新穎糖基轉移酶對抗菌藥物金霉素的糖基化修飾

戴舒遠，趙錫澍，解可波，王霞，戴均貴

新穎糖基轉移酶對抗菌藥物金霉素的糖基化修飾

戴舒遠，趙錫澍，解可波，王霞，戴均貴

目的發(fā)掘新穎糖基轉移酶并對金霉素進行糖基化修飾。

方法對來源于木立蘆薈的重組糖基轉移酶進行金霉素糖基化功能篩選，發(fā)現(xiàn)重組 AaGT1 能催化金霉素與葡萄糖糖基供體進行反應。放大反應液經乙酸乙酯萃取去除未反應底物，剩余含糖基化產物的水相部分采用反相半制備 HPLC技術進行分離純化。通過質譜和核磁共振波譜等技術對產物結構進行鑒定；對底物與糖基化產物的水溶性進行測定，并評價兩者抑菌活性。

結果糖基轉移酶 AaGT1 催化金霉素獲得兩個金霉素異構體的糖基化產物，異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷和 4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷。異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷的水溶性是鹽酸金霉素水溶性的 3.3 倍；糖基化產物對金黃色葡萄球菌沒有明顯的抑制活性。

結論糖基轉移酶 AaGT1 對金霉素能夠進行糖基化，產物異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷和 4-差向異金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷均為新化合物，對底物進行糖基化修飾能提高其水溶性。

金霉素； 糖基化； 糖基轉移酶； 木立蘆薈

糖基化（glycosylation）是自然界廣泛存在的重要化學修飾反應，很多活性天然產物或藥物均具有糖基。糖基的存在對其水溶性、毒副作用和藥理活性往往會產生重要影響[1]。在天然或非天然苷元上引入糖基，進而提高化合物的成藥性，為新穎糖苷類藥物的發(fā)現(xiàn)帶來了希望[2]。因此，糖基化修飾已作為合成活性糖苷類化合物的有效策略而被廣泛應用在藥物研究領域。天然糖苷類化合物的糖基是由糖基轉移酶（glycosyltransferase）催化引入的。糖基轉移酶能夠將多種單糖由供體分子轉移到受體分子上，形成相應的糖苷類化合物。糖基轉移酶催化的酶法糖基化具有反應條件溫和、環(huán)境友好、步驟簡潔、具有位置和立體選擇性及效率高等優(yōu)點[3]。因此，糖基轉移酶在活性化合物的糖基化修飾中具有廣闊的應用前景。

金霉素（chlortetracycline）是一種四環(huán)素類抗生素，抗菌譜與其他四環(huán)素類抗生素相似，目前藥物劑型主要是軟膏。臨床上用于治療沙眼、細菌性結膜炎、麥粒腫及細菌性眼瞼炎等疾病的治療。但金霉素水溶性較差且毒副作用大，用藥后可引起諸多不良反應[4]，所以金霉素在臨床上應用存在諸多限制。正因如此，我們嘗試對金霉素進行糖基化結構修飾以克服上述缺陷，改善其臨床使用效果。

