實(shí)驗(yàn)性前導(dǎo)斜度改變的大鼠模型的建立及其顳下頜關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察

李雨軒 翟桐 譚文宏 白樂(lè)康 肖敏

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，西安 710004

實(shí)驗(yàn)性前導(dǎo)斜度改變的大鼠模型的建立及其顳下頜關(guān)節(jié)滑膜組織病理學(xué)觀察

李雨軒 翟桐 譚文宏 白樂(lè)康 肖敏

西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院修復(fù)科，西安 710004

目的 建立穩(wěn)定的前導(dǎo)斜度改變的大鼠模型，探索其對(duì)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)（TM J）滑膜的組織病理學(xué)影響。

方法 將32只大鼠隨機(jī)分為4組，分別是對(duì)照組（C）、前導(dǎo)缺失組（T1）、前導(dǎo)斜度增大15°組（T2）、前導(dǎo)斜度增大30°組（T3）。在大鼠上前牙粘接舌側(cè)增大15°、30°金屬冠改變相應(yīng)前導(dǎo)斜度。采用低速金剛砂輪打磨大鼠上下前牙，使下頜在各個(gè)方向運(yùn)動(dòng)時(shí)上下牙切緣不接觸，造成前導(dǎo)缺失。3、7、14、28 d各處死2只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后取大鼠一側(cè)TM J作石蠟切片蘇木精-伊紅（HE）染色，通過(guò)組織病理學(xué)診斷鑒定大鼠TM J滑膜的改變。結(jié)果 T1組體重短暫下降后緩慢增加（P<0.05），T3組體重明顯下降后略回升，但始終低于初始體重（P<0.05），T3組滑膜襯里細(xì)胞增生，血管擴(kuò)張明顯（P<0.05）。結(jié)論 本研究所建立的前導(dǎo)斜度增大30°大鼠模型能較好地模擬臨床上前導(dǎo)斜度過(guò)大造成的TMJ滑膜出現(xiàn)的組織病理變化過(guò)程。提示前導(dǎo)斜度增大越多，發(fā)生TMJ滑膜損傷的風(fēng)險(xiǎn)越大。而前導(dǎo)缺失對(duì)TMJ滑膜的影響有待進(jìn)一步確定。

前導(dǎo)斜度； 前導(dǎo)缺失； 顳下頜關(guān)節(jié)； 滑膜

前導(dǎo)的概念最早由Broderson在1978年提出，是指在下頜各個(gè)方向的功能運(yùn)動(dòng)中上下頜前牙接觸關(guān)系。Donegan等[1]發(fā)現(xiàn)前牙修復(fù)中存在過(guò)度恢復(fù)前牙舌側(cè)厚度和形態(tài)的情況。并提出了過(guò)度的恢復(fù)上切牙舌側(cè)面的外形來(lái)增加與下切牙的接觸關(guān)系是不正常的，可能是有害的。在臨床中，也觀察到類似的病例，調(diào)磨其舌側(cè)過(guò)厚的外形后，患者出現(xiàn)的顳下頜關(guān)節(jié)（temporomandibular joint，TM J）不適癥狀有所減輕或消失。

前導(dǎo)對(duì)下頜前伸、側(cè)方運(yùn)動(dòng)具有主要引導(dǎo)作用，下頜運(yùn)動(dòng)時(shí)前導(dǎo)使后牙脫離咬合接觸，減少后牙干擾引起的下頜異常運(yùn)動(dòng)，其是維持口頜系統(tǒng)健康的重要因素，滑膜及滑膜液的改變已經(jīng)成為臨床上診斷顳下頜關(guān)節(jié)紊亂?。╰emporomandibular disorders，TMD）的根據(jù)之一，而關(guān)于前導(dǎo)與TMJ滑膜的相互關(guān)系及影響的研究較少。本研究通過(guò)模擬前導(dǎo)斜度增大和缺失的情況，建立大鼠動(dòng)物模型，以此為基礎(chǔ)探討其對(duì)大鼠TM J滑膜的改變作用和程度，為修復(fù)和正畸治療提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

選取由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供的雌性SD大鼠32只，體重220~260 g，隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為對(duì)照組（C）、前導(dǎo)缺失組（T1）、前導(dǎo)斜度增大15°組（T2）、前導(dǎo)斜度增大30°組（T3）。實(shí)驗(yàn)期為28 d。

1.2 前導(dǎo)缺失及前導(dǎo)斜度增大的處理方法

1.2.1 建立前導(dǎo)缺失動(dòng)物模型 采用低速連柄砂輪同時(shí)打磨大鼠上下前牙，消除上下牙在下頜各方向運(yùn)動(dòng)時(shí)的接觸；每2 d打磨一次，按第一次磨牙后的牙長(zhǎng)度數(shù)據(jù)作參照處理。

