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    高靈敏檢測葡萄糖的新型熒光納米傳感器

    2017-06-15 23:31:44李愛琴郭唱許蘇英
    分析化學(xué) 2017年6期
    關(guān)鍵詞:過氧化氫葡萄糖血清

    李愛琴+郭唱+許蘇英

    摘 要 構(gòu)建了一種用于高靈敏檢測葡萄糖的新型熒光納米傳感器。在辣根過氧化物酶(HRP)的催化下,H2O2氧化3,3′,5,5′四甲基聯(lián)苯胺(TMB),生成具有強(qiáng)吸光性質(zhì)的TMB多聚體,導(dǎo)致1氧1H非那烯2,3二腈(1Oxo1Hphenalene2,3dicarbonitrile, OPD)分子的熒光發(fā)生淬滅,基于此實(shí)現(xiàn)H2O2的定量檢測,線性范圍分別為0.05~0.80 μmol/L和1~10 μmol/L,檢出限(3 )為0.02 μmol/L。由于葡萄糖氧化酶(Gox)可催化葡萄糖分解產(chǎn)生H2O2,基于此可以實(shí)現(xiàn)葡萄糖分子的定量檢測,線性范圍分別為0.1~3.0 μmol/L和4.0~30 μmol/L, 檢出限(3 )為0.02 μmol/L。將本方法用于實(shí)際血清樣品中葡萄糖的定量檢測,結(jié)果與臨床檢測結(jié)果相符。

    關(guān)鍵詞 有機(jī)熒光探針; 熒光傳感器; 過氧化氫; 葡萄糖; 血清

    1 引 言

    近年來,由于生活水平的提高、飲食結(jié)構(gòu)的改變以及不良生活方式等因素,糖尿病在全球的發(fā)病率迅速增長,在中國更呈現(xiàn)爆發(fā)式增長。靈敏、快速、準(zhǔn)確地測定血液中的葡萄糖含量是診斷、治療以及控制糖尿病發(fā)展的重要環(huán)節(jié),具有非常重要的意義[1~3]。目前,臨床檢測葡萄糖的主要方法為生化酶檢測法,包括己糖激酶法(HK)和葡萄糖氧化酶法(GOD)法[4~6]。如Liu等[4]通過制備上轉(zhuǎn)換發(fā)光納米探針并利用GOD法,實(shí)現(xiàn)過氧化氫和葡萄糖的高靈敏檢測;夏暢等[6]將石墨烯量子點(diǎn)銀納米顆粒復(fù)合物用于葡萄糖的比色檢測。近年來,文獻(xiàn)報(bào)道了很多葡萄糖檢測方法,如基于小分子傳感探針、電化學(xué)測定法、高效液相色譜法以及毛細(xì)管電泳法等[7,8]。熒光法因具有靈敏度高、檢出限低等優(yōu)點(diǎn),受到廣泛關(guān)注。作為一種靈敏的有機(jī)熒光分子,1氧1H非那烯2,3二腈(1oxo1Hphenalene2,3dicarbonitrile, OPD)的發(fā)射波長在600 nm的紅光范圍內(nèi), 同時(shí)具有雙光子成像能力[9~12]。Zhang等[12]報(bào)道了基于OPD芳香取代反應(yīng),用于細(xì)胞內(nèi)半胱氨酸的高靈敏識(shí)別的研究?;贠PD的優(yōu)良熒光特性,本研究利用雙親高分子包覆OPD分子制備在水相體系中具有良好穩(wěn)定性的熒光納米顆粒,將其用于葡萄糖識(shí)別體系中,從而建立了高靈敏的葡萄糖響應(yīng)OPD熒光納米傳感器,并考察了其檢測性能。

    2 實(shí)驗(yàn)部分

    2.1 儀器與試劑

    F4600熒光光譜儀(日本日立公司);UV3600紫外光譜儀(日本島津公司);JEM 1200EX透射電子顯微鏡(日本電子株式會(huì)社)。

    蒽醌(95%)、丙二腈(99%)購自百靈威科技有限公司;有機(jī)溶劑如無水乙腈、氯仿等購自北京化學(xué)試劑公司;聚琥珀酰亞胺(PSI)購自石家莊德賽化工有限公司;辣根過氧化物酶(HRP)購自上海紫一試劑廠;3,3′,5,5′四甲基聯(lián)苯胺(TMB)與葡萄糖氧化酶(Gox)購自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社。人血清來自陸軍總醫(yī)院。除特別標(biāo)注外,所有試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水。

