變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)的構(gòu)建

康迪 李雨慶 周學(xué)東

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都 610041

·基礎(chǔ)研究·

變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)的構(gòu)建

康迪 李雨慶 周學(xué)東

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家口腔疾病臨床研究中心，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，成都 610041

目的 構(gòu)建變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)，原位可視地檢測(cè)其所處環(huán)境的pH。方法 通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）和基因重組技術(shù)，克隆得到唾液鏈球菌57.I的ureⅠ基因啟動(dòng)子片段（pureⅠ）及綠色熒光蛋白（GFP）的編碼基因gfp，經(jīng)過(guò)酶切后將兩個(gè)基因片段連接融合，然后再經(jīng)雙酶切將融合片段與大腸桿菌-變異鏈球菌穿梭載體pDL278連接，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pDL278-pureⅠ-gfp。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到變異鏈球菌UA159中，使用熒光顯微鏡觀察其在不同pH條件和不同處理時(shí)間的單位面積熒光強(qiáng)度。結(jié)果 目的基因pureⅠ和gfp擴(kuò)增片段大小分別為450 bp和717 bp，與預(yù)期大小相符。構(gòu)建的重組質(zhì)粒pDL278-pureⅠ-gfp測(cè)序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)完全一致。重組變異鏈球菌低pH報(bào)告菌株P(guān)CR擴(kuò)增片段與預(yù)期結(jié)果相符。在一定范圍內(nèi)，變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)單位面積熒光強(qiáng)度隨pH值的降低和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)。結(jié)論 本研究成功構(gòu)建了變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)，同時(shí)驗(yàn)證了唾液鏈球菌酸誘導(dǎo)啟動(dòng)子pureⅠ能在變異鏈球菌中正常發(fā)揮功能，為今后研究菌斑生物膜中原位pH的動(dòng)態(tài)變化提供了新方法。

變異鏈球菌； 唾液鏈球菌； 綠色熒光蛋白； 尿素酶； 啟動(dòng)子

齲病是口腔常見(jiàn)的感染性疾病之一。牙菌斑生物膜的形成是齲病形成的首要因素，而變異鏈球菌則是牙菌斑中主要的致齲菌之一[1-2]。變異鏈球菌等產(chǎn)酸細(xì)菌通過(guò)分解糖類產(chǎn)酸，降低菌斑局部pH使牙面脫礦，最終形成齲損[3]。這些酸性代謝產(chǎn)物是造成牙齒脫礦最直接的原因[4]。目前，檢測(cè)菌斑基質(zhì)中pH值主要采用pH染料、微電極等方法，但這些測(cè)量方法常為非原位測(cè)量的方法，易帶入其他混雜因素[4-5]。

唾液鏈球菌是口腔中的主要產(chǎn)堿菌，在酸性環(huán)境中可被誘導(dǎo)產(chǎn)堿，以調(diào)節(jié)環(huán)境pH[6-7]。產(chǎn)生此特性的分子機(jī)制是：在高pH環(huán)境下，CodY蛋白與尿素酶基因ureⅠ啟動(dòng)子（promoter of ureaseⅠ，pureⅠ）結(jié)合，阻遏下游基因表達(dá)；在低pH環(huán)境下，CodY蛋白從pureⅠ上解離，啟動(dòng)下游基因表達(dá)[6]。綠色熒光蛋白（green fluores-cence protein，GFP）常作為報(bào)告基團(tuán)，用于監(jiān)控細(xì)胞組織動(dòng)態(tài)變化、基因表達(dá)、蛋白定位等[8]。本研究擬將pureⅠ與GFP編碼基因gfp連接并轉(zhuǎn)入變異鏈球菌中，構(gòu)建變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)，從而原位指示變異鏈球菌所處環(huán)境的pH狀態(tài)，以準(zhǔn)確探討菌斑生物膜中原位pH的動(dòng)態(tài)變化。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌-變異鏈球菌穿梭載體pDL278（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、SacⅠ和SalⅠ，T4 DNA連接酶（Takara公司，日本），KOD-Plus DNA聚合酶（Toyobo公司，日本）；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、柱式質(zhì)粒小量抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純?cè)噭?。?shí)驗(yàn)引物合成及DNA序列測(cè)定由上海生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 菌種和培養(yǎng)基

