中成藥六味地黃丸對急性腎損傷保護作用的研究

王曦燁，李 丹，于佳琪，許 良

(內(nèi)蒙古民族大學 化學化工學院，天然產(chǎn)物化學及功能分子合成自治區(qū)重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

中成藥六味地黃丸對急性腎損傷保護作用的研究

王曦燁，李 丹，于佳琪，許 良*

(內(nèi)蒙古民族大學 化學化工學院，天然產(chǎn)物化學及功能分子合成自治區(qū)重點實驗室，內(nèi)蒙古 通遼 028042)

利用代謝組學方法研究了六味地黃丸治療慶大霉素誘導的急性腎損傷的作用機制，并將超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)技術(shù)與主成分分析(PCA)、正交偏最小二乘判別分析(OPLS-DA)相結(jié)合來研究正常組、模型組、給藥組間生物標記物的變化情況。在PCA與OPLS-DA模型中，正常組、模型組、給藥組均可明顯區(qū)分。共鑒定出17個正常組與模型組間的生物標記物，包括多種磷脂酰膽堿、鞘氨醇、植物鞘氨醇、鞘磷脂(d18∶0/16∶1(9z))、花生四烯酸。與正常組相比，鞘氨醇、植物鞘氨醇、鞘磷脂(d18∶0/16∶1(9z))、花生四烯酸的含量升高，而給藥組中這4種化合物的含量下降，因此六味地黃丸可能通過調(diào)節(jié)這4種生物標記物的含量從而達到治療慶大霉素誘導的急性腎損傷的目的。該研究為臨床上六味地黃丸治療腎損傷提供了理論依據(jù)。

六味地黃丸；急性腎損傷；慶大霉素；超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(UPLC-MS)；生物標記物

慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素，具有性質(zhì)穩(wěn)定、抗菌譜廣、殺菌力強的特點，與β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能產(chǎn)生很好的協(xié)同作用，適用于治療嚴重的復雜性細菌感染，尤其被廣泛用于革蘭陰性細菌的感染。然而，該類抗生素所引起的耳毒性、腎毒性、神經(jīng)阻斷作用和過敏反應(yīng)嚴重限制了其進一步推廣和應(yīng)用[1-3]。例如：選擇大鼠作為受試動物，若以80 mg/kg/day以上的劑量腹腔連續(xù)注射慶大霉素，10 d左右即可出現(xiàn)蛋白尿，同時血尿素氮含量升高，光鏡下可觀察到近曲腎小管上皮細胞空泡變性、壞死脫落、形成管型，提示慶大霉素已誘導產(chǎn)生了急性腎損傷[4]。因此，慶大霉素致腎損傷的作用機制研究對其臨床的合理使用具有十分重要的意義。

六味地黃丸由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉組成，具有滋陰補腎的功效，用于治療腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精、消渴等癥。大量研究表明,六味地黃丸還具有顯著的增強免疫力、抗疲勞、抗衰老、降血壓、降血糖、降血脂、促進新陳代謝及強身健體等多種功效[5]。目前，對六味地黃丸的研究主要集中于其有效成分含量測定方面[6-7]，而對于其治療急性腎損傷的機制研究則鮮見報道。

代謝組學是一門關(guān)于生物體內(nèi)源性代謝物整體及其變化規(guī)律的科學，當正常機體受到毒性物質(zhì)、代謝障礙或生理因素的影響時，代謝物的種類和濃度會發(fā)生顯著變化。目前，代謝組學方法在疾病的研究方面已有廣泛應(yīng)用[8-10]。本研究利用超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對正常大鼠、慶大霉素誘導的急性腎損傷大鼠、應(yīng)用六味地黃丸治療后大鼠的血清中內(nèi)源性小分子進行分析檢測，鑒定其結(jié)構(gòu)，并進一步推斷相應(yīng)的代謝通路，進而從代謝組學角度闡述了慶大霉素誘導的急性腎損傷的發(fā)病機制及六味地黃丸的治療機制，從而為臨床上六味地黃丸治療腎損傷提供了理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC色譜儀、xevo G-2S QTOF質(zhì)譜儀(Waters公司,Massachusetts,USA)。

甲醇、甲酸(Thermo Fisher公司，Waltham,USA)為色譜純試劑，超純水由Milli-Q系統(tǒng)(Millipore Corp,Millipore,USA)提供，硫酸慶大霉素注射液(國藥集團容生制藥有限公司)，六味地黃丸(九芝堂股份有限公司)，血肌酐、尿素氮試劑盒(Sigma-Aldrich公司,St. Louis,USA)。