    2.2 實(shí)驗(yàn)方法

    2.2.2 油胺接枝聚琥珀酰亞胺功能高分子(PSIOAm)的合成[14] 合成路線如圖1B所示。將0.6 g PSI在加熱條件下溶于32 mL DMF中,加入1.95 mL油胺,100℃反應(yīng)4 h;冷卻后加入甲醇使其沉淀,離心分離,真空干燥,得到雙親功能高分子PSIOAm。

    2.2.3 熒光分子的表面修飾[14] 取9 mg PSIOAm溶于0.5 mL氯仿中,0.1 mg OPD溶于0.5 mL乙腈中,二者加入到10 mL 10 mmol/L NaOH溶液,超聲乳化。PSIOAm在堿性條件下發(fā)生水解,原有的酰亞胺環(huán)開環(huán)反應(yīng)變成親水的羧基,經(jīng)超聲乳化,形成水包油體系,有機(jī)疏水納米顆粒表面包覆一層雙親高分子。在45℃蒸去氯仿,得到均一穩(wěn)定的熒光納米顆粒溶液(OPD@PSIOAm)。

    2.2.4 H2O2的檢測體系 將50.0 μL OPD@PSIOAm溶液、50.0 μL TMB溶液(1.0 mg/mL)、50.0 μL HRP(1.0 mg/mL)和 100 μL不同濃度的H2O2 ( 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、15、20、30、40、50、60、70、80\,90\,100\,150和200 μmol/L)混合,補(bǔ)加0.02 mol/L NaACHAC緩沖溶液(pH 5.0)至1 mL,在37℃孵育30 min,測試熒光光譜,激發(fā)波長為500 nm。

    2.2.5 葡萄糖的檢測 50.0 μL Gox (2.0 mg/mL)加入100 μL不同濃度的葡萄糖(1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10、20、30、40、60、80、100、150、200、250、300、350和400 μmol/L), 37℃孵育10 min得溶液a。50.0 μL OPD@PSIOAm、50.0 μL TMB溶液(1.0 mg/mL)、50.0 μL HRP溶液(1.0 mg/mL)和150 μL上述溶液a混合,補(bǔ)加NaACHAC緩沖溶液至1 mL。混合溶液在37℃孵育30 min,測定熒光光譜。

    2.2.6 血清中葡萄糖含量的檢測 血清樣本用20.0 mmol/L PBS溶液(pH 7.4)稀釋50倍。100 μL稀釋的血清、50 μL Gox溶液(2.0 mg/mL)的混合溶液在37℃孵育10 min,得到溶液b。50.0 μL OPD@PSIOAm、 50.0 μL TMB溶液(1.0 mg/mL)、 50.0 μL HRP (1.0 mg/mL)和150 μL上述溶液b混合,補(bǔ)加NaACHAC緩沖溶液至1 mL, 在37℃孵育30 min,進(jìn)行熒光測試。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 OPD@PSIOAm納米探針制備與表征

    OPD有機(jī)熒光分子在水中溶解度較小,為了提高其水溶性,使用超聲乳化法[14]將OPD包裹,形成水溶性納米探針OPD@PSIOAm。透射電鏡表征(圖1C)表面,此顆粒尺寸約為60 nm;測定了其熒光光譜,發(fā)現(xiàn)所形成的OPD@PSIOAm納米顆粒與OPD分子的熒光性質(zhì)一致,如圖1D所示,在最大激發(fā)波長500 nm條件下,OPD與納米探針OPD@PSIOAm均會(huì)發(fā)出最大發(fā)射波長為567 nm的熒光,說明經(jīng)聚合物修飾不會(huì)顯著影響有機(jī)小分子OPD的熒光性質(zhì)。

    3.2 OPD熒光納米探針檢測H2O2和葡萄糖的機(jī)理和可行性分析

    葡萄糖在Gox的催化作用下可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和H2O2。在HRP存在下,H2O2可以氧化TMB,氧化態(tài)的TMB多聚體(oxTMB)可以吸收OPD納米顆粒的熒光,從而使其熒光淬滅[4,13]。在一定范圍內(nèi),其熒光強(qiáng)度和H2O2/葡萄糖的濃度成反比,通過檢測熒光強(qiáng)度可以定量分析H2O2/葡萄糖。

