豬殃殃藥材質(zhì)量控制方法研究

李建晨，白偉紅，黑 靜，槐紅微

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

豬殃殃藥材質(zhì)量控制方法研究

李建晨，白偉紅，黑 靜，槐紅微

(河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北石家莊 050018)

為了修訂豬殃殃原有標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于性狀方面的內(nèi)容，有效反映和控制藥材的內(nèi)在質(zhì)量，收集了10批豬殃殃藥材，對其性狀、專屬性鑒別、檢查項、指標(biāo)成分含量進(jìn)行了研究。采用薄層色譜進(jìn)行定性鑒別，高效液相色譜法測定綠原酸的含量。研究發(fā)現(xiàn)：TLC斑點清晰，分離度好；10批樣品中水分小于13.0%，總灰分小于16.0%，酸不溶性灰分小于3.5%，醇溶性浸出物小于7.0%，綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于0.1%。結(jié)果表明：所制定的豬殃殃藥材質(zhì)量控制方法，操作簡便，重復(fù)性良好，可為豬殃殃藥材的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

中藥化學(xué)；豬殃殃；質(zhì)量控制方法；綠原酸；含量測定；高效液相色譜法

豬殃殃為茜草科植物豬殃殃Galium aparine L.var.tenerum(Gren.et Godr.)Rchb.的干燥全草，味辛，微寒，具有清熱解毒、利尿消腫、止血的功效，用于治療水腫、尿路感染、痢疾、便血尿血、跌撲損傷、癰腫疔瘡、蟲蛇咬傷等。豬殃殃為常用中藥，也為藏族習(xí)用藥材，資源豐富，全國各地均產(chǎn)。有關(guān)豬殃殃的內(nèi)容收載于《中華人民共和國藥典》(1977年版)和《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1994年版)，但標(biāo)準(zhǔn)中涉及的內(nèi)容較少，僅規(guī)定了其性狀特征，沒有藥材的專屬性鑒別、檢查項與含量測定項，不能有效地反映和控制藥材的內(nèi)在質(zhì)量[1-4]。

本文擬修訂豬殃殃原有標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于性狀方面的內(nèi)容，制定藥材的顯微鑒別、薄層鑒別以及含量測定方法，同時增加檢查項(水分、總灰分、酸不溶性灰分)及浸出物的測定，制定完善的豬殃殃藥材質(zhì)量控制方法，更好地對豬殃殃藥材進(jìn)行質(zhì)量控制[5-12]。豬殃殃藥材中主要含苯丙素類、黃酮類和環(huán)烯醚萜類成分，其中的苯丙素類化合物綠原酸具有抗菌、抗病毒、清除自由基和令中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮的作用[13]，為豬殃殃藥材的主要活性成分[14-19]。本文選取綠原酸作為定量控制的指標(biāo)成分。

1 主要儀器與藥品

Agilent 1200液相色譜儀，OLYMPUS CX22LED 顯微鏡，XP-205十萬分之一電子分析天平，AL 204 分析天平，梅特勒-托利多公司提供。

豬殃殃對照藥材，由中國食品藥品檢定研究院購得，批號為121513-200501；綠原酸對照品，由中國食品藥品檢定研究院購得，批號為110753-201415；水，廣州屈臣氏食品飲料有限公司提供；乙腈，色譜純，德國MERCK公司提供；薄層板為硅膠GF254(MERCK)。

共收集10批藥材樣品，經(jīng)河北省藥品檢驗研究院段吉平研究員鑒定為豬殃殃Galium aparine L.var.tenerum (Gren.et Godr.) Rchb.的全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品莖細(xì)長，呈方柱形，多分枝，直徑約1 mm，表面呈深褐色或綠褐色，四棱上生有倒生小刺；質(zhì)脆，易折斷，斷面中空；葉6～8枚輪生，無柄，葉片多為卷縮狀，易破碎，完整葉片展平后呈現(xiàn)為披針形或條狀倒披針形，長1～2 cm，寬0.2～0.4 cm，兩面常有刺狀毛；聚傘花序腋生或頂生，花小，易脫落；果小，常呈二半球形，深褐色或綠褐色，密生白色鉤毛；氣微，味淡。

