鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品微生物限度檢查方法學(xué)的建立

喬龍娟，王林，黃加秀，田穎，王君

鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品微生物限度檢查方法學(xué)的建立

喬龍娟，王林，黃加秀，田穎，王君

鹽酸左氧氟沙星為氧氟沙星的左旋體，其抗菌活性約為氧氟沙星的兩倍，主要作用機(jī)制為抑制細(xì)菌 DNA 旋轉(zhuǎn)酶的活性，阻礙細(xì)菌 DNA 復(fù)制，對大多數(shù)革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有較強(qiáng)的抗菌作用[1]。因其抗菌譜廣，抗菌作用強(qiáng)，維持時(shí)間長，療效高，不良反應(yīng)輕微，臨床應(yīng)用范圍廣泛[2]。

根據(jù)新版 GMP 的要求，應(yīng)當(dāng)依據(jù)所用滅菌方法的效果確定滅菌前產(chǎn)品微生物污染水平的監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)，并定期監(jiān)控[3-4]。檢驗(yàn)方法的可靠直接決定產(chǎn)品日常監(jiān)測的結(jié)果，筆者據(jù)此建立了鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品的微生物限度檢查方法，并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試品 鹽酸左氧氟沙星注射液配制液（規(guī)格：0.1 g/ml，批號：16062231、16071131、16071331）為揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)用菌種 金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢桿菌[CMCC（B）63501]、大腸埃希菌[CMCC（B）44102]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉菌[CMCC（F）98003]均來自中國菌種保藏中心。

1.1.3 稀釋液和緩沖液 0.9% 無菌氯化鈉溶液、pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液均為自制。

1.1.4 培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（批號：20160310）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（批號：20160308）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（批號：20160310）、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（批號：20160318），均由北京三藥科技開發(fā)有限公司提供。

1.1.5 儀器 ZH-2 型旋渦混合儀購自上海滬西醫(yī)療儀器廠；HTY-601 型集菌儀和全封閉集菌培養(yǎng)器均購自浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司；KB400 型恒溫培養(yǎng)箱購自德國賓得公司。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備 分別接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30 ～35 ℃ 培養(yǎng) 18 ～ 24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，20 ～ 25 ℃ 培養(yǎng) 24 ～ 48 h。上述培養(yǎng)物用 0.9% 無菌氯化鈉溶液稀釋成含菌數(shù)小于 100 cfu/ml的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 5 ～ 7 d，產(chǎn)生大量孢子，加入 3 ～ 5 ml 含 0.05%（v/v）聚山梨酯 80 的 0.9% 無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，然后吸出孢子懸液（管口帶有薄的無菌棉花過濾菌絲）至滅菌試管內(nèi)，用含 0.05%（v/v）聚山梨酯 80 的 0.9%無菌氯化鈉溶液將菌液稀釋至含 50 ～ 100 cfu/ml 的菌懸液，備用[4]。

1.2.2 需氧菌檢查方法

1.2.2.1 需氧菌檢查方法的預(yù)驗(yàn)證一 鹽酸左氧氟沙星對大多數(shù)細(xì)菌均有較強(qiáng)的抗菌作用，但對厭氧菌和腸球菌的抑菌作用較差，故采用薄膜過濾法通過沖洗液及沖洗液加中和劑的方法[5]分別對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以確定最終的驗(yàn)證方法。

試驗(yàn)組：

A：取供試液 19.9 ml 和小于 10 000 cfu 的銅綠假單胞菌菌懸液 0.1 ml 混勻，然后取上述混勻后的樣品 2 ml 至含有 100 ml pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養(yǎng)器中過濾，然后用 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液900 ml 沖洗，每次 100 ml，沖洗結(jié)束后取出濾膜，菌面朝上貼至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 30 ～ 35 ℃ 倒置培養(yǎng) 3 d，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌同法操作。

B：采用每 250 ml 含 1 ml 聚山梨酯 80 的緩沖液沖洗，其余操作同“A”。

C：采用每 250 ml 含 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的緩沖液沖洗，其余操作同“A”。

