根瘤農桿菌生產(chǎn)琥珀酰多糖發(fā)酵條件的優(yōu)化

鄭素婭 弋伊 王金霞 牛延寧 賈彩鳳 金明飛 常忠義 高紅亮

摘要[目的]優(yōu)化根瘤農桿菌產(chǎn)琥珀酰多糖的發(fā)酵培養(yǎng)條件。[方法]通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化根瘤農桿菌產(chǎn)琥珀酰多糖的發(fā)酵培養(yǎng)條件。[結果]最終得到的優(yōu)化培養(yǎng)條件為：蔗糖70 g/L，酵母粉6 g/L，CaCO3 10 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.025 g/L，發(fā)酵時間4 d，種子接種量2.5%，培養(yǎng)基初始pH 7.2，發(fā)酵溫度30 ℃，搖瓶轉速250 r/min。在上述最優(yōu)方案下，根瘤農桿菌琥珀酰多糖產(chǎn)量達18.550 g/L，比其初始條件下產(chǎn)量（8.010 g/L）明顯提高。[結論]該研究為利用根瘤農桿菌生產(chǎn)琥珀酰多糖提供了理論依據(jù)。

關鍵詞根瘤農桿菌；琥珀酰多糖；發(fā)酵

中圖分類號S182文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2017）26-0015-03

Optimization of Fermentation Conditions for Succinoglucan Production by Agrobacterium tumefacien

ZHENG Suya，YI Yi，WANG Jinxia，GAO Hongliang* et al（School of Life Sciences，East China Normal University，Shanghai 200241）

Abstract[Objective] The aim was to optimize the fermentation conditions for succinoglucan production by Agrobacterium tumefacien.[Method] We optimized the fermentation conditions for succinoglucan production by Agrobacterium tumefacien through orthogonal experiment and singlefactor test.[Result] The optimal medium consisted of 70 g/L sucrose，6 g/L yeast extract，10 g/L CaCO3，1.5 g/L MgSO4 and 0.025 g/L KH2PO4，and the optimal fermentation conditions included the incubation time of 4 d，inoculum amount of 2.5%，initial pH of 7.2，culture temperature of 30 ℃ and shaking speed of 250 r/min.Under these conditions，the yield of succinoglucan from Agrobacterium tumefacien was obviously improved to 18.550 g/L，compared with the initial 8.010 g/L.[Conclusion] The study can provide reliable basis for utilizing this Agrobacterium strain to make a further research into succinoglucan and to potentially produce succinoglucan in an industrial scale.

Key wordsAgrobacterium tumefacien；Succinoglucan；Fermentation

根瘤農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）是一種革蘭氏陰性土壤桿菌[1]，屬于α-變形菌綱根瘤菌科農桿菌屬，是一種普遍存在的土壤微生物[2]。除了其在基因工程領域的廣泛應用外，早在1999年就有報道說明利用根瘤農桿菌發(fā)酵提取琥珀酰多糖[3]。琥珀酰多糖由D-半乳糖、D-葡萄糖（1∶7）八糖重復單元構成，含β-1，3、β-1，4、β-1，6糖苷鍵，是一類酸性的可溶性胞外多糖[4-5]。經(jīng)過自然發(fā)酵產(chǎn)生的或化學修飾的琥珀酰多糖具有在高溫、高壓、極端pH或高剪切作用下表現(xiàn)出高穩(wěn)定性的特性[6]，并且琥珀酰多糖具有很高的可溶性和黏性等特性，其可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等在食品[6]、醫(yī)藥[7]、化妝品[8-9]等領域廣泛應用。

據(jù)報道，琥珀酰多糖可以由根瘤菌屬、土壤桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、假單胞菌屬等屬的細菌產(chǎn)生，土壤農桿菌屬（Agrobacterium）菌株被認為最具有工業(yè)化潛力[3]，其中根瘤農桿菌有關遺傳與代謝方面的研究較多[2，10-11]。但目前關于利用根瘤農桿菌生產(chǎn)琥珀酰多糖的研究多集中于多糖結構性質[5，12-14]與菌體代謝機制[15-16]方面，而對其發(fā)酵生產(chǎn)僅有Stredansky等[17]分別進行了培養(yǎng)基優(yōu)化、相關性探究[18]和分批補料研究[3]。鑒于此，筆者對根瘤農桿菌AT01發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酰多糖的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，以提高其產(chǎn)量，為其進一步工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種。

