金黃色葡萄球菌噬菌體效價測定方法的建立

魏東，謝安平，陳成，王國治

金黃色葡萄球菌噬菌體效價測定方法的建立

魏東，謝安平，陳成，王國治

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人類及動物化膿性感染的常見致病細(xì)菌，是引起燒傷患者創(chuàng)面感染的主要病原體。對于金黃色葡萄球菌感染的治療藥物，人們一直在努力探索。自從 1928 年 Fleming 發(fā)現(xiàn)青霉素，20 世紀(jì) 40 年代用于治療金黃色葡萄球菌后不久，即出現(xiàn)耐青霉素的金黃色葡萄球菌。20 世紀(jì) 50 年代，Beecham發(fā)現(xiàn)了耐青霉素酶的 β-內(nèi)酰胺類藥物甲氧西林，但僅僅幾年后，耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌（methicillin-resistan Staphylococcus aureus，MRSA）就相繼在歐洲和美國出現(xiàn)[1]。20 世紀(jì) 80 年代以后，MRSA 感染呈現(xiàn)上升趨勢，甚至引起醫(yī)院的暴發(fā)流行[2-3]。萬古霉素曾被譽為抗感染治療領(lǐng)域的“最后一道防線”，但從 1996 年至今，全球范圍內(nèi)已報道多例對萬古霉素耐藥的病例，引起醫(yī)學(xué)界的高度重視[4-5]。目前，需要一種不同于抗生素的新型金黃色葡萄球菌感染治療方法。

與傳統(tǒng)治療方法相比，噬菌體治療可避免抗生素的副作用及過敏反應(yīng)[6-7]。隨著 MRSA 等耐藥菌在醫(yī)院和社區(qū)的流行傳播，噬菌體的藥用價值再次受到人們的重視，將噬菌體的臨床研究帶入了一個新的階段[8]。對于金黃色葡萄球菌的噬菌體類治療用生物制品，其效價直接影響著制品的有效性。為此，本研究建立了金黃色葡萄球菌噬菌體效價的測定方法，為噬菌體制劑的質(zhì)量控制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 噬菌體及菌種 金黃色葡萄球菌（編號：CMCC(B) 26554）、金黃色葡萄球菌噬菌體（編號：CMCC(B)26554-P1）為中國食品藥品檢定研究院保存。

1.1.2 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、腦心瓊脂培養(yǎng)基由中國食品藥品檢定研究院培養(yǎng)基室提供；標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌比濁管由中國食品藥品檢定研究院提供；氯化鈉（NaCl）、氯化鈣（CaCl2）、三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl）、明膠購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司；硫酸鎂（MgSO4·7H2O）購于上海美興化工有限公司。

1.1.3 實驗儀器 DH6000AB 培養(yǎng)箱購自天津市泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法的比較 單層瓊脂培養(yǎng)法，取 100 μl 金黃色葡萄球菌菌液與 100 μl 適當(dāng)稀釋度的噬菌體混合，室溫吸附，混合液中加入 10 ml 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（含 0.75% 瓊脂），混勻后傾注平皿，每個稀釋度設(shè) 3 個重復(fù)，同時以宿主菌作對照。待瓊脂凝固后置37 ℃ 培養(yǎng) 16 ～ 24 h 后計數(shù)空斑，計算噬菌體原液效價，即 1 ml 原液樣品中所含侵染性噬菌體的粒子數(shù)。噬菌體效價（pfu/ml）= 噬菌斑平均數(shù) × 稀釋倍數(shù)。

雙層瓊脂培養(yǎng)的下層為營養(yǎng)瓊脂（含 1.5% 瓊脂），取100 μl 金黃色葡萄球菌菌液與 100 μl 適當(dāng)稀釋度的噬菌體混合，室溫吸附，混合液中加入 3 ml 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（含0.5% 瓊脂），混勻后將其均勻鋪滿下層營養(yǎng)瓊脂平板表面，培養(yǎng)及計數(shù)同單層瓊脂培養(yǎng)法。