菌液組：以稀釋液代替供試液，其余按照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下 A、B、C 試驗(yàn)組方法進(jìn)行操作。

1.2.2.2 需氧菌檢查方法的預(yù)驗(yàn)證二

試驗(yàn)組：

D：取供試液 2 ml 至含有 100 ml pH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養(yǎng)器中過濾，然后用 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 900 ml 沖洗，每次 100 ml，在最后一次沖洗液中加入不大于 100 cfu/ml 的銅綠假單胞菌菌懸液，沖洗結(jié)束后取出濾膜，菌面朝上貼至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 30 ～ 35 ℃ 倒置培養(yǎng) 3 d，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌同法操作。

E：采用每 250 ml 含 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的緩沖液沖洗，其余操作同“D”。

F：采用每 250 ml 含 1 ml 聚山梨酯 80 和 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的緩沖液沖洗[6-8]，其余操作同“D”。

菌液組：以稀釋液代替供試液，按照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下D、E、F 方法進(jìn)行操作。

1.2.2.3 需氧菌檢查方法的驗(yàn)證

取 3 批進(jìn)行驗(yàn)證。

試驗(yàn)組：取供試液 2 ml 至含有 100 ml pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養(yǎng)器中過濾，然后用每 250 ml含 1 ml 聚山梨酯 80 和 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的 pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 900 ml 沖洗，每次 100 ml，在最后一次沖洗液中加入不大于 100 cfu/ml 的銅綠假單胞菌菌懸液，沖洗結(jié)束后取出濾膜，菌面朝上貼至胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 30 ～ 35 ℃ 倒置培養(yǎng) 3 d，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌及黑曲霉同法操作。

菌液組：以稀釋液代替供試液，照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作。

供試品對照組：以稀釋液代替菌懸液，照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作。

稀釋劑對照組：取試驗(yàn)菌 1 ml 至含 100 ml pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養(yǎng)器中過濾，照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作。

1.2.3 霉菌及酵母菌檢查方法

1.2.3.1 霉菌及酵母菌檢查方法的預(yù)驗(yàn)證

試驗(yàn)組：

H：取供試液 19.9 ml 和小于 10 000 cfu 的白色念珠菌菌懸液 0.1 ml 混勻，然后取上述混勻后的樣品 2 ml 至含有 100 ml pH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養(yǎng)器中過濾，用 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 200 ml沖洗，每次 100 ml，沖洗結(jié)束后取出濾膜，菌面朝上貼至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 20 ～ 25 ℃ 倒置培養(yǎng) 5 d，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。黑曲霉同法操作。

I：采用 pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 500 ml沖洗，其余操作同“H”。

菌液組：以稀釋液代替供試液，其余照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下H、I 方法進(jìn)行操作。

1.2.3.2 霉菌及酵母菌檢查方法的驗(yàn)證

取 3 批進(jìn)行驗(yàn)證。

試驗(yàn)組：取供試液 19.9 ml 和小于 10 000 cfu 的白色念珠菌菌懸液混勻，然后取上述混勻后的樣品 2 ml 至含有100 ml pH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養(yǎng)器中過濾，然后用 pH7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 200 ml沖洗，每次 100 ml，沖洗結(jié)束后取出濾膜，菌面朝上貼至沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基平板上，于 20 ～ 25 ℃ 倒置培養(yǎng) 5 d，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。黑曲霉同法操作。

菌液組：以稀釋液代替供試液，照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作。

供試品對照組：以稀釋液代替菌懸液，照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作。

稀釋劑對照組：取試驗(yàn)菌 1 ml 至含 100 ml pH 7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的集菌培養(yǎng)器中過濾，照“試驗(yàn)組”項(xiàng)下方法進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 需氧菌檢查方法的驗(yàn)證

2.1.1 需氧菌檢查方法的預(yù)驗(yàn)證一結(jié)果采用方法 A、B、C 的試驗(yàn)組在培養(yǎng) 3 d 后，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的平板上均無菌產(chǎn)生，試驗(yàn)組的回收率為0，三種方法均不適用該樣品的需氧菌檢查。