唾液鏈球菌57.I、變異鏈球菌UA159、含有GFP編碼基因gfp的變異鏈球菌菌株（四川大學(xué)口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存），大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞（北京天根生化科技有限公司）；腦心浸液（brain heart infusion，BHI）培養(yǎng)基及LB（Luria-Bertani）培養(yǎng)基（Sigma公司，美國(guó)）。50%BHI培養(yǎng)基配制方法：將BHI培養(yǎng)基與無(wú)菌水等體積混合，調(diào)節(jié)pH=7.5，使用0.22 μm孔徑濾器過(guò)濾。

1.3 引物

根據(jù)唾液鏈球菌基因組序列設(shè)計(jì)并合成pureⅠ特異性引物，其中上游引物包含SacⅠ的限制性酶切位點(diǎn)，下游引物包含BamHⅠ的限制性酶切位點(diǎn)；根據(jù)Clonetech公司的pGFP載體序列設(shè)計(jì)并合成gfp基因特異性引物，其中上游引物包含BamHⅠ的限制性酶切位點(diǎn)，下游引物包含SalⅠ的限制性酶切位點(diǎn)。引物序列如表1所示。

表 1 pureⅠ和gfp基因特異性引物Tab 1 Gene-specific primers for pureⅠand gfp

1.4 目的基因的擴(kuò)增

將唾液鏈球菌及含有GFP編碼基因gfp的變異鏈球菌菌株分別接種于BHI培養(yǎng)基瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)（體積分?jǐn)?shù)10%H2，5%CO2及85%N2）培養(yǎng)24 h。挑取單菌落于BHI液體培養(yǎng)基中增菌過(guò)夜。4 000 r·m in-1離心10 m in收集細(xì)菌至1.5 m L EP管中。使用細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒，分別提取唾液鏈球菌以及含GFP編碼基因gfp的變異鏈球菌基因組DNA。分別以上述的DNA為模板進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增，反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 m in，進(jìn)入熱循環(huán)（98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s），共35個(gè)循環(huán)，最后68 ℃再延伸8 m in。通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA凝膠回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物中的目的基因片段。

1.5 含目的基因重組質(zhì)粒的構(gòu)建與驗(yàn)證

將擴(kuò)增得到的目的基因片段用限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ酶切并使用2%瓊脂糖凝膠電泳及DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的目的基因片段。將回收后的目的基因片段用T4 DNA連接酶16 ℃連接16 h。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行分析，并切取1 200 bp大小的條帶進(jìn)行DNA回收。以回收產(chǎn)物作為模板，pureⅠ-SacⅠ及gfp-SalⅠ作為引物，PCR擴(kuò)增融合連接體。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min，進(jìn)入熱循環(huán)（98 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 m in），共35個(gè)循環(huán)，最后68 ℃再延伸8 min。將上述融合片段與質(zhì)粒pDL278分別使用SacⅠ及SalⅠ雙酶切。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳后，使用DNA凝膠回收試劑盒回收酶切后的核酸片段。使用T4 DNA連接酶將上述兩片段在16 ℃下連接16 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含有100 μg·m L-1壯觀霉素的LB培養(yǎng)基瓊脂平板，37 ℃有氧條件下培養(yǎng)24 h，挑選陽(yáng)性克隆，增菌培養(yǎng)，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和測(cè)序驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒命名為pDL278-pureⅠ-gfp，并凍存留用。