根瘤農桿菌（Agrobacterium tumefaciens）AT01，由華東師范大學生命科學學院微生物與發(fā)酵實驗室保存。

1.1.2主要儀器。

sigma 2-16KL冷凍離心機為Sartorius公司產(chǎn)品；QUintix型電子天平（精密度0.1 mg）為Sartorius公司產(chǎn)品；SZ-CR21N型日立離心機為HITACHI公司產(chǎn)品；ZQZY-BF型全溫恒溫培養(yǎng)搖床為上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品。

1.1.3培養(yǎng)基。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g/L，牛肉膏 3 g/L，蛋白胨5 g/L，NaCl 5 g/L，玉米漿 1.5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.0。種子培養(yǎng)基：蔗糖 20 g/L，酵母粉A802 5 g/L，蛋白胨5 g/L，pH 7.0?；A發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖 50 g/L，酵母粉A902 5 g/L，CaCO3 10 g/L，pH 7.2。

1.2方法

1.2.1種子培養(yǎng)。挑取1環(huán)斜面種子接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)16 h。

1.2.2搖瓶發(fā)酵。以5%接種量將種子液接入裝有50 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，30 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)96 h。

1.2.3測定方法。

1.2.3.1發(fā)酵液的預處理。

稱取5 mL發(fā)酵液，加入20 mL蒸餾水稀釋，室溫12 000 r/min離心20 min，分離上清液和沉淀備用。

1.2.3.2琥珀酰多糖的測定。

取預處理后的發(fā)酵液上清于50 mL離心管中，加入2倍體積的95%乙醇沉淀多糖，9 000 r/min離心10 min，重復2次，取沉淀于培養(yǎng)皿上，在80 ℃烘箱中過夜烘干，稱重，測定多糖含量。

1.2.3.3生物量的測定。

取預處理后的50 mL發(fā)酵液的沉淀，加入20 mL 1 mol/L鹽酸溶液并攪拌，12 000 r/min離心10 min，加入20 mL蒸餾水洗滌菌體沉淀2次，取沉淀在錫紙上60 ℃過夜烘干，稱重，測生物量。

1.2.4單因素試驗。

1.2.4.1蔗糖濃度的初步確定。

把質量濃度為10、30、50、70、90 g/L的蔗糖添加到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照“1.2.2”方法發(fā)酵后，檢測多糖產(chǎn)量。

1.2.4.2不同種類酵母粉對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。選取A802、A902、A408、A803以及Sangon多種酵母粉按照5 g/L的濃度添加到基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中，按照“1.2.2”方法發(fā)酵后，檢測多糖產(chǎn)量。

1.2.4.3接種量對多糖產(chǎn)量的影響。對基礎發(fā)酵培養(yǎng)基分別接入1.0%、2.5%、5.0%、7.5%和10.0%種子液，按照“1.2.2”方法發(fā)酵后，檢測多糖產(chǎn)量。

1.2.4.4無機鹽對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。

在基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的NaCl或者KH2PO4或者MgSO4·7H2O后，按照“1.2.2”方法發(fā)酵后，檢測多糖產(chǎn)量和其他相關參數(shù)。

1.2.5正交試驗。

通過單因素試驗，發(fā)現(xiàn)對根瘤農桿菌產(chǎn)琥珀酰多糖影響較顯著的4個因素分別為蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4·7H2O，選取該4個因素作為正交試驗因子，以最適宜條件為參考，設置3個水平（表1），進行L9（34）正交試驗。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計所有試驗做3個平行，利用Excel和SPSS軟件對試驗結果進行分析。

2結果與分析

2.1單因素試驗初步確定發(fā)酵條件

2.1.1蔗糖濃度對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。

由圖1可知，隨著蔗糖濃度的增加，琥珀酰多糖產(chǎn)量不斷提高。當蔗糖濃度為50 g/L時，琥珀酰多糖產(chǎn)量為8.01 g/L；當蔗糖濃度為70 g/L時，琥珀酰多糖產(chǎn)量達到最高值，為9.60 g/L，之后隨著蔗糖濃度上升，琥珀酰多糖產(chǎn)量開始有所下降。這可能是當蔗糖濃度超過70 g/L時，菌體繁殖旺盛，導致發(fā)酵液中菌體濃度過高，對發(fā)酵過程中氧的消耗增加，限制了菌體產(chǎn)糖過程[19]。

2.1.2不同種類酵母粉對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。

由圖2可知，不同種類酵母粉對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響很大，即使同為A公司產(chǎn)品的不同種類酵母粉差異也很大。其中，使用A802酵母粉組分的終產(chǎn)量達14.97 g/L，Sangon的酵母粉組分產(chǎn)量達15.16 g/L，二者遠高于其他種類氮源添加組分中琥珀酰多糖產(chǎn)量。綜合產(chǎn)量和經(jīng)濟因素，最終確定最佳酵母粉種類為A802，后續(xù)試驗酵母粉均使用A802。