本文通過對木立蘆薈（Aloe arborescens）轉錄組注釋的 6 個候選糖基轉移酶基因（AaGT1 ～AaGT6）的外源表達及催化活性篩選，發(fā)現(xiàn)其中糖基轉移酶 AaGT1 可對金霉素進行糖基化反應。通過放大酶促反應分離制備得到 2 個糖基化產物，并對糖基化產物進行了水溶性及抑菌活性測試。這些結果為后續(xù)金霉素的糖基化修飾研究提供了實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體 pET-28a 購自美國 Invitrogen 公司；宿主細胞 Transetta 購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 儀器 1-14、3K15、3K18 和 8K 高速離心機為德國 Sigma 公司產品；培英 HYG-A 恒溫搖床為江蘇太倉儀器廠產品；ZX-TJS 無菌工作臺為上海整新電子設備公司產品；SHH-W21-420 三用電熱恒溫水箱為北京長風儀器產品；MLS-3750 S Labo-Autoclave 型全自動蒸汽消毒鍋、MDF-382E型超低溫冰箱為日本 Sanyo 公司產品；Bencbtop K冷凍干燥機為美國 Vir Tis 公司產品；1200 分析型高效液相系統(tǒng)為美國 Agilent 公司產品；Dionex Ultimate 3000 型高效液相色譜儀、LCQ Fleet 離子阱質譜儀為美國 Thermo 公司產品；分析型色譜柱Shiseido spolar C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）為日本 Shiseido 公司產品；反相半制備色譜柱 YMC Triart C18（250 mm × 10 mm，5 μm）為日本 YMC公司產品；VNS-400、VNS-600 型核磁共振波譜儀為美國 Varian 公司產品。

1.1.3 試劑 HPLC 檢測用色譜級甲醇、甲酸及供體化合物尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）購自美國 Sigma 公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化鈉 10 g，蒸餾水定容至 1 L，使用前 121 ℃ 滅菌 20 min。

1.2 方法

1.2.1 糖基轉移酶表達系統(tǒng)的構建及誘導表達 來源于蘆薈的糖基轉移酶基因 AaGT1 ～AaGT6 連接表達載體 pET-28a，經測序驗證后轉化表達宿主 Transetta 獲得含目的基因的重組工程菌。將重組工程菌轉接于含卡那霉素和氯霉素（終濃度分別為 50 和 34 μg/ml）的 50 ml LB 培養(yǎng)基中，37 ℃，200 r/min 條件下培養(yǎng)過夜作為種子液。

將 AaGT1 重組菌的種子液以 1∶100 的比例轉接至含卡那霉素和氯霉素（終濃度分別為 50 和34 μg/ml）的 5 L LB 培養(yǎng)基中，于 37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)至 OD600= 0.6。向培養(yǎng)液中加入誘導劑IPTG 至終濃度為 0.15 mmol/L。在 18 ℃，200 r/min搖床中繼續(xù)培養(yǎng)誘導 16 h。隨后將菌液于 4 ℃、6000 × g 離心 10 min 后棄上清培養(yǎng)基，并用蒸餾水洗滌菌體 3 次。

1.2.2 重組糖基轉移酶 AaGT1 的分離純化 按照 Hi Trap Chelating HP 操作手冊進行，為盡可能保持蛋白活力，整個純化過程在 4 ℃ 蛋白層析柜中進行，主要步驟如下：

⑴每克 AaGT1 重組菌體用 5 ml 的 binding buffer（含 0.5 mol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑的50 mmol/L 磷酸鹽緩沖液，pH 7.2）重懸，加入苯甲基磺酰氟（PMSF，終濃度為 1 mmol/L）和溶菌酶（終濃度為 1 mg/ml），混勻后超聲破碎菌體。

⑵菌體破碎后，于 4 ℃、10 000 × g 條件下離心 60 min，取上清（粗酶液）用 0.45 μm 濾膜過濾后上樣于 binding buffer 平衡后的鎳柱（Ni-NTA）進行親和層析純化。流速為 1 ml/min，分別用含100、250、500 mmol/L 濃度咪唑的 elution buffer（除咪唑濃度不同外，其他成分與 binding buffer相同）進行梯度洗脫。洗脫液經脫鹽后，利用SDS-PAGE 檢測目的蛋白。

1.2.3 糖基轉移酶催化活性篩選 糖基轉移酶活性初篩反應體系：重組 AaGT1 ～ AaGT6 粗酶液198 μl、50 mmol/L 鹽酸金霉素1 μl、100 mmol/L UDP-Glc 1 μl。在 30 ℃ 水浴條件下，反應 12 h 后，加入 400 μl 的甲醇終止反應，振蕩混勻，15 000 × g離心 30 min。利用 HPLC-UV/MS 對糖基轉移酶的催化活性進行初步判斷。