    測定了TMB、HRP及其混合溶液加入H2O2前后的紫外吸收光譜(圖2A)和熒光光譜(圖2B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,單獨(dú)的TMB、HRP以及TMBHRP混合溶液的吸收都很弱。當(dāng)加入H2O2后,由于H2O2具有強(qiáng)氧化性,可將TMB氧化為具有強(qiáng)吸收的oxTMB。熒光光譜結(jié)果也表明,TMB和HRP的混合液,以及H2O2自身對(duì)OPD@PSIOAm納米顆粒的熒光強(qiáng)度幾乎沒有影響,只有在TMB、HRP和H2O2同時(shí)存在的條件下,才可有效淬滅OPD@PSIOAm納米顆粒的熒光。此結(jié)果也表明在HRP催化下,H2O2氧化TMB生成的oxTMB,可有效猝滅OPD@PSIOAm的熒光,基于此可實(shí)現(xiàn)對(duì)H2O2的檢測。

    3.3 檢測時(shí)間和pH值的影響

    分別考察了檢測時(shí)間(圖3A)和pH值 (圖3B)對(duì)檢測體系的影響。TMB和HRP濃度均為1.0 mg/mL, OPD@PSIOAm 50 μL,10 μmol/L H2O2。反應(yīng)時(shí)間少于30 min時(shí),加入H2O2后,TMB轉(zhuǎn)化為具有強(qiáng)吸收的oxTMB,導(dǎo)致反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度急劇下降;反應(yīng)時(shí)間達(dá)到30 min后,熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定。故選定反應(yīng)時(shí)間為30 min??疾炝瞬煌琾H值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響,結(jié)果表明,pH值對(duì)OPD@PSIOAm熒光強(qiáng)度有一定影響。這是因?yàn)樵诓煌琾H值條件下,HRP催化活性不同,據(jù)文獻(xiàn)[4]報(bào)道,偏酸性環(huán)境下,HRP催化活性更強(qiáng)。本研究結(jié)果表明,在pH=5條件下,熒光強(qiáng)度變化最為明顯,故選擇在pH=5的條件下進(jìn)行后續(xù)的分析檢測。

    基本一致,證明本方法構(gòu)建的熒光傳感器具有潛在的應(yīng)用價(jià)值,為血糖含量的測定提供了一種較為精確的方法。

    4 結(jié) 論

    本研究基于OPD@PSIOAm熒光納米顆粒以及TMBHRPOPD體系,構(gòu)建了檢測葡萄糖的熒光傳感器,具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),可用于實(shí)際血清樣品中葡萄糖的分析檢測,為臨床檢測血糖濃度、開發(fā)高靈敏的葡萄糖濃度檢測方法提供了新思路。

    References

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    Abstract A fluorescence nanosensor based on an easily prepared fluorescent molecule, 1oxo1Hphenalene2,3dicarbonitrile (OPD), was developed for highly sensitive detection of glucose. Under the catalysis of horseradish peroxidase (HRP), 3,3′,5,5′tetramethylbenzidine (TMB) was oxidized into oxidized TMB (oxTMB) by H2O2. And the fluorescence of OPD was quenched by the intense absorption of the formed oxTMB, thus realizing effective quantitative detection of H2O2. The linear range was 0.05-0.8 μmol/L and 1-10 μmol/L respectively, with limit of detection of 0.02 μmol/L. Besides, on the basis of transformation of glucose into H2O2 through the catalysis of glucose oxidase, this nanosensor could be further exploited for highly sensitive detection of glucose. The TMBHRPOPD sensor exhibited linear range of 0.1-3.0 μmol/L and 4.0-30 μmol/L respectively for detection of glucose, with limit of detection of 0.02 μmol/L. Furthermore, it was successfully applied to the determination of glucose in real human serum and the results were in good agreement with the clinical data

    Keywords Organic fluorescent probes; Fluorescence nanosensor; Hydrogen peroxide; Glucose; Human serum

    (Received 23 November 2016; accepted 3 May 2017)

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