2.1.3接種量對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。

由圖3可知，接種量為1.0%、2.5%和5.0%時，琥珀酰多糖產(chǎn)量最高，分別為15.11、15.79和14.26 g/L，差異不顯著。之后增大接種量，琥珀酰多糖產(chǎn)量反而有所下降，這是因為過高的接種量造成基質缺乏，生長過快，進而影響產(chǎn)物合成[20]。因此，應控制接種量在1.0%～5.0%，該試驗確定接種量為2.5%。

2.1.4無機鹽對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。

文獻報道一些無機鹽也會對琥珀酰多糖的產(chǎn)量造成影響，如KH2PO4、NaCl、MgSO4等[14]。

2.1.4.1KH2PO4對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。

由圖4可知，添加不同濃度的KH2PO4對琥珀酰多糖的產(chǎn)量有一定影響。隨著KH2PO4濃度的增加，多糖產(chǎn)量逐漸增加，當KH2PO4濃度為0.050 g/L時，多糖產(chǎn)量達到最大，為17.71 g/L。當KH2PO4濃度大于0.050 g/L時，隨著質量濃度的升高產(chǎn)量逐漸下降。因此，選取0.050 g/L KH2PO4進行后續(xù)試驗。

2.1.4.2NaCl對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。

由圖5可知，隨著NaCl濃度的增加，琥珀酰多糖產(chǎn)量與無添加NaCl的對照相比逐漸減少。在微生物細胞中，Na+與K+一般互為拮抗作用，共同存在，維持滲透壓環(huán)境的穩(wěn)定，只添加NaCl可能會打破細胞本身的滲透壓平衡，不利于琥珀酰多糖的合成。

2.1.4.3MgSO4對琥珀酰多糖產(chǎn)量的影響。

由圖6可知，琥珀酰多糖產(chǎn)量隨著MgSO4濃度的增加而逐漸增加，MgSO4添加量在1.5 g/L時達到最大值，為16.49 g/L，隨后琥珀酰多糖產(chǎn)量隨著MgSO4濃度的增加略有下降。鎂是許多重要酶的激活劑和啟動器，所以其用量的選擇也非常關鍵[21]。因此，選取1.5 g/L MgSO4進行后續(xù)試驗。

2.2正交試驗確定產(chǎn)琥珀酰多糖的最優(yōu)培養(yǎng)條件單因素試驗優(yōu)化結果表明，對根瘤農桿菌產(chǎn)琥珀酰多糖影響較為顯著的4個因素分別為蔗糖、酵母粉、KH2PO4和MgSO4，選取這4個因素進行正交試驗。

由表2可知，根據(jù)極差（R）得出各因素對琥珀酰多糖產(chǎn)量影響從大到小順序為C、A、D、B，即KH2PO4、蔗糖、MgSO4、酵母粉，綜合響應的琥珀酰多糖產(chǎn)量數(shù)據(jù)，得出4個因素的最佳組合是A2B3C1D2，即蔗糖70 g/L，酵母粉6 g/L，KH2PO4 0.025 g/L，MgSO4 1.5 g/L。按照該最優(yōu)條件進行3次驗證試驗，得到琥珀酰多糖產(chǎn)量的平均值為18.550 g/L，是基礎培養(yǎng)基產(chǎn)量（8.010 g/L）的2.32倍，顯著提高了根瘤農桿菌AT01的琥珀酰多糖產(chǎn)量。

3結論

通過單因素試驗，從培養(yǎng)基主要組成探討了根瘤農桿菌產(chǎn)琥珀酰多糖的最佳條件，在此基礎上選擇對琥珀酰多糖產(chǎn)量影響較為顯著的蔗糖濃度、酵母粉濃度、KH2PO4濃度和MgSO4濃度進行L9（34）正交試驗。最終得到的最優(yōu)化培養(yǎng)條件為：蔗糖70 g/L，酵母粉6 g/L，CaCO3 10 g/L，MgSO4 1.5 g/L，KH2PO4 0.025 g/L，發(fā)酵時間4 d，菌液接種量2.5%，培養(yǎng)基初始pH 7.2，發(fā)酵溫度30 ℃，搖瓶轉速250 r/min。在該最優(yōu)方案下，根瘤農桿菌AT01琥珀酰多糖的產(chǎn)量達18.550 g/L。該結果為今后琥珀酰多糖的進一步研究奠定了基礎。

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