1.2 色譜-質(zhì)譜條件

色譜條件：Waters Acquity BEH-C18色譜柱(50 mm×2.1 mm,1.7 μm),柱溫40 ℃，二元線性梯度洗脫：流動相：A為含0.1%甲酸的水溶液，B為甲醇。流動相梯度：0～3 min,8%～80%B；3～6 min,80%～100%B；6～8 min,100%B；8～9 min,100%～8%B；9～11 min,8%B。流速0.4 mL/min;樣品進樣量10 μL。

質(zhì)譜條件：ESI離子源，掃描范圍：m/z100～1 000,正離子模式條件下，毛細管電壓：3 000 V，錐孔電壓：40 V，離子源溫度：100 ℃，霧化溫度：400 ℃，鞘氣流速：800 L/h；負離子模式條件下，毛細管電壓：2 500 V，錐孔電壓：40 V，離子源溫度：80 ℃，霧化溫度：150 ℃，鞘氣流速：600 L/h。質(zhì)譜以亮氨酸腦啡肽作內(nèi)標，甲酸鈉校正質(zhì)量軸。

1.3 數(shù)據(jù)處理

超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用數(shù)據(jù)使用Masslynx V 4.1軟件進行峰提取、峰對齊及歸一化處理，用EZinfo 2.0軟件進行PCA、OPLS-DA分析。通過HMDB 及METLIN 等精確質(zhì)量檢索數(shù)據(jù)庫，篩選出最有可能的化合物，最終通過數(shù)據(jù)庫標準圖譜確定標志物的化學結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 急性腎損傷模型的建立與驗證

2.1.1 急性腎損傷模型的建立 24只雄性Wistar大鼠由內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院提供，體重(220±10) g，隨機分為3組，每組8只：空白對照組(CG)、慶大霉素造模組(MG)、六味地黃丸治療組(LG)。所有大鼠于實驗前1周開始適應(yīng)環(huán)境。對照組大鼠連續(xù)15 d腹腔注射生理鹽水，第16 d麻醉處死，肝門靜脈收集血清，并以3 500 r/min離心10 min，上清液于-20 ℃條件下冷凍。模型組大鼠以0.2 g/kg/day的劑量連續(xù)腹腔注射慶大霉素15 d，第16 d以相同的方式處死大鼠。給藥組大鼠除每天注射慶大霉素外,再以0.3 g/kg/day的劑量灌胃六味地黃丸，第16 d以相同的方式處死大鼠。所有的腎組織于石蠟中包埋保存。

樣品檢測前，4 ℃融化樣品，在100 μL血液樣品中加入400 μL乙腈，旋渦振蕩30 s，4 ℃條件下12 000 r/min離心10 min，上清液以0.22 μm濾膜過濾，待測。

2.1.2 組織病理學檢驗與生化參數(shù)分析 各組大鼠腎臟的外觀顯示，模型組中，腎臟發(fā)生腫脹且顏色蒼白，提示腎臟已發(fā)生了嚴重的病變；而給藥組的腎臟在外觀上與正常組極為相似，說明六味地黃丸對慶大霉素誘導的急性腎損傷確有治療作用。

各組大鼠腎臟組織的HE染色圖見圖1。從圖中可以看出，模型組中出現(xiàn)了大量的透明管型及顆粒管型細胞，提示腎小管細胞發(fā)生了壞死現(xiàn)象；而給藥組中管型細胞的數(shù)量明顯減少，說明六味地黃丸對腎小管具有一定的保護作用。

各組大鼠血液中血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)的含量結(jié)果顯示，正常組中，血肌酐、尿素氮的含量分別為(0.50±0.02) mg/dL和(22.37±0.78) mg/dL；而在模型組中，二者的數(shù)值急劇升高到(1.91±0.33) mg/dL和(91.58±11.32) mg/dL，說明腎功能出現(xiàn)衰竭；給藥后，二者含量又分別降低到(0.75±0.22) mg/dL和(37.40±3.60) mg/dL。以上結(jié)果說明六味地黃丸對腎功能具有一定的保護作用。

2.2 代謝輪廓分析

利用UPLC-Q-TOF MS 的正、負離子模式對正常組大鼠、模型組大鼠、給藥治療組大鼠進行分析，得到3 組基峰離子流色譜圖(圖2)。由圖2可見，各組大鼠的血液代謝產(chǎn)物得到了良好分離，正離子模式下的響應(yīng)信號大于負離子模式，并且檢測到的物質(zhì)多于負離子模式。在正、負離子模式下，某些對應(yīng)峰在3組色譜圖間存在著明顯差異，提示這些觀測結(jié)果可能具有統(tǒng)計學意義。