2.2 顯微鑒別

本品粉末呈灰褐色，葉上表皮細(xì)胞壁較平直，下表皮細(xì)胞壁呈波狀彎曲，氣孔不定式；莖表皮細(xì)胞類長方形，氣孔平軸式；纖維呈束或散在，直徑13～32 μm；導(dǎo)管多為螺紋和環(huán)紋導(dǎo)管，直徑5～27 μm；非腺毛，尖端彎曲如鉤狀或形似鳥嘴，長70～440 μm，基部直徑26～110 μm。草酸鈣針晶呈束或散在，長約100 μm。詳見圖1。

圖1 豬殃殃顯微鑒別Fig.1 Powder microscopic of Galii Aparinis Herba

2.3 薄層色譜鑒別

取豬殃殃藥材粉末1 g，加入甲醇30 mL，加熱回流提取30 min，過濾，將濾液蒸干。在殘渣中加入10 mL水使之溶解，用10 mL石油醚(60～90 ℃)振搖提取，棄去石油醚層。將水層繼續(xù)用10 mL乙酸乙酯進(jìn)行振搖提取，分取乙酸乙酯層(水層備用)。將乙酸乙酯層蒸干，在殘渣中加入1 mL甲醇使之溶解，作為供試品溶液。另取豬殃殃對照藥材粉末1 g，同法制得對照藥材溶液。依照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，分別吸取上述2種溶液各3 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水(三者體積比為8∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，在紫外光(365 nm)下進(jìn)行檢視，供試品色譜與對照藥材色譜相對應(yīng)的位置顯示相同顏色的熒光斑點(見圖2 a))。

取上述備用水層溶液，加入正丁醇10 mL振搖提取，分取正丁醇層，蒸干，在殘渣中加入1 mL甲醇使之溶解，作為供試品溶液。取對照藥材備用水層溶液，同法制備對照藥材溶液。依照薄層色譜法(《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則0502)試驗，分別吸取上述2種溶液各2 μL，點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(三者體積比為12∶3∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱到斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯示相同顏色斑點(見圖2 b))。

圖2 豬殃殃藥材的薄層色譜圖Fig.2 TLC of Galii Aparinis Herba samples

2.4 檢查項及浸出物測定

以《中華人民共和國藥典》2015年版四部通則為參照，進(jìn)行檢查項(水分、總灰分、酸不溶性灰分)和醇溶性浸出物(熱浸法)的測定，結(jié)果見表1。

表1 10批樣品水分、總灰分等的測定結(jié)果

2.5 含量測定

2.5.1 色譜條件

Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相為乙腈-0.1%磷酸(二者體積比為13∶87)，流速為1.0 mL/min，檢測波長為 327 nm，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為20 μL。在上述色譜條件下，各成分分離度良好，結(jié)果見圖3。

2.5.2 對照品溶液的制備

取綠原酸對照品約10 mg，精密稱定，置于25 mL的容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，制成每1 mL約含40 μg綠原酸的對照品溶液。

2.5.3 供試品溶液的制備

將豬殃殃藥材粉碎(過3號篩)，精密稱取約1 g粉末，加入60%(體積分?jǐn)?shù)，下同)甲醇25 mL使之溶解，稱重，浸泡30 min，超聲處理(200 W，40 kHz)30 min，放冷。用60%甲醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，過濾，將續(xù)濾液作為供試品溶液。

圖3 對照品和樣品HPLC圖Fig.3 HPLC chromatograms of standard solution and sample solution

2.5.4 線性關(guān)系考察

選取80 μg/mL綠原酸對照品溶液作為儲備液，分別精密吸取綠原酸儲備液1，2，4，5，6，8 mL，加入甲醇定容至10 mL，搖勻。進(jìn)樣量為20 μL，測定峰面積，繪制關(guān)于綠原酸質(zhì)量濃度與峰面積的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=163.44X-104.02，r=0.999 5。結(jié)果表明，綠原酸在8.01～64.08 μg/mL內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.5.5 精密度試驗

取綠原酸對照品溶液20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明，其精密度良好，峰面積的RSD值為0.45%。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液(編號為Ⅷ)，室溫放置，于0，4，8，12，16，24 h依次進(jìn)樣。結(jié)果表明，供試品溶液穩(wěn)定性良好，峰面積RSD值為1.38%。

2.5.7 重復(fù)性試驗

平行取編號為Ⅷ的藥材粉末6份，每份約1 g，精密稱定，按“2.5.3”項下方法進(jìn)行處理，配制成供試品溶液，按建立的色譜條件分別進(jìn)樣。結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好，峰面積RSD值為1.21%。

