氣相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定雞肉組織中氯羥吡啶殘留量

陳樹兵，劉忠義，李露青，周虹玲，李 雙，3

(1.寧波出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，浙江 寧波 315012；2.寧波中盛產品檢測有限公司，浙江 寧波 315012；3.寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211)

實驗技術

氣相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定雞肉組織中氯羥吡啶殘留量

陳樹兵1*，劉忠義2，李露青2，周虹玲2，李 雙2，3

(1.寧波出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，浙江 寧波 315012；2.寧波中盛產品檢測有限公司，浙江 寧波 315012；3.寧波大學 海洋學院，浙江 寧波 315211)

采用氣相色譜-串聯(lián)質譜法快速測定雞肉組織中的氯羥吡啶殘留，樣品經乙腈-水提取，冷凍脫脂后，直接以丙酸酐衍生，采用氣相色譜-串聯(lián)質譜(GC-MS/MS) 進行分析，多反應監(jiān)測(MRM) 模式檢測。結果表明，氯羥吡啶在 0.5～40 ng/mL濃度范圍內呈良好的線性關系，方法的定量下限為5.0 μg/kg，回收率為101.5%～111.8%，相對標準偏差(RSD) 小于7.7%。該方法簡便、快速、靈敏度高，重現(xiàn)性好，可用于雞肉組織中氯羥吡啶的快速確證檢測。

氯羥吡啶；氣相色譜-串聯(lián)質譜；雞肉

氯羥吡啶(Clopidol)屬吡啶類化合物，因其對球蟲病具有較強的抑制作用，而在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛應用[1-9]。研究表明，在畜禽養(yǎng)殖過程中貿然停用該類藥物，往往會導致球蟲病爆發(fā)，而連續(xù)或過量的用藥則會造成氯羥吡啶在動物體內的殘留，并會隨著食物鏈進行蓄積和傳遞[1,6]。氯羥吡啶具有致畸性，對人類的健康構成了極大的威脅。隨著人們對食品安全的日益重視，禽肉產品中藥物殘留的限量要求也日益嚴格。歐盟以及美國、日本、中國均已規(guī)定并不斷修訂各種動物組織中氯羥吡啶殘留的最高限量標準。美國、加拿大、日本和中國規(guī)定禽肉組織中氯羥吡啶的殘留限量為5 μg/kg[7-8]。

國內外關于氯羥吡啶殘留量的檢測方法逐漸從難以滿足當前國內外法規(guī)限量要求的、靈敏度低的氣相色譜法、液相色譜法[9-11]，發(fā)展到抗干擾能力強、靈敏度高的液相色譜-串聯(lián)質譜法和氣相色譜-串聯(lián)質譜法[1-6,8-9 ]。該類方法能夠通過碰撞能量產生二級碎片離子，更好地避免了假陽性樣品的出現(xiàn)，使檢測結果更可靠。現(xiàn)有報道采用氣相色譜-質譜(GC-MS)測定動物組織中的氯羥吡啶時，雖然可以通過衍生化反應增加衍生產物在色譜柱上的保留時間，但存在前處理過程復雜、檢測效率低等問題。如陳迪等[7-8]采用甲醇提取雞肉中氯羥吡啶，需經中性氧化鋁柱凈化、氮吹濃縮后，再用丙酸酐衍生?，F(xiàn)行國家標準《GB 9699—2013雞肌肉組織中氯羥吡啶殘留量的測定 氣相色譜-質譜法》同樣需堿性氧化鋁柱凈化、氮吹濃縮，然后再用N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺與三甲基氯硅烷進行衍生化處理[12]。

氣相色譜-三重四極桿質譜聯(lián)用儀(GC-MS/MS)的多反應監(jiān)測方式(MRM)不受共流出物的影響，特征母離子和子離子的一一對應性使其具有極強的抗干擾能力，可有效去除其他碎片離子的干擾，提高檢測靈敏度和檢測通量，解決了GC-MS選擇離子掃描模式(SIM)下存在的離子信息少、靈敏度不高、定性不準及檢測通量較低的問題，大幅提高了對殘留分析，特別是復雜基質中殘留物分析的準確性和檢測能力。

本研究中樣品采用乙腈-水提取后經冷凍除脂，無需濃縮和固相萃取處理，直接以丙酸酐衍生，結合GC-MS/MS快速檢測雞肉中的氯羥吡啶殘留量。與采用固相萃取凈化的方法相比，本方法更加簡單、快速、靈敏，可以滿足禽類產品中該類藥物殘留的高通量快速檢測和確證的要求。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

氣相色譜-串聯(lián)質譜儀:Agilent 7890/7000C(配EI源,美國安捷倫公司)。DB-5MS色譜柱( 30 m×0.25 mm×0.25 μm，美國安捷倫公司)。渦旋混合器(韓國 VisionScientific 公司)。分析天平(德國 Sartorius ME 公司,0.1 mg和0.01 g)。Sigma 33K高速冷凍離心機(美國Sigma公司)。Milli-Q 高純水發(fā)生器(美國Millipore 公司)。

乙腈、正己烷(色譜純，德國 Merck 公司)。丙酸酐(純度≥98%)、吡啶(分析純)、四硼酸鈉(分析純)均為國藥集團化學試劑有限公司產品。氯羥吡啶標準品(純度≥98%,Dr.Ehrenstorfer公司)。

1.2 標準儲備液與工作溶液的配制

準確稱取10 mg(精確至0.1 mg) 氯羥吡啶標準品，用乙腈-水(3∶2) 溶解并定容至10.0 mL，配成標準儲備液，避光于-20 ℃保存。準確吸取適量標準儲備液，用乙腈定容，配成10 mg/L標準中間工作液，置于4 ℃冰箱保存。