2.3 代謝差異分析

無監(jiān)督的模式識別方法——PCA分析可以反映數(shù)據(jù)的原始狀態(tài)，直觀地顯示不同樣品間的整體差異，故首先對正常組、模型組、治療組大鼠血液樣品進行PCA分析。從圖3可以看出，在正離子模式(R2X=0.872 6,Q2=0.715 2)和負離子模式(R2X=0.812 2,Q2=0.687 3)下，3組血液樣本均可明顯區(qū)分，這說明急性腎損傷造模成功，且六味地黃丸對該疾病有明顯的治療效果。

為了找到引起擴張性心肌病的潛在生物標記物，需利用有監(jiān)督的識別模式——OPLS-DA分析。有監(jiān)督的模式識別方法可以擴大組間差異，但需利用外部模型驗證方法排列實驗來證明模型的有效性。從圖4A,B可以看出，在正離子模式(R2Y=0.998 3,Q2=0.977 9)和負離子模式(R2Y=0.993 8,Q2=0.946 2)條件下，正常組與模型組大鼠的血液樣本可被明顯區(qū)分。為尋找潛在的生物標記物，采用OPLS-DA對正常組、模型組樣本數(shù)據(jù)進行了分析，得到了正、負離子模式下的S-plot圖(見圖4C，D)，在圖中，“S”曲線中的每一點代表1個變量，變量對分類的重要程度由VIP值的大小來衡量，變量離原點越遠，VIP值越大。根據(jù)VIP值(VIP>1.0)和P值(P<0.05)可篩選出潛在的生物標志物。

2.4 潛在生物標記物的分析

通過與數(shù)據(jù)庫標準圖譜比對，共確定了17種潛在的生物標記物，分別為13種磷脂酰膽堿、鞘氨醇、植物鞘氨醇、鞘磷脂(d 18∶0/16∶1(9z))、花生四烯酸(表1)。其中鞘氨醇對應(yīng)的分子離子為302.3，主要的二級碎裂離子MS2為284.6,266.5；植物鞘氨醇對應(yīng)的分子離子為318.3，主要的二級碎裂離子MS2為300.3,282.3,197.2,60.0；鞘磷脂(d 18∶0/16∶1(9z))對應(yīng)的分子離子為703.6，主要的二級碎裂離子MS2為685.7；花生四烯酸對應(yīng)的分子離子為305.2，主要的二級碎裂離子MS2為274.8,236.9,164.9,162.8。這4種化合物在模型組中的含量顯著高于正常組；大鼠經(jīng)六味地黃丸治療后，這4種物質(zhì)的含量相對于模型組又顯著降低，提示六味地黃丸可能通過影響這4種潛在生物標記物的代謝通路從而達到治療急性腎損傷的目的。與急性腎損傷相關(guān)的潛在生物標記物的信息見表1。

表1 與慶大霉素誘導的急性腎損傷相關(guān)的潛在生物標記物Table 1 Potential biomarkers related to gentamicin-induced AKI

*the content of model group compared with control group

2.5 討 論

溶酶體是真核細胞中的一種細胞器，內(nèi)含脂肪酶、蛋白酶、核酸酶、β-葡萄糖苷酶等多種水解酶，能夠分解各種內(nèi)源性的大分子物質(zhì)，如鞘磷脂、鞘氨醇、磷脂酰膽堿等[11]。長期或過量注射慶大霉素將導致其在溶酶體中的聚集，從而導致溶酶體水解功能的喪失，此時大分子物質(zhì)不會在溶酶體中分解[12]。隨著慶大霉素在溶酶體中增多，溶酶體負荷也越來越大，最終達到臨界點時破裂，這時各種水解酶從溶酶體中溢出，進而造成細胞自溶和近端腎小管的損傷[13]。