1.6 變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)的構(gòu)建

將變異鏈球菌UA 159接種于BHI培養(yǎng)基瓊脂平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。1 d后傳代，經(jīng)涂片鏡檢及生化鑒定后，再次傳代過(guò)夜培養(yǎng)。使用BHI培養(yǎng)基將菌液稀釋20倍，厭氧條件下培養(yǎng)至吸光度OD600值為0.2。取500 μL上述菌液置于無(wú)菌EP管中，加入變異鏈球菌感受態(tài)刺激肽（competence stimulating peptide，CSP）使其終質(zhì)量濃度為1 μg·m L-1，37 ℃孵育10 m in。向上述菌液中加入pDL278-pureⅠ-gfp并使其終質(zhì)量濃度為2.5 μg·m L-1，厭氧條件下培養(yǎng)2.5 h。取100 μL菌液涂布含有1 g·L-1壯觀霉素的BHI培養(yǎng)基瓊脂平板并于厭氧條件下培養(yǎng)。48 h后挑選壯觀霉素陽(yáng)性克隆進(jìn)行增菌培養(yǎng)。使用菌液進(jìn)行PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的重組菌株加入甘油后于-80 ℃凍存。

1.7 變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)的驗(yàn)證

將重組變異鏈球菌菌株接種于含有終質(zhì)量濃度為15 g·L-1酸堿緩沖劑Pipes（Sigma公司，美國(guó)）和1 g·L-1壯觀霉素的50%BHI培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜，菌液備用。將9個(gè)滅菌后的玻璃小圓片分別置于24孔板的9個(gè)孔內(nèi)，并向其中加入2 m L上述混合培養(yǎng)液及20 μL上述菌液，37 ℃厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)14 h后，分別置于pH值為7.5、5.5、3.5的BHI培養(yǎng)基中處理1、30、60 m in。然后將各小圓片取出置于載玻片上，向小圓片中央滴加一滴無(wú)熒光鏡油，小心蓋上蓋玻片。于奧林巴斯正置熒光顯微鏡spgr-b通道下觀察上述樣本，每個(gè)樣本隨機(jī)選取5個(gè)視野并使用ImagePro-Plus計(jì)算其單位面積熒光強(qiáng)度，并使用SNK檢驗(yàn)分析組間差異。

2 結(jié)果

2.1 目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定及gfp和pureⅠ基因片段的連接

PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，在約700 bp和450 bp處分別有特異性單一PCR產(chǎn)物條帶，與預(yù)期大?。?17 bp和450 bp）一致（圖1）。將上述基因片段通過(guò)BamHⅠ酶切位點(diǎn)酶切后連接，連接產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示，在約450、700、900、1 200、1 400 bp處均可見(jiàn)清晰條帶（圖2）。其中，1 200 bp處條帶大小符合預(yù)期。回收該條帶內(nèi)DNA并將其作為模板，以pureⅠ-SacⅠ和gfp-SalⅠ為引物，行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在約1 200 bp處見(jiàn)特異性單一PCR產(chǎn)物條帶，與預(yù)期大小一致（圖3）。2.2 重組質(zhì)粒pDL278-pureⅠ-gfp的構(gòu)建和鑒定

將融合片段pureⅠ-gfp與載體pDL278通過(guò)SacⅠ及SalⅠ酶切位點(diǎn)雙酶切后連接，并將連接體系轉(zhuǎn)化入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂布?jí)延^霉素抗性平板，挑選陽(yáng)性菌落，增菌后提取質(zhì)粒。重組質(zhì)粒及其PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，約7 900 bp處可見(jiàn)特異性條帶，與預(yù)期重組質(zhì)粒大小一致（圖4），在約1 200 bp處可見(jiàn)特異性單一PCR產(chǎn)物條帶，與pureⅠ-gfp融合片段預(yù)期的大小一致（圖4）。經(jīng)過(guò)對(duì)該P(yáng)CR產(chǎn)物進(jìn)行DNA序列測(cè)定和比對(duì)，確定該融合片段的DNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列100%一致。