2.5.8 回收率試驗

精密稱取編號為Ⅷ的豬殃殃藥材粉末9份，每份約0.5 g，精密稱定，分為3組，分別加入低(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為80%)、中(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為100%)、高(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為120%)3種不同濃度的綠原酸對照品溶液，混勻，進(jìn)樣，計算回收率，結(jié)果如表2所示，得到的RSD值為1.24%，回收率為97.71%～101.33%，符合要求。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.5.9 樣品含量測定

精密稱取各批次樣品1 g，按“2.5.3”項下的方法制備各批次藥材的供試品溶液，按建立的色譜條件分別進(jìn)樣測定，樣品含量測定結(jié)果見表3。

表3 豬殃殃含量測定結(jié)果(n=3)

3 討 論

在《中華人民共和國藥典》(1977年版)中豬殃殃藥材的原植物記載為豬殃殃Galium aparine L，而在《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1994年版)以及《江西省中藥飲片炮制規(guī)范》(2008年版)中，原植物均記載為豬殃殃Galium aparine L. var. tenerum(Gren.et Godr.)Rchb.。參照《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1994年版)，將原植物拉丁名定為豬殃殃Galium aparine L.var.tenerum(Gren.et Godr.)Rchb.。

本文修訂了藥材的性狀特征，結(jié)合對藥材的實際觀察，對《中華人民共和國藥典》(1977年版)豬殃殃性狀鑒別中葉片的刺狀毛以及果實的顏色進(jìn)行了修改：由原來的“邊緣及下表面中脈有倒生小刺”修改為“兩面常有刺狀毛”；將原來的果實顏色“綠褐色”修改為“深褐色或綠褐色”，使性狀描述更加準(zhǔn)確。制定了檢查項、浸出物、綠原酸含量的限度，利用各測定項限度，對藥材內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行更好的評價。

薄層鑒別是中藥材進(jìn)行定性鑒別的重要方法之一。本文薄層鑒別中對提取的溶劑、方法以及提取液的純化方法分別進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)甲醇作為提取溶劑時，采用加熱回流的方法能使藥材的提取更加完全。通過比較，發(fā)現(xiàn)萃取方法能夠有效除去低極性的雜質(zhì)，利用所含成分的差異，對乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位分別進(jìn)行鑒別。通過2個薄層鑒別方法的建立，能夠?qū)λ幉倪M(jìn)行更多層次和比較全面的質(zhì)量控制。

參考菊花中綠原酸的含量測定方法[20]，對豬殃殃藥材中的綠原酸進(jìn)行含量測定，流動相曾采用不同比例的乙腈-磷酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸(二者體積比為13∶87)為流動相時，得到的綠原酸色譜峰的峰形與分離度較好，同時出峰時間亦較理想，故最終選其作為流動相。通過對提取溶劑、提取方法及提取時間的考察，確定提取溶劑采用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇，提取方法為超聲波提取，超聲時間為30 min。

本文所制定的豬殃殃藥材的質(zhì)量控制方法操作簡便，重復(fù)性良好，能夠為豬殃殃藥材進(jìn)行全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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Research on quality control method of Galii Aparinis Herba

LI Jianchen， BAI Weihong， HEI Jing， HUAI Hongwei

(School of Chemical and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang， Hebei 050018， China)

In order to revise the original Galii Aparinis Herba standard on the nature of the content, and effectively reflect and control the inherent quality of herbs，ten batches of Galii Aparinis Herba are collected. The morphology, identification, inspection and the content of target components in these crude drugs are studied. TLC method is used to identify this crude drug. The contents of chlorogenic acid in these samples are determined by HPLC. The spot of TLC is clear and well-separated. According to the measurement results of the ten samples, moisture is not more than 13.0%, total ash is not more than 16.0%, acid-insolubal ash content is not more than 3.5%, and alcohol extracts content is not less than 7.0%. The content of chlorogenic acid is above 0.1%. The results show that the set of medicinal materials quality control has the characteristics of simple operation and good repeatability, and can provide the basis for the comprehensive quality control of Galii Aparinis Herba.

Chinese medicine chemistry； Galii Aparinis Herba； quality control method； chlorogenic acid； content determination； HPLC

1008-1534(2017)03-0162-05

2017-03-07;

2017-04-24；責(zé)任編輯：張士瑩

國家“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(2014ZX09304307-002)；河北省中藥材標(biāo)準(zhǔn)研究項目

李建晨(1964—)，男，河北肅寧人，副教授，博士，主要從事天然藥物方面的研究。

E-mail:lijianchen152@hotmail.com

TQ46；R932

A

10.7535/hbgykj.2017yx03002

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