HPLC-MS 分析由 Agilent 1200 液相系統(tǒng)串聯(lián) Thermo LCQ Fleet 離子阱質譜儀完成，柱后分流比為 2∶1。流動相 A 為甲醇，流動相 B 為 0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫。梯度條件：A∶B（v/v）1∶9→ 9∶11，30 min；流速 1 ml/ min；柱溫 30 ℃；進樣量 20 μl；在 254 nm 波長下檢測。

ESI 源優(yōu)化參數：鞘氣流速 20（任意單位）；輔助氣流速 5（任意單位）；噴霧電壓 5000 V；毛細管溫度 350 ℃；碰撞誘導解離電壓 35 V。

1.2.4 金霉素糖基化產物的制備及結構鑒定 分別稱取 28 mg 鹽酸金霉素（溶解于 200 μl DMSO）、64 mg UDP-Glc（溶解于 1 ml 蒸餾水）。將純化的酶液與上述兩者混合均勻，用 pH7.4 的 Tris-HCl將反應體系定容至 50 ml，混勻后放入 30 ℃ 水浴鍋中，反應 16 h 后以兩倍體積的乙酸乙酯萃取5 次，有機相減壓蒸干（經 HPLC-UV 檢測僅有微量的轉化產物）。將殘余水相減壓蒸干后，加入 5 ml甲醇超聲提取 15 min，離心后將上清液進一步濃縮至 2 ml，0.22 μm 濾膜過濾后，使用甲醇/0.1% 甲酸水溶液為流動相通過反相半制備系統(tǒng)對糖基化產物及底物進行分離純化，梯度洗脫條件為甲醇∶0.1% 甲酸水溶液（1∶9 → 1∶1，v/v，30 min）；254 nm 下檢測，流速 3 ml/min。將糖基化產物及底物流份經減壓蒸餾及冷凍干燥后，得到化合物4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（7.2 mg，tR= 14.4 min）、異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（8.0 mg，tR= 17.7 min）、差向異金霉素（4.0 mg，tR= 22.2 min）和異金霉素（4.2 mg，tR= 26.0 min）。

1.2.5 水溶性實驗

1.2.5.1 鹽酸金霉素的標準曲線的繪制 將鹽酸金霉素分別配成 512、256、128、64、32、16 μg/ml濃度，用于 HPLC 分析，進樣體積為 10 μl，每個濃度重復 3 次，在 370 nm 波長下，測定吸收峰的面積。然后根據峰面積與進樣質量得出回歸方程：y = 0.0191x – 1.5328（r = 99.93%），y 為峰面積，x 為進樣質量（ng）。

1.2.5.2 異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷標準曲線的繪制 將該化合物分別配成 900、600、400、200、100 μg/ml 濃度，用于 HPLC 分析，進樣體積為 10 μl，每個濃度重復 3 次，在 254 nm 波長下，測定吸收峰的面積。然后根據峰面積與進樣質量得出回歸方程：y = 0.0011x + 0.41（r = 99.89%），y 為峰面積，x 為進樣質量（ng）。

1.2.5.3 待測化合物的溶解度測定 將 200 μl蒸餾水加入到過量的鹽酸金霉素、異金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷中形成懸濁液，室溫下超聲 1 h。9000 × g 離心 10 min，取 100 μl 上清液，分別用甲醇稀釋至 1、2 ml，用于 HPLC 分析，進樣量為10 μl，重復 3 次，在 370 與 254 nm 波長下測定吸收峰的面積。根據回歸方程得出溶解質量，然后計算得出溶解度。

圖 1 AaGT1 催化金霉素糖基化反應[A：HPLC-UV 分析空白對照組（A1）、催化反應體組（A2）；B：糖基化產物峰 3a 與2a 以及非酶促反應底物峰 3 與 2 對應的 ESI-MS譜圖]Figure 1 Glycosylated chlortetracycline by AaGT1 [A: HPLC-UV analysis of blank control (A1), catalytic reaction (A2); B: ESI-MS spectra of glycosylated products 3a, 2a and non-enzymatic reaction substrates 3, 2]