圖 1 gfp和pureⅠ基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 1 PCR products of gfp and pureⅠ genes

圖 2 gfp和pureⅠ基因的連接產(chǎn)物Fig 2 Connection products of gfp and pureⅠgenes

圖 3 gfp和pureⅠ基因融合片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig 3 PCR products of the connected segment of gfp and pureⅠ genes

圖 5 重組變異鏈球菌PCR驗(yàn)證產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 5 Agarose gel electrophoresis results of PCR products of recom- binant Streptococcus mutans

2.3 變異鏈球菌低pH報(bào)告菌株的構(gòu)建及鑒定

將經(jīng)驗(yàn)證的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入經(jīng)誘導(dǎo)的變異鏈球菌細(xì)胞中，涂布?jí)延^霉素抗性平板，共挑選出6株變異鏈球菌壯觀霉素陽(yáng)性克隆，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，6個(gè)樣本均在約1 200 bp處可見(jiàn)特異性單一PCR產(chǎn)物條帶，與pureⅠ-gfp融合片段預(yù)期大小一致（圖5）。

圖 4 重組質(zhì)粒及其PCR驗(yàn)證產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig 4 Agarose gel electrophoresis results of recombinant plasm ids and PCR products

2.4 變異鏈球菌低pH報(bào)告菌株感應(yīng)不同pH能力比較

為了驗(yàn)證變異鏈球菌低pH報(bào)告菌株感應(yīng)不同pH的能力，本研究分別對(duì)比了在pH值為7.5、5.5、3.5以及處理時(shí)間為1、30、60 m in時(shí)變異鏈球菌低pH報(bào)告菌株的單位面積熒光強(qiáng)度。不同pH和處理時(shí)間變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)熒光圖片見(jiàn)圖6，單位面積熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖見(jiàn)圖7。

圖 6 不同pH和處理時(shí)間變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)熒光圖 熒光顯微鏡 × 100Fig 6 The scene of the low-pH-sensing system in different pH and different processing time fluorescence microscope × 100

當(dāng)pH為7.5和5.5時(shí)，隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，單位面積熒光強(qiáng)度明顯升高（P<0.05）；當(dāng)pH值為3.5時(shí)，處理1 min與30 min單位面積熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異（P> 0.05），但均較處理60 min時(shí)低（P<0.05）。不同pH處理相同時(shí)間時(shí)，單位面積熒光強(qiáng)度隨pH值的降低而升高（圖7）。

圖 7 不同pH和處理時(shí)間變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)單位面積熒光強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖Fig 7 Fluorescence intensity statistical figure of the low-pH sensing system in different pH and different processing time

3 討論

變異鏈球菌是牙菌斑生物膜中的重要成員，該菌能夠代謝糖類產(chǎn)酸，降低局部pH，抑制其余細(xì)菌（如血鏈球菌）的生長(zhǎng)，在競(jìng)爭(zhēng)中逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌。同時(shí)變異鏈球菌具有耐酸性，可以在低pH的環(huán)境中正常生長(zhǎng)，并且產(chǎn)生更多的酸，使環(huán)境始終處于低pH狀態(tài)[9-10]。牙菌斑生物膜形成迅速且較難清除，其中的微生物代謝產(chǎn)生的乳酸等酸性物質(zhì)不易流出亦不易被唾液中和，故可造成牙菌斑底部附著牙面的局部長(zhǎng)期低pH環(huán)境[1]。齲病的發(fā)生就始于局部低pH環(huán)境造成的牙體脫礦。由此可見(jiàn)，相對(duì)于細(xì)菌本身而言，其產(chǎn)酸造成的菌斑附著表面的低pH環(huán)境才是齲病發(fā)生的直接因素。如何直觀準(zhǔn)確地反映菌斑pH顯得尤為重要。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的低pH感應(yīng)系統(tǒng)以致齲微生物——變異鏈球菌作為報(bào)告菌，可用于與齲相關(guān)的微生物及微生態(tài)研究，不帶入其他影響因素，使用范圍廣。