磷脂酰膽堿是細胞膜脂質(zhì)雙分子層的重要組成部分，能夠參與多種代謝過程與信號傳導。溶酶體破裂后，大量的磷脂酰膽堿釋放到血液中。然而，經(jīng)六味地黃丸治療后，這些磷脂酰膽堿的含量并未下降，說明六味地黃丸對磷脂酰膽堿這類物質(zhì)并無明顯的調(diào)節(jié)作用。溶酶體的破裂還會導致鞘磷脂、鞘氨醇、植物鞘氨醇、花生四烯酸的含量升高。鞘磷脂在細胞生長、分化、遷移、凋亡等多種過程中均能起到至關(guān)重要的作用。研究證實，鞘磷脂在體內(nèi)的累積會導致尼曼-匹克氏疾病的發(fā)生[14]。鞘磷脂代謝紊亂與腎臟老化及慢性腎病的發(fā)展有關(guān)，這些疾病會造成腎組織結(jié)構(gòu)及功能的改變，從而進一步引起腦卒、心肌梗死、心力衰竭等一系列的心腦血管疾病[15]。糖尿型腎病是糖尿病的主要微血管并發(fā)癥之一，病人血液中植物鞘氨醇、鞘氨醇的含量明顯升高，這說明糖尿型腎病與植物鞘氨醇、鞘氨醇的代謝失調(diào)具有一定的關(guān)聯(lián)性[16]。溶酶體的破裂還能夠?qū)е铝字Ｄ憠A含量的升高，而花生四烯酸是磷脂酰膽堿下游的代謝產(chǎn)物之一，含量也隨之升高?；ㄉ南┧崮軌蜻M一步轉(zhuǎn)化為前列腺素、血栓素、白三烯等類花生酸類物質(zhì)，這些化合物能夠介導多器官及生理系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。如血栓素A2能夠加重膿毒癥所誘導的急性腎損傷[17]，白三烯在氧自由基的作用下能夠形成脂質(zhì)自由基并造成細胞損害[18]。六味地黃丸給藥后，鞘磷脂、鞘氨醇、植物鞘氨醇、花生四烯酸的含量顯著降低，表明六味地黃丸可能通過對以上4種生物標記物含量的調(diào)節(jié)進而達到治療慶大霉素誘導的急性腎損傷的目的。

3 結(jié) 論

本研究應(yīng)用代謝組學方法研究了中成藥六味地黃丸治療慶大霉素誘導的急性腎損傷的作用機制，并鑒定出17種潛在的生物標記物。實驗結(jié)果表明，六味地黃丸可能通過調(diào)節(jié)鞘磷脂、鞘氨醇、植物鞘氨醇、花生四烯酸的含量進而達到治療急性腎損傷的目的。本文的研究結(jié)果為臨床上六味地黃丸治療急性腎損傷提供了理論依據(jù)。

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Study on Protective Effect of Chinese Patent Medicine Liuwei Dihuang Pill on Acute Kidney Injury

WANG Xi-ye,LI Dan,YU Jia-qi,XU Liang*

(Inner Mongolia Key Laboratory for the Natural Products Chemistry and Functional Molecular Synthesis,College of Chemistry and Chemical Engineering,Inner Mongolia University for the Nationalities,Tongliao 028042，China)

Metabonomics technology was used to investigate the mechanism of Liuwei Dihuang Pill treating acute kidney injury induced by gentamicin.The ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry(UPLC-MS) coupled with principle component analysis(PCA) and orthogonal partial least squares discriminant analysis(OPLS-DA) were used to evaluate the changes of biomarkers of control group,model group and treatment group.Significant differences between the control group,model group and treatment group were observed in clustering analysis,PCA and OPLS-DA model.Seventeen potential biomarkers between control group and model group were identified as multiple phosphatidycholines,sphinganine,phytosphingosine,SM(d18∶0/16∶1(9z)),arachidonic acid.The relative contents of sphinganine,phytosphingosine,SM(d18∶0/16∶1(9z)) and arachidonic acid increased in model group compared with control group,while decreased in treatment group.Therefore,Liuwei Dihuang Pill may achieve the aim to treat acute kidney injury induced by gentamicin through adjusting the content of these biomarkers.This study provides a theoretical basis for Liuwei Dihuang Pill treating kidney injury in clinical practice.

Liuwei Dihuang Pill;acute kidney injury;gentamicin;UPLC-MS;biomarker

2016-12-05；

2016-12-29

國家自然科學基金(81260682，81560702)；內(nèi)蒙古自治區(qū)天然產(chǎn)物化學及功能分子合成重點實驗室開放課題 (MDK2016011);內(nèi)蒙古民族大學校級課題(NMDYB1727)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.007

O657.63；R978.1

A

1004-4957(2017)05-0621-06

*通訊作者：許 良，博士，教授，研究方向：天然產(chǎn)物化學，Tel:13947521310，E-mail:nmgxl66@163.com