1.2.2 建立前導(dǎo)增大動(dòng)物模型 用硅橡膠制作大鼠前牙局部托盤，待托盤成形后再次用硅橡膠給大鼠前牙取模，灌制超硬石膏模型，在模型上用自凝造牙樹(shù)脂制作舌側(cè)增大15°、30°冠（此角度為上牙舌面與冠舌面的夾角即為前導(dǎo)斜度增大的角度）。將做好的樹(shù)脂牙冠翻制鑄造成金屬冠。在麻醉、隔濕條件下將金屬全冠粘接在SD大鼠上頜雙側(cè)前牙上。對(duì)照組不做處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)束之前在同樣情況下飼養(yǎng)。隔日記錄體重?cái)?shù)據(jù)和金屬冠在口內(nèi)維持情況（圖1）。

1.3 標(biāo)本的處理

于實(shí)驗(yàn)后3、7、14、28 d每組各處死2只，10%水合氯醛0.003 m L·g-1腹腔注射，麻醉大鼠，主動(dòng)脈插管快速推進(jìn)生理鹽水，繼續(xù)灌注4%多聚甲醛，取一側(cè)完整TM J關(guān)節(jié)（另一側(cè)關(guān)節(jié)滑膜取出為下一步實(shí)驗(yàn)所用），置于40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h后，EDTA中脫鈣1個(gè)月，常規(guī)脫水，石蠟包埋，沿矢狀方向連續(xù)切片，厚度為5 μm。

圖 1 動(dòng)物模型示意圖Fig 1 Schematic diagram of animal model

1.4 組織形態(tài)學(xué)染色及圖像分析

每個(gè)標(biāo)本取正中矢狀面2張切片，共計(jì)64張，常規(guī)蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，在Olympus DP71顯微照相系統(tǒng)下采圖，對(duì)各樣本于× 40倍鏡下，DP Controller軟件中觀察關(guān)節(jié)盤后部雙板區(qū)被覆的滑膜組織（圖2），評(píng)估滑膜組織形態(tài)學(xué)變化。由兩名觀察者盲法觀察免疫組化染色結(jié)果，隨機(jī)選擇不重疊的10個(gè)視野，人工計(jì)數(shù)，計(jì)算該區(qū)域內(nèi)計(jì)數(shù)等級(jí)，3次計(jì)數(shù)的均值被用于后續(xù)的統(tǒng)計(jì)分析。染色結(jié)果的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)[2]如下?；ぜ?xì)胞層數(shù)：0級(jí)：1~3層；1級(jí)：4~6層；2級(jí)：≥7層。血管擴(kuò)張：0級(jí)：未出現(xiàn)；1級(jí)：累及小于滑膜長(zhǎng)度的1/3；2級(jí)：累及滑膜長(zhǎng)度的1/3~2/3；3級(jí)：累及大于滑膜長(zhǎng)度的2/3。纖維素沉積：同血管擴(kuò)張。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，體重?cái)?shù)據(jù)采用4×4析因設(shè)計(jì)的方差分析。不同時(shí)間組間差異采用重復(fù)測(cè)量的方差分析，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故析因設(shè)計(jì)時(shí)選擇處死最終體重作為結(jié)局指標(biāo)。HE染色結(jié)果的等級(jí)資料采用多樣本的秩和檢驗(yàn)分析，所有樣本采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為0.05，組間比較據(jù)比較次數(shù)將水準(zhǔn)調(diào)整為0.05/6=0.008。

圖 2 大鼠TM J矢狀面切片示意圖Fig 2 Schematic diagram of a sagittal section of the rat’s TMJ

2 結(jié)果

2.1 體重變化

C組動(dòng)物隨著鼠齡增加，體重逐漸增加；T1組體重短暫下降后緩慢增加；T2組體重呈緩慢增加；T3組體重下降明顯后略回升。根據(jù)析因分析結(jié)果，不同實(shí)驗(yàn)組間體重變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；不同時(shí)間組體重變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而處理分組與時(shí)間存在的交互作用具有顯著差異（P<0.05）。兩兩比較顯示：T3組與T2和C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），T1與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05），其他方式處理組間兩兩比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.008）（圖3）。

圖 3 析因設(shè)計(jì)各組大鼠體重結(jié)果圖Fig 3 The changes of rat’s weights between the four groups by fac- torial design

2.2 TMJ滑膜組織改變

TMJ滑膜組織改變見(jiàn)圖4、表1。

圖 4 TM J滑膜組織觀察結(jié)果 HE × 40Fig 4 Histomorphology changes in the synovial tissue of the TMJ HE × 40

表 1 各組樣本滑膜組織形態(tài)學(xué)變化結(jié)果Tab 1 The morphological changes of synovial tissue in each group