2 結果

2.1 蘆薈糖基轉移酶對金霉素糖基化的活性篩選

為獲得能夠對金霉素進行糖基化修飾的糖基轉移酶，以 UDP-Glc 為供體，金霉素為受體，對6 個重組酶的粗酶液進行催化活性的篩選。經HPLC-UV/MS 檢測發(fā)現(xiàn)，6 個重組糖基轉移酶中只有 AaGT1（Genbank 序列號 KY293674）對金霉素表現(xiàn)出較高的糖基化活性（圖 1）。比較底物與轉化產物一級質譜，發(fā)現(xiàn)轉化產物的分子量較底物的分子量增加 162，因此推測轉化產物為底物金霉素引入一個葡萄糖基團。

從圖 1 的 HPLC-UV/ESI-MS 圖可以看出，金霉素（1）在糖基轉移酶 AaGT1 的催化下，出現(xiàn)兩個分子量增加 162 的糖基化產物峰（2a、3a）和兩個非酶促反應底物峰（2、3），并且底物峰的保留時間以及紫外吸收光譜均與鹽酸金霉素（1）有差異。非酶促反應底物（2、3）的分子量與金霉素一致，說明底物可能為金霉素的同分異構體。兩個糖基化產物的紫外吸收光譜與底物的紫外吸收光譜一致，因此推測兩個糖基化產物為金霉素同分異構體（2、3）的糖基化產物。

2.2 糖基化產物的制備及結構鑒定

為進一步確定糖基化產物的結構，通過反相半制備 HPLC 分離純化得到 4 個化合物，依據紫外吸收光譜和核磁數據[5–7]，4 個化合物分別鑒定為異金霉素（2）、異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（2a）、4-差向異金霉素（3）、4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（3a）。其中，化合物 2a、3a 為新化合物。

根據高分辨質譜，化合物 2a 的分子式被確定為 C28H33ClN2O13，分子量為 640（m/z 641.1720 [M + H]+，計算值為 641.1713），相比底物異金霉素的分子量（478）增加了 162；與其底物的1H-NMR 譜圖相比，2a 的1H-NMR 譜圖（表 1）多了 1 個端基氫 δH5.22、6 個連氧氫 δH3.17-3.65 的一組葡萄糖質子信號；2a 的13C-NMR譜圖（表 1）比底物多了化學位移值在 δC60.5、69.4、73.1、76.6、77.2、99.3 的 6 個連氧碳，由于 δC99.3 是葡萄糖端基碳的典型信號，因此可判斷化合物 2a 是在異金霉素苷元上引入了一分子葡萄糖的糖基化產物。HMBC 譜可觀察到 H-1'（δH5.22）與 C-10（δC155.0）相關，表明該葡萄糖基團連在苷元的 10-OH上。端基質子的偶合常數 J = 7.2 Hz，表明形成的糖苷鍵為 β 構型。因此，化合物 2a 的結構被確定為異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷。

與化合物 2a 相似的結構解析過程，化合物 3a被確定為 4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷。

2.3 金霉素及其糖基化產物可能的轉化過程

根據 HPLC-UV 分析結果，推測金霉素在AaGT1 酶反應液的作用下可能的轉化途徑（圖 2）。由于 C7位含氯原子時，金霉素在弱堿性條件下，快速水解為異金霉素。異金霉素在水溶液中產生可逆的差向異構作用，生成差向異金霉素[8]。兩者在AaGT1 酶的催化作用下，生成糖苷類化合物 2a、3a。我們還觀察到化合物 2a、3a 在含水溶劑中可相互轉化。