2.1.2 需氧菌檢查方法的預(yù)驗(yàn)證二結(jié)果當(dāng)試驗(yàn)組采用方法 F 時(shí)，在培養(yǎng) 3 d 后，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌的試驗(yàn)組的回收率均大于 90%（表 1）。初步判定方法 F 適用于該供試品的需氧菌檢查，故采用該方法進(jìn)行正式驗(yàn)證。

表 1 需氧菌預(yù)驗(yàn)證二結(jié)果（回收率 %）

2.1.3 需氧菌檢查方法的驗(yàn)證結(jié)果經(jīng)過 3 批樣品的驗(yàn)證，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的試驗(yàn)組回收率均在 50% ～ 200% 之間，且對應(yīng)稀釋劑對照組的回收率也符合要求（表 2）。

表 2 需氧菌驗(yàn)證結(jié)果（回收率 %）

2.2 霉菌及酵母菌檢查方法的驗(yàn)證

2.2.1 霉菌及酵母菌方法的預(yù)驗(yàn)證結(jié)果當(dāng)沖洗量分別為200、500 ml 時(shí)，白色念珠菌和黑曲霉的回收率均符合試驗(yàn)要求且相差不大（表 3）。故采用沖洗量為 200 ml 進(jìn)行正式驗(yàn)證。

表 3 霉菌及酵母菌預(yù)驗(yàn)證一結(jié)果（回收率 %）

2.2.2 霉菌及酵母菌方法的驗(yàn)證結(jié)果3 批樣品的白色念珠菌、黑曲霉的試驗(yàn)組回收率均在 50% ～ 200% 之間，且稀釋劑對照組的回收率也符合要求（表 4）。

表 4 霉菌及酵母菌驗(yàn)證結(jié)果（回收率 %）

2.3 鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品微生物限度檢查方法

需氧菌檢查：配制液進(jìn)行薄膜過濾后采用每 250 ml 含1 ml 聚山梨酯 80 和 1 ml 3 mol/L 氯化鎂溶液的 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 900 ml 沖洗，每次 100 ml。

霉菌及酵母菌檢查：配制液進(jìn)行薄膜過濾后用 pH 7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗 2 次，每次 100 ml。

3 討論

由于鹽酸左氧氟沙星有較強(qiáng)的抑菌性，單純采用薄膜過濾法不能消除其抑菌性。根據(jù)對喹諾酮類藥物化學(xué)性質(zhì)的分析，該類藥品能夠與部分金屬離子（Fe2+、Mg2+、Mn2+等）進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)形成穩(wěn)定的六元環(huán)絡(luò)合物，最終能達(dá)到消除抑菌活性的目的[6]。本文采用薄膜過濾法通過沖洗液及沖洗液加中和劑的方法分別進(jìn)行了驗(yàn)證，通過在沖洗液中添加適量的中和劑（聚山梨酯 80 和氯化鎂）能有效地消除抑菌活性。

本文將菌懸液和供試液混勻后進(jìn)行驗(yàn)證時(shí)，試驗(yàn)組的回收率始終為 0。而根據(jù)《中國藥典》（2015 版）的規(guī)定：如果供試品對微生物生長的抑制作用無法以其他方法消除，供試液可經(jīng)過中和、稀釋或薄膜過濾處理后再加入試驗(yàn)菌懸液進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)[5]。據(jù)此在最后一次沖洗液中加入符合要求的菌懸液進(jìn)行多次試驗(yàn)，確立了鹽酸左氧氟沙星注射液滅菌前已灌封樣品需氧菌、霉菌及酵母菌的微生物限度檢查方法。

聚山梨酯 80 和氯化鎂作為中和劑加入到?jīng)_洗液后，試驗(yàn)結(jié)果對菌株無影響。在制備含聚山梨酯 80 和氯化鎂的沖洗液時(shí)，建議采用將聚山梨酯 80、氯化鎂溶液與緩沖液混合均勻、分裝后進(jìn)行滅菌，用于供試品的檢測。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.016

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王林，Email：wanglin@yangzijiang.com

2017-03-11