不同組間滑膜細(xì)胞增生、血管擴(kuò)張、纖維素沉積均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。C組TM J關(guān)節(jié)盤雙板區(qū)附近滑膜細(xì)胞1~2層，表面光滑，滑膜下層中的血管未見(jiàn)擴(kuò)張，未出現(xiàn)炎性改變的證據(jù)；與C組相比，T3組滑膜襯里細(xì)胞增生，1~2級(jí)，血管擴(kuò)張明顯（P<0.008）。兩兩比較結(jié)果，與T3組相比，T1組滑膜層數(shù)輕度增生（P>0.008），3 d時(shí)纖維素沉積（P>0.008），輕度血管擴(kuò)張（P<0.008）；T2組滑膜不同時(shí)期層數(shù)為0級(jí)（P<0.008），滑膜下層的血管7 d時(shí)擴(kuò)張（P<0.008），幾乎無(wú)纖維素沉積（P<0.008）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選用大鼠作為研究對(duì)象是基于Weijs等[3]研究出其咀嚼運(yùn)動(dòng)和TMJ結(jié)構(gòu)與人具有一定類似性。解決前導(dǎo)裝置在大鼠前牙固位的最大一個(gè)問(wèn)題就是大鼠切牙不斷伸長(zhǎng)，固位裝置會(huì)隨著切牙伸長(zhǎng)不斷移動(dòng)，妨礙了持續(xù)而精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)干預(yù)且影響大鼠的咀嚼進(jìn)食。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題，Schour等[4]給一只大鼠的切牙做冠阻止了切牙的萌出。研究發(fā)現(xiàn)在大鼠下切牙上放置牙冠后，出現(xiàn)了釉質(zhì)有機(jī)成分的萎縮，釉基質(zhì)形成終止，牙源性上皮折疊，實(shí)驗(yàn)表明牙冠的形式干擾了切牙的正常磨耗和生長(zhǎng)，在動(dòng)物前牙實(shí)驗(yàn)中具有重要的意義。

因金屬咬合板和樹(shù)脂均難以在大鼠切牙舌側(cè)長(zhǎng)期固位，且這兩種改變前導(dǎo)斜度的裝置會(huì)隨著切牙不斷生長(zhǎng)而移位，造成干擾。故本研究采用給大鼠上切牙粘接舌側(cè)增大15°、30°的金屬冠來(lái)構(gòu)建前導(dǎo)斜度增大的動(dòng)物模型，這與A rce等[5]的研究結(jié)果一致，即牙冠干擾了上切牙的磨耗和生長(zhǎng)，在大鼠切牙粘接牙冠后的1個(gè)月實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，牙冠保持穩(wěn)定，上切牙停止生長(zhǎng)且長(zhǎng)度無(wú)明顯變化。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M了臨床上有學(xué)者[1,6]提出的上前牙修復(fù)體舌側(cè)過(guò)陡而增加了前導(dǎo)角度的情況和Kerstein等[7]在臨床上注意到前導(dǎo)缺失伴有TMD癥狀的情況，以及Guinn等[6]提出了前導(dǎo)角度尤其重要的情況，這些臨床問(wèn)題都提示前導(dǎo)改變?cè)斐闪藢?duì)TMJ的不良影響。大鼠前牙前導(dǎo)可變空間較大，前導(dǎo)增大30°時(shí)上前牙牙冠舌側(cè)面緊貼下前牙唇面，下頜前伸的軌跡幾乎是先垂直向下到切緣再向前運(yùn)動(dòng)，伴有輕微的下頜后退。故本實(shí)驗(yàn)將大鼠增加的前導(dǎo)角度最大值定為30°。并設(shè)立前導(dǎo)增大15°組，以達(dá)到梯度對(duì)比的目的，所有動(dòng)物在相同條件下飼養(yǎng)排除了其他因素的干擾。

前導(dǎo)增大30°時(shí)大鼠體重先明顯降低，后緩慢升高（P<0.05）；前導(dǎo)缺失時(shí)大鼠體重短暫下降后緩慢增加（P<0.05），因進(jìn)食量與體重直接相關(guān)，此兩種改變?cè)斐闪舜笫筮M(jìn)食困難，隨后推測(cè)咀嚼肌及TM J形成了某種補(bǔ)償，進(jìn)食量逐步增加，體重有所回升。