表 1 化合物 2a 與 3a 核磁共振波譜數據Table 1 1H-NMR and13C-NMR data of compounds 2a and 3a

2.4 金霉素與糖基化產物 2a 的水溶性比較

由于葡萄糖分子具有較大極性，苷元上引入葡萄糖基會增加其水溶性[9]。水溶性測試結果表明，糖基化的產物異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（2a）的水溶性為鹽酸金霉素的 3.3 倍（表 2），顯示糖基的引入有增加苷元水溶性的作用。

2.5 抑菌生物活性評價

將鹽酸金霉素以及化合物 2、3、2a、3a 進行抑制金黃色葡萄球菌的活性篩選，遺憾的是，除鹽酸金霉素外，化合物 2、3、2a、3a 均無明顯的抑菌活性。

圖 2 金霉素轉化成化合物 2a 與 3a 的可能過程Figure 2 Possible transformation process of chlortetracycline to compounds 2a and 3a

表 2 鹽酸金霉素（1）、異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷（2a）的水溶性Table 2 Water solubility of chlortetracycline hydrochloride (1) and iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside (2a)

3 討論

本研究首次利用糖基轉移酶對金霉素進行糖基化研究，并獲得了兩個糖基化產物，異金霉素10-O-β-D-葡萄糖苷與 4-差向異金霉素 10-O-β-D-葡萄糖苷，表明酶法糖基化四環(huán)素類是一條可行路線。由于金霉素在酶反應液中穩(wěn)定性較差，如何在保持金霉素的穩(wěn)定性和酶的活性基礎上完成金霉素糖基化反應，是下一步實驗需要解決的關鍵問題。金霉素異構體的糖基化產物有無除抑菌外的其他藥理活性，需我們進一步研究。

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Enzymatic glycosylation of antibiotics chlortetracycline by a new glycosyltransferase

DAI Shu-yuan, ZHAO Xi-shu, XIE Ke-bo, WANG Xia, DAI Jun-gui

ObjectiveTo mine novel glycosyltransferase with the ability to glycosylate antibiotics chlortetracycline.

MethodsAfter preliminarly sreening, glycosyltransferase AaGT1 from A. arborescens was found to be capable of glycosylating chlortetracycline. AaGT1 was utilized to catalyze the glycosylation of chlortetracycline with uridine diphosphate glucose. To remove the unreacted chlortetracycline, the reaction solution was extracted with EtOAc for five times. And the rest aqueous phase was dried by removal of water under reduced pressure, then purified by semi-preparative reversed-phase HPLC. The structures of glycosylated products were determined by HRMS and NMR spectroscopic data analysis. In addition, water solubility of glycosylated product and substrate were measured, and their antibacterial activities were evaluated.

ResultsTwo glycosylated products were obtained and identified as iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside and 4-epi-iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside. The solubility of iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside in water was increased by 3.3 times compared with that of chlortetracycline hydrochloride. However, the glycosylated products showed no significant antibacterial activity against Staphylococcus aureus.

ConclusionIso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside, 4-epi-iso-chlortetracycline 10-O-β-D-glucoside are novel compounds, and glycosylation of drugs may increase their water solubility.

Chlortetracycline; Glycosylation; Glycosyltransferase; Aloe arborescens

DAI Jun-gui, Email: jgdai@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2017.03.005

國家自然科學基金（81602999）

100034 北京市第三十五中學（戴舒遠、趙錫澍、王霞）；100050 北京，中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院藥物研究所（解可波、戴均貴）

戴均貴，Email：jgdai@imm.ac.cn

2016-12-09

www.cmbp.net.cn 中國醫(yī)藥生物技術, 2017, 12(3):221-226

Author Affiliations: Beijing No. 35 High School, Beijing 100034, China (DAI Shu-yuan, ZHAO Xi-shu, WANG Xia); Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (XIE Ke-bo, DAI Jun-gui)

www.cmbp.net.cn Chin Med Biotechnol, 2017, 12(3):221-226