目前，生物膜pH的測(cè)量方法大致有以下幾種。1）接觸式電極測(cè)量法[5]：將微電極插入待測(cè)部位進(jìn)行探測(cè)。2）取樣檢測(cè)法[5]：將待測(cè)部位菌斑收集起來(lái)，再通過(guò)pH計(jì)進(jìn)行檢測(cè)。這兩種方法簡(jiǎn)單、便宜、靈活，但具有測(cè)量時(shí)會(huì)擾亂待測(cè)部位生物膜，測(cè)試時(shí)間不連續(xù)，唾液緩沖作用影響大，非原位檢測(cè)等缺點(diǎn)。3）內(nèi)在電極測(cè)量法[5]：將微電極事先置于未形成生物膜的物體表面（如義齒基托、培養(yǎng)皿底部等），然后置于患者口內(nèi)或接入細(xì)菌，即可通過(guò)無(wú)線電技術(shù)連續(xù)長(zhǎng)期地檢測(cè)pH。這種方法不擾亂生物膜的形成且為原位檢測(cè)，但其價(jià)格昂貴、操作復(fù)雜。4）pH染料法[11-12]：使用商品化的pH熒光染料對(duì)生物膜進(jìn)行染色和檢測(cè)。此方法中pH染料染色的操作易受生物膜厚度和表面粗糙程度等因素的影響，造成實(shí)驗(yàn)誤差?？傮w來(lái)說(shuō)，生物膜pH的測(cè)量方法不盡如人意，研究者們渴望尋得一種方便、廉價(jià)、連續(xù)原位測(cè)量且誤差較小的測(cè)量方法。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)，于生物膜原位檢測(cè)pH，檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，可最大程度還原生物膜局部的真實(shí)pH高低狀態(tài)，減少人為因素帶入的影響。

唾液鏈球菌尿素酶編碼基因ureⅠ的啟動(dòng)子pureⅠ酸誘導(dǎo)性強(qiáng)，機(jī)制較清楚。CodY蛋白與RNA聚合酶競(jìng)爭(zhēng)pureⅠ上的結(jié)合位點(diǎn)，而pH的高低則決定CodY蛋白與結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合與解離[6]。本課題組發(fā)現(xiàn)，變異鏈球菌中的CodY蛋白與唾液鏈球菌中的CodY蛋白高度同源，且有研究者將該啟動(dòng)子轉(zhuǎn)入格氏鏈球菌中并驗(yàn)證了該啟動(dòng)子在鏈球菌屬其他菌種中也可以正常發(fā)揮酸誘導(dǎo)特性[13]。Li等[14]的研究中展望了使用該啟動(dòng)子連接一段報(bào)告基因以制作生物膜pH探針的應(yīng)用前景。GFP具有熒光穩(wěn)定，非種屬特異，不影響細(xì)胞正常生理功能，可用于活細(xì)胞直接觀測(cè)等特點(diǎn)，其編碼基因常被作為報(bào)告基因用于啟動(dòng)子功能驗(yàn)證，報(bào)告菌株構(gòu)建，蛋白質(zhì)定位以及分泌的檢測(cè)等[8,15-17]，也曾被用于變異鏈球菌中研究gtfB基因的表達(dá)調(diào)控[18]。故本實(shí)驗(yàn)將啟動(dòng)子pureⅠ與gfp基因連接轉(zhuǎn)入變異鏈球菌中，從而構(gòu)建受環(huán)境pH調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)弱的變異鏈球菌低pH報(bào)告系統(tǒng)。該系統(tǒng)感受環(huán)境pH的受體位于核酸層面，調(diào)控精度高，從而提高了此系統(tǒng)的準(zhǔn)確性。