1.2.2 培養(yǎng)基中氯化鈣濃度對噬菌體效價的影響 采用雙層瓊脂培養(yǎng)法，一種體系的培養(yǎng)基中不含 CaCl2，另一種體系的培養(yǎng)基鋪板之前加入 1 mol/L 的 CaCl2溶液（終濃度為 400 μg/ml），比較兩種體系中氯化鈣對噬菌體效價的影響。

1.2.3 培養(yǎng)基的選擇 采用雙層瓊脂培養(yǎng)法，一種體系使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，另一種體系使用腦心瓊脂培養(yǎng)基，比較兩種培養(yǎng)基體系對噬菌體效價測定結(jié)果的影響。

1.2.4 菌液濃度的選擇 采用雙層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)法，將金黃色葡萄球菌菌液稀釋成 5 × 109、1.5 × 109、5 × 108及1.5 × 108/ml 濃度，分別與適當(dāng)稀釋的噬菌體混合后，測定噬菌體效價。

1.2.5 吸附時間的選擇 采用雙層營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)法，將金黃色葡萄球菌菌液稀釋成 5 × 108/ml，與適當(dāng)稀釋的噬菌體混合，分別于室溫吸附 0、15 及 30 min 后，測定噬菌體效價。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用 Minitab 16 統(tǒng)計軟件，將噬菌體效價取以 10 為底的對數(shù)后進(jìn)行 t 檢驗，以 P ＜ 0.05 視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法的比較

單層瓊脂培養(yǎng)法測定的噬菌體原液效價均值為 5.5 ×107pfu/ml，雙層瓊脂培養(yǎng)法測定的噬菌體原液效價均值為2.6 × 108pfu/ml，雙層瓊脂培養(yǎng)法的測定結(jié)果高于單層瓊脂培養(yǎng)法，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.001），見圖 1。因此，選擇雙層瓊脂培養(yǎng)法進(jìn)行噬菌體效價測定。

2.2 培養(yǎng)基中氯化鈣濃度對噬菌體效價的影響

不含 CaCl2培養(yǎng)基所測定的噬菌體效價的對數(shù)均值為（8.42 ± 0.02）與含 CaCl2培養(yǎng)基結(jié)果（8.37 ± 0.12）接近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.535）。因此，選擇不含 CaCl2的培養(yǎng)基進(jìn)行噬菌體效價測定。

2.3 培養(yǎng)基的選擇

使用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基測定的噬菌體效價的對數(shù)均值結(jié)果為（8.42 ± 0.02）與腦心瓊脂培養(yǎng)基結(jié)果（8.37 ± 0.08）基本一致，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P = 0.397）。因此，選擇較為經(jīng)濟的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行噬菌體效價測定。

2.4 菌液濃度的選擇

噬菌體分別與 4 種濃度的金黃色葡萄球菌菌液混合所測定的效價結(jié)果基本一致，任何濃度組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05），見圖 2。菌液濃度過高時，所形成的噬菌斑較小，菌液濃度過低時，背景顏色過淺，均不便于觀察計數(shù)。菌液濃度為 5 × 108/ml 時，噬菌斑大小及背景顏色均適于計數(shù)。因此，選擇菌液濃度為 5 × 108/ml。

圖 1 單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法效價測定結(jié)果比較（***P ＜ 0.001）

圖 2 菌液濃度對噬菌體效價的影響

2.5 吸附時間的選擇

結(jié)果顯示，吸附 0、15 及 30 min，所測得的效價結(jié)果差異無顯著意義，見表 1。因此，選擇中間時間點，確定吸附時間為 15 min。

表 1 不同吸附時間對噬菌體效價的影響

3 討論

噬菌體是感染細(xì)菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的細(xì)菌病毒的總稱，具有抗感染治療的天生潛質(zhì)。噬菌體有溶菌作用和嚴(yán)格的種型特異性，可利用噬菌體作細(xì)菌的鑒定和分型，亦可用于防治某些傳染病[9]，特別是在耐藥細(xì)菌感染治療方面具有廣闊前景[10-11]。