TMJ滑膜內(nèi)襯細(xì)胞通常為1~4層，在正常情況下細(xì)胞分裂速度極低，但在急性創(chuàng)傷或不良刺激作用下，滑膜細(xì)胞迅速增殖[8]。滑膜下血管神經(jīng)豐富，因此非常容易出血。在前導(dǎo)斜度增大30°組，血管擴(kuò)張3 d時(shí)出現(xiàn)（P<0.05），滑膜細(xì)胞增生明顯，伴有一定程度的纖維素沉積，且隨時(shí)間并未減輕。說(shuō)明此時(shí)TM J受到了一定的創(chuàng)傷和刺激，其發(fā)生的可能機(jī)制是前導(dǎo)斜度增大到30°，引起了髁突后退，對(duì)雙板區(qū)滑膜皺襞的壓力增大，這與陳彩云[9]建立的咬合創(chuàng)傷模型對(duì)大鼠TM J滑膜影響的研究結(jié)果有一定相似性。

在前導(dǎo)斜度增大15°組，未見(jiàn)明顯的炎癥改變，僅在3、7 d觀察到滑膜下血管的輕度擴(kuò)張。說(shuō)明前導(dǎo)斜度增大15°的改變還不足以引起TMJ滑膜的改變?；蛘咴诮Ｗ畛跫匆鹆嘶じ淖?，但在第3天改變已被代償。

在前導(dǎo)缺失組，3 d時(shí)滑膜細(xì)胞出現(xiàn)輕度增生和輕度血管擴(kuò)張、纖維素滲出，而隨后的時(shí)間點(diǎn)滑膜均未見(jiàn)明顯炎癥改變，這與孫蓮等[10]建立的大鼠前牙開(kāi) ，喪失前導(dǎo)而引發(fā)的TM J骨關(guān)節(jié)炎樣退變的結(jié)果并不一致，其原因可能是本實(shí)驗(yàn)前導(dǎo)缺失模型并未使用對(duì)大鼠持續(xù)張口的方法，關(guān)節(jié)腔壓力并無(wú)明顯變化，主要是以血管擴(kuò)張及毛細(xì)血管通透性升高，血管中的纖維蛋白滲出到血管外為主要反應(yīng)的變化。

綜上所述，前導(dǎo)增大30°可導(dǎo)致TMJ滑膜出現(xiàn)炎癥性改變，前導(dǎo)斜度增大30°可能是不影響大鼠生存前導(dǎo)增大的極限角度，這提示臨床前導(dǎo)斜度越陡，發(fā)生TM J滑膜炎癥的風(fēng)險(xiǎn)越大。而前導(dǎo)缺失引起了大鼠TM J滑膜的急性炎癥，可在短期內(nèi)很快消失，由此推測(cè)大鼠前導(dǎo)缺失不足以引起嚴(yán)重而持續(xù)的滑膜炎癥。

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（本文編輯 杜冰）

Establishment of rat models with altered anterior guidance and observation of histological changes in tem poromandibular joint synovium

Li Yuxuan, Zhai Tong, Tan Wenhong, Bai Lekang, Xiao Min. (Dept. of Prothodontics, Stomatology

Hospital of Xi’an Jiao Tong University, Xi’an 710004, China)

Supported by: Key Science and Technology Foundation of Shanxi Province (2012k16-10-03). Correspondence: Xiao Min, E-mail: 1968143838@qq.com.

ObjectiveThis study aims to establish a stable animal model with altered anterior guidance and investigate histological changes on temporomandibular joint (TMJ) synovium in rats. Methods Thirty-two rats were divided into four groups, namely, control group, anterior-guidance-deficient group (T1), and anterior guidance inclined up to 15 degree (T2) and 30 degree (T3) groups. Metal crowns that add 15 and 30 degrees to the palatal side were cemented to the incisors of maxilla to increase the inclination of anterior guidance. The low-speed diamond wheel shorts for both upper and lower incisors of rats were applied to avoid contact between anterior teeth in all direction, thus establishing an anterior guidance deletion model. TMJ joints on one side of two animals in each group were harvested after 3, 7, 14, and 28 days. Pathological changes were investigated in the TMJ synovium using hematoxylin-eosin (HE) staining.ResultsThe weight of T1 decreased briefly at first, and then increased slightly (P<0.05). The weight of T3 obviously reduced and then slow ly increased, but remained below the initial weight (P<0.05). T3 manifested obvious synovial lining proliferation and vascular dilation (P<0.05).ConclusionThe rat model of anterior guidance inclined up to 30 degree could im itate the pathological features of TMJ synovium with excessive increase in anterior guidance. A higher inclination of anterior guidance m ight cause more damage of TMJ synovium. The effect of anterior guidance deletion on TMJ synovium is yet to be determined.

inclination of anterior guidance; anterior guidance deficiency; temporomandibular joint; synovial membrane

R 782.6

A

10.7518/hxkq.2017.03.005

2016-06-03；

2017-03-10

陜西省社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)基金（2012k16-10-03）

李雨軒，主治醫(yī)師，碩士，E-mail：1206502414@qq.com

肖敏，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail：1968143838@qq.com