些節(jié)肢動(dòng)物或多或少都會(huì)與蜜蜂及其食物接觸，這一過程也為疾病的傳播提供了途徑和媒介。中囊病作為中蜂的主要病害之一，多年來一直是研究者研究的熱點(diǎn)，但卻沒有找到一種行之有效的治愈方法。國(guó)外研究者研究了西蜂蜂箱內(nèi)傳播該病的生物媒介，針對(duì)中蜂蜂箱內(nèi)的卻鮮有報(bào)道。本文以云南中蜂蜂箱內(nèi)的寄居節(jié)肢動(dòng)物為研究材料，研究在中囊病高發(fā)季節(jié)蜂箱內(nèi)節(jié)肢動(dòng)物攜帶CSBV的情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采集到的7種主要節(jié)肢動(dòng)物均被檢測(cè)到攜帶CSBV，表明中蜂箱內(nèi)的寄居節(jié)肢動(dòng)物可成為CSBV傳播的生物媒介。本文研究結(jié)果為研究CSBV潛在的主要傳播媒介提供前期基礎(chǔ)，也為研究CSBV的流行病學(xué)提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集時(shí)間為中囊病高發(fā)的春繁季節(jié)，時(shí)間為2015年3—4月。采集地點(diǎn)為云南省楚雄州武定縣、紅河州蒙自市、西雙版納州勐?？h、曲靖市羅平縣。蜂箱包括木制和水泥制2種。采集的樣品保存在-80 ℃。

1.2 總RNA提取

參照許益鵬等[2]的方法，并加以改進(jìn)。具體步驟如下：每群取5只樣品(蟑螂、蚰蜒、衣魚等個(gè)體較大的蟲體，需將蟲體用滅菌手術(shù)剪剪成3～4段，每段為1個(gè)樣品進(jìn)行檢測(cè))，取1只置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入1 mL Trizol，用玻璃研棒充分勻漿，靜置5 min；加入200 μL氯仿，充分震蕩，靜置2 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min；取上清液400～600 μL，加氯仿200 μL，混勻靜置5 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；取上清液200～300 μL，加入等量的異丙醇，混勻，靜置10 min；4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min；沉淀以75%乙醇洗；4 ℃，12 000 r·min-1離心5 min；倒去乙醇，真空抽干，用40 μL DEPC處理水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RT-PCR擴(kuò)增

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂箱內(nèi)昆蟲種類

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，蜂箱內(nèi)有蠟螟、螞蟻1(一種大螞蟻)、螞蟻2(一種小的黃色螞蟻)、蟑螂、衣魚、疑似黑粉甲(Alphitobiusdiaperinus，Panzer，1796)的小甲蟲、蚰蜒(圖1～2)。

圖2 水泥制中蜂蜂箱內(nèi)3種主要寄居節(jié)肢動(dòng)物

2.2 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果

部分昆蟲的RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖3～4所示，目的片段為487 bp。圖3中泳道1～3為蟑螂樣品，4和10為螞蟻1樣品，5～9為蠟螟樣品。圖4中泳道1～5為衣魚樣品，6為蠟螟樣品，泳道7～11為蚰蜒樣品，12為蠟螟樣品。檢測(cè)結(jié)果顯示，被檢測(cè)的蟑螂、蠟螟、衣魚、蚰蜒、螞蟻1樣品都不同程度的感染了CSBV。

2.3 節(jié)肢動(dòng)物感染CSBV情況

中蜂蜂箱內(nèi)寄居節(jié)肢動(dòng)物感染CSBV的情況見表1，7種節(jié)肢動(dòng)物都不同程度地感染了CSBV，平均感染率為68.57%。

表1 中蜂蜂箱內(nèi)寄居節(jié)肢動(dòng)物感染CSBV情況

昆蟲名稱感染率/%采集地區(qū)衣魚100曲靖市羅平縣蚰蜒40曲靖市羅平縣蠟螟20蒙自市草壩鎮(zhèn)蟑螂40蒙自市草壩鎮(zhèn)螞蟻1100蒙自市草壩鎮(zhèn)螞蟻280曲靖市羅平縣疑似黑粉甲100楚雄州武定縣

1～3為蟑螂樣品，4、10為螞蟻1樣品，5～9為蠟螟樣品；M為DL1 000 Marker; 泳道3～4感染CSBV(487 bp)，泳道1～2和5未感染；泳道7、10感染CSBV(487 bp)，泳道6、8～9未感染圖3 蟑螂、螞蟻1、蠟螟樣品感染CSBV情況

1～5為衣魚樣品，4、6、12為蠟螟樣品，7～11為蚰蜒樣品；M為DL1 000 Marker; 泳道1～5感染CSBV(487 bp)，泳道6未感染；泳道10～11感染CSBV(487 bp)，泳道7～9、12未感染圖4 衣魚、蚰蜒、蠟螟樣品感染CSBV的情況