本研究選取一株具有廣譜裂解特性的金黃色葡萄球菌噬菌體，建立噬菌體效價測定的標(biāo)準(zhǔn)化方法。首先，比較了單層瓊脂培養(yǎng)法與雙層瓊脂培養(yǎng)法對噬菌體效價測定結(jié)果的影響。單層瓊脂培養(yǎng)法具有操作簡便的特點[12]，但試驗結(jié)果表明，單層瓊脂培養(yǎng)法測定結(jié)果明顯低于雙層瓊脂培養(yǎng)法。因此，選擇雙層瓊脂培養(yǎng)法進(jìn)行金黃色葡萄球菌噬菌體效價測定。氯化鈣有增加細(xì)胞膜通透性的作用，有些噬菌體在制備過程及效價測定時均需要添加氯化鈣，但本研究中氯化鈣對所選取噬菌體株的效價測定無任何影響。本文還分析了可能影響噬菌體效價測定的其他因素，結(jié)果顯示培養(yǎng)基種類、菌液濃度以及吸附時間對噬菌體效價無明顯影響。

本文建立了金黃色葡萄球菌噬菌體效價的測定方法，為金黃色葡萄球菌噬菌體相關(guān)生物制品的質(zhì)量控制奠定了基礎(chǔ)。

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我會常務(wù)理事謝恬教授獲何梁何利基金科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新獎

我會常務(wù)理事謝恬教授獲得 2016 年度何梁何利基金科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新獎。這也是我國中醫(yī)學(xué)、中西醫(yī)結(jié)合學(xué)界在此次頒獎大會上唯一的獲獎?wù)摺?/p>

何梁何利基金由香港愛國金融家何善衡、梁銶琚、何添、利國偉于 1994 年創(chuàng)立，旨在獎勵中國杰出科學(xué)家，促進(jìn)科學(xué)技術(shù)進(jìn)步與創(chuàng)新，下設(shè)科學(xué)與技術(shù)成就獎、科學(xué)與技術(shù)進(jìn)步獎和科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新獎，有“中國的諾貝爾獎”之稱。20 多年來，何梁何利基金共表彰了 1147 位杰出科技工作者，以其公正性和權(quán)威性成為社會力量設(shè)立科技獎的杰出代表，中青年人才和海外歸國人員成為創(chuàng)新主要力量。

謝恬教授團隊研發(fā)成功具有自主知識產(chǎn)權(quán)的中西醫(yī)結(jié)合抗癌新藥欖香烯脂質(zhì)體以及瀕危珍稀中藥材石斛人工繁育栽培技術(shù)，并實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化推廣。該團隊設(shè)計建成全球首條脂質(zhì)體靶向制劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)線，首次把第四代藥物制劑的代表脂質(zhì)體運用于中藥并成功產(chǎn)業(yè)化。評委會認(rèn)為，“謝恬教授團隊取得了具有原創(chuàng)性的重大研究成果”，“對醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)及中醫(yī)、中西醫(yī)結(jié)合創(chuàng)新發(fā)展具有重要意義?！?/p>

據(jù)了解，欖香烯脂質(zhì)體正式投產(chǎn)后已使國內(nèi)外 70 多萬癌癥患者受益，目前平均每年國內(nèi)有 3 萬名左右患者使用該藥。中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院、中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)北京中醫(yī)院等國內(nèi)多家腫瘤醫(yī)院已通過臨床研究證明，欖香烯脂質(zhì)體的療效不亞于化療，而且沒有化療藥的毒副作用。

2013 年，欖香烯脂質(zhì)體榮獲中國優(yōu)秀發(fā)明專利獎，謝恬教授團隊還歷經(jīng) 8 年多時間在美國、英國、法國、德國、荷蘭、意大利等歐美國家成功獲得了欖香烯脂質(zhì)體發(fā)明專利。接下來，他們還準(zhǔn)備在這些國家做研究注冊新藥，造福全世界更多癌癥患者。（信息來源：杭州師范大學(xué)）

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.014

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室/衛(wèi)生部生物技術(shù)檢定方法及其標(biāo)準(zhǔn)化重點實驗室

王國治，Email：vaccine2012@126.com

2017-03-07