本研究在變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)的驗(yàn)證中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)14 h后的生物膜樣本已檢測(cè)出較弱熒光，但熒光強(qiáng)度明顯低于處理后。筆者認(rèn)為，造成此現(xiàn)象的原因可能是：1）由于變異鏈球菌代謝產(chǎn)酸，雖已使用50%BHI培養(yǎng)基降低營(yíng)養(yǎng)，并于培養(yǎng)基中加入酸堿緩沖劑Pipes，但經(jīng)檢測(cè)培養(yǎng)14 h后培養(yǎng)基仍處于弱酸性；2）質(zhì)粒在變異鏈球菌中為多拷貝狀態(tài)，而變異鏈球菌基因組codY基因?yàn)閱慰截?。變異鏈球菌產(chǎn)生的CodY蛋白不足以在接近中性pH的環(huán)境下將pureⅠ啟動(dòng)子完全阻遏，故仍可有GFP的合成。本課題組后期實(shí)驗(yàn)計(jì)劃將融合片段pureⅠ-gfp整合到變異鏈球菌基因組中，以期具有更精確靈敏的pH感應(yīng)作用。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了變異鏈球菌低pH感應(yīng)系統(tǒng)。該系統(tǒng)可在一定的范圍內(nèi)原位反映生物膜局部pH狀態(tài)，具有一定的應(yīng)用前景。同時(shí)，本研究驗(yàn)證了唾液鏈球菌尿素酶基因的啟動(dòng)子pureⅠ在變異鏈球菌中可以正常發(fā)揮酸誘導(dǎo)功能，為日后進(jìn)一步將該啟動(dòng)子應(yīng)用于變異鏈球菌基因表達(dá)調(diào)控的相關(guān)研究提供了理論基礎(chǔ)。

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（本文編輯 吳愛(ài)華）

Construction of a low-pH-sensing system in Streptococcus mutans

Kang Di, Li Yuqing, Zhou Xuedong. (State Key Laboratory of Oral Diseases, National Clinical Research Center for Oral Diseases, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

ObjectiveTo construct a low-pH-sensing system in Streptococcus mutans (S. mutans) and to visually detect the pH in situ.MethodsPromoter of ureaseⅠ(PureⅠ) and green fluorescence protein (gfp) DNA fragments were amplified by polymerase chain reaction (PCR) from the genome of Streptococcus salivarius 57.I and S. mutans containing the gfp fragment. The two amplified DNA fragments were ligated together and further integrated into pDL278 to construct the recombinant plasm id pDL278-pureⅠ-gfp. This recombinant plasm id was then transformed into S. mutans UA159 cells. Subsequently, the intensity of the optical density per unit area of the low-pH-sensing system was measured and compared under different pH conditions and different processing times.ResultsPureⅠ and gfp DNA fragments were amplified successfully with the correct molecule sizes (450 and 717 bp, respectively). The recombinant plasmid pDL278-pureⅠ-gfp was constructed and further verified by PCR and sequencing. The intensity of the optical density per unit area of the low-pH-sensing system increased with decreasing pH and increasing processing time.ConclusionA low-pH-sensing system was constructed successfully in S. mutans. Our research verified that pureⅠ of Streptococcus salivarius can function well in S. mutans as an acid induced promoter, and provided a new method of detecting the pH of plaque biofilms in situ.

Streptococcus mutans; Streptococcus salivarius; green fluorescence protein; urease; promoter

R 780.2

A

10.7518/hxkq.2017.03.003

Supported by: National Natural Science Foundation of China (81430011, 31200985). Correspondence: Zhou Xuedong, E-mail: zhouxd@scu.edu.cn.

2016-10-25；

2016-12-12

國(guó)家自然科學(xué)基金（81430011，31200985）

康迪，博士，E-mail：juejiangkang@gmail.com

周學(xué)東，教授，博士，E-mail：zhouxd@scu.edu.cn