3 討論

宿主的成功傳毒依賴于獲毒、持毒、病毒穩(wěn)定性、病毒釋放等幾個(gè)環(huán)節(jié)。病毒性疾病的傳播方式一直是研究者研究防治該種疾病的一個(gè)重要方面。德國(guó)和希臘的研究者在20世紀(jì)80年代對(duì)蜜蜂病毒性疾病的水平傳播方式進(jìn)行了初步研究發(fā)現(xiàn)，患有蜜蜂囊狀幼蟲病的西蜂群中也嚴(yán)重感染了大蜂螨，推測(cè)病毒的流行與大蜂螨的發(fā)生緊密相聯(lián)，認(rèn)為蜂螨能夠攜帶蜜蜂囊狀幼蟲病病毒 (Sacbrood bee virus，SBV)，并將病毒傳播給中蜂蜂群。蜂螨作為一種潛在的蜜蜂病毒攜帶者，病毒可在其體內(nèi)復(fù)制[4-5]，被其浸入到蜜蜂血淋巴里，造成蜜蜂免疫抑制，同時(shí)也影響著蜜蜂體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)[6]。2001—2003年，在瓦螨暴發(fā)的新西蘭蜜蜂群中就檢測(cè)到包括SBV在內(nèi)的5種蜜蜂病毒[7]。研究發(fā)現(xiàn)，除了蜂螨，蜂巢內(nèi)的其他寄生蟲，如螞蟻、小蜂巢甲蟲、壁虱等也是蜜蜂病毒的攜帶者[8-10]。本文的研究結(jié)果與前人的研究結(jié)果相符[11]，發(fā)現(xiàn)中蜂箱內(nèi)的7種主要寄居節(jié)肢動(dòng)物在CSBV高發(fā)季節(jié)都是CSBV的攜帶者，表明CSBV的傳播不單純是蜂群內(nèi)部的食物或飼喂接觸傳播，與蜂群共同生活的節(jié)肢動(dòng)物也是該病毒的潛在傳播媒介。

我國(guó)是蜜蜂疾病流行與暴發(fā)最為嚴(yán)重的地區(qū)之一，每年因疾病流行損失大量飼養(yǎng)蜂群，疾病的廣泛傳播成為我國(guó)蜜蜂生物多樣性快速下降的一個(gè)主要因素[12]。目前，對(duì)中囊病防控措施的研究報(bào)道多局限在發(fā)病后，采取藥物、加強(qiáng)飼養(yǎng)管理、換王斷子等綜合防治措施，但效果一般，而從病毒的傳播途徑角度尋找解決方法的研究，卻鮮有報(bào)道。雖然國(guó)外研究者對(duì)包括SBV在內(nèi)的多種蜜蜂病毒的傳播方式及潛在的生物傳播媒介進(jìn)行了大量的研究，但CSBV與SBV是2個(gè)獨(dú)立的病毒株。研究表明，同一病毒種的不同病毒株的傳播方式特性也是不盡相同的[13]，且中蜂和意蜂又是兩種完全不同的蜂種。因此，有必要對(duì)中蜂蜂箱內(nèi)CSBV的傳播媒介進(jìn)行研究，為培育抗病中蜂良種提供前期基礎(chǔ)。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-03-20

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(蜜蜂)(CARS-45-SYZ 17)；云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院基礎(chǔ)性超前預(yù)研項(xiàng)目(2014CZJC014)；國(guó)家自然科學(xué)基金應(yīng)急管理項(xiàng)目(31640080)

宋文菲(1983—)，女，吉林蛟河人，助理研究員，碩士，從事蜜蜂病害防治及良種選育研究工作，E-mail: wenfeisong@126.com。

楊 爽，從事中蜂病蟲害研究工作，E-mail: yangshuang19860724@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170544

S896.1

A

0528-9017(2017)05-0861-03

文獻(xiàn)[3]中SBV片段SB1-2引物SBV-F(5′-ACCAACCGATTCCTCAGTAG-3′)，SBV-R (5′-CCTTGGAACTCTGCTGTGTA-3′)。RT-PCR反應(yīng)體系為：20 μL體系中含有RNase Free dH2O 8.7 μL，MgCl2(25 mmol·L-1) 4 μL，10×One Step RNA PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture(10 mmol·L-1) 2 μL，RNase Inhibitor(40 U·μL-1) 0.3 μL, AMV Reverse Transcriptase XL(5 U·μL-1) 0.3 μL，AMV-Optimized Tap (5 U·μL-1) 0.3 μL，上下游引物各0.8 μL，總RNA 0.8 μL。反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。取PCR產(chǎn)物5 μL用2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

文獻(xiàn)著錄格式：宋文菲，梁鋮，苗春輝，等. 云南中蜂蜂箱寄居節(jié)肢動(dòng)物種類及中蜂囊狀幼蟲病病毒檢測(cè)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(5)：861-864.