分別準確移取一定體積的氯羥吡啶標準中間工作液，使氯羥吡啶的質量為7.5，15.0，30.0，75，150，300，600 ng，添加至稱樣后的空白樣品中，按本方法進行樣品前處理和衍生后，制得濃度為 0.5，1.0,2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 ng/mL的系列基質匹配標準溶液。

1.3 實驗步驟

稱取5 g試樣(精確至0.1 g)于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈-水(3∶2)提取溶液，渦旋混勻后定容至15 mL，超聲5 min，4 500 r/min離心5 min，取10 mL上清液于15 mL離心管中，將離心管置于-20 ℃冰箱冷凍15 min，于4 ℃以下15 000 r/min離心5 min，取上清液待衍生。

移取0.50 mL上清液，依次加入4 mL 0.1 mol/L四硼酸鈉溶液、0.50 mL正己烷、25 μL吡啶和50 μL丙酸酐；渦旋混合1 min，4 500 r/min離心5 min，將上層正己烷移入進樣小瓶中，供氣相色譜-串聯(lián)質譜測定。

1.4 GC-MS/MS測定

1.4.1 色譜條件 色譜柱：毛細管柱DB-5MS(30 m×0.25 mm,0.25 μm)；進樣口溫度:250 ℃；升溫程序：40 ℃保持1 min，以 30 ℃/min 升溫至130 ℃，再以8 ℃/min 升溫至300 ℃，保持10 min；載氣：高純氦氣，純度≥99.999%，流速為 1.0 mL/min；進樣方式：不分流進樣；進樣體積為1 μL。

1.4.2 質譜條件 電離方式為 EI，電離能量 70 eV；離子源溫度300 ℃；傳輸線溫度280 ℃；采用多反應監(jiān)測(MRM) 正離子模式檢測，監(jiān)測離子對(母離子/子離子)：定量離子對m/z為191.0/156.09，定性離子對m/z為191.0/128.0；定量離子對和定性離子對的碰撞能量均為15 eV。

2 結果與討論

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

提取雞肉組織中的氯羥吡啶多采用乙腈作為提取溶劑[1-4,6,9]。實驗中發(fā)現(xiàn)，提取溶液僅采用乙腈時，樣品容易結團，不利于提?。欢崛∪軇┲杏兴嬖跁r可以有效分散樣品組織。為有效地提取雞肉組織中殘留的氯羥吡啶，分別比較了不同水相比例的乙腈溶劑的提取效果，包括0%，5%，10%，20%，30%，40%和50%水相組成。結果表明,水相比例在10%～40%時的提取效率較高且相近，但提取溶劑的乙腈比例較高時，提取液中脂肪等雜質的含量相對較高，不利于儀器和色譜柱的保護。因此，本實驗最終采用含有40%水相比例的乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化方法的選擇

經乙腈-水(3∶2)提取后的雞肉樣品中含有大量抑制離子化的油脂。已報道的凈化方法主要采用固相萃取法[1，6，8-9 ]，如氧化鋁柱、硅膠柱等。陳迪等[7-8]采用自裝填氧化鋁層析柱(≥15 g)凈化提取試液，回收率滿足實驗要求，但柱子的填充和整個凈化過程繁瑣耗時。因此，本文采用低溫冷凍除脂，既能有效地去除提取液中的油脂，又大大提高了實驗效率。實驗分別比較了不同冷凍處理時間(5，10，15，20，25，30 min)下的回收率。結果發(fā)現(xiàn)，冷凍時間在15～30 min時的提取回收率相近，考慮到提高實驗效率和節(jié)約時間成本，本實驗最終采用低溫冷凍15 min完成除脂。

圖1 氯羥吡啶丙酯的色譜圖及子離子掃描質譜圖Fig.1 Chromatogram and mass spectra of clopidol propyl

2.3 MRM條件的優(yōu)化

文獻表明氯羥吡啶衍生物氯羥吡啶丙酯的母離子m/z為 191，其特征碎片離子包括：失去1個Cl離子后的碎裂片段m/z156，以及開環(huán)后失去乙烯分子的碎裂片段m/z128[8]。碰撞能量為 15 eV時響應值最高，故以此條件采用 MRM 模式對氯羥吡啶丙酯進行定性和定量分析。子離子掃描質譜圖見圖1。

2.4 基質效應

精密量取氯羥吡啶標準工作液，使氯羥吡啶的質量為0.2，0.4，1.0，2.0，5.0 ng，氮氣吹干后，加入0.5 mL乙腈，按照“1.3”部分進行衍生化處理，制得濃度分別為0.4，0.8，2.0，4.0，10.0 ng/mL 的系列標準溶液。精密量取氯羥吡啶標準工作液，使氯羥吡啶的質量為0.2，0.4，1.0，2.0，5.0 ng，氮氣吹干后，加入0.5 mL經“1.3”方法處理過的雞肉空白基質溶液，按照“1.3”進行衍生化處理，制得濃度為 0.4，0.8，2.0，4.0，10.0 ng/mL 的系列基質匹配標準溶液。在相同的儀器條件下檢測，以前者的信號值為基準，得到基質匹配標準溶液的相對信號值。試驗中發(fā)現(xiàn)，其信號值的比值均低于80%，說明雞肉樣品基質對離子化有明顯的抑制作用。因此，本方法采用基質加標作工作曲線，樣品的提取和凈化程序能保證雞肉組織中目標物質氯羥吡啶穩(wěn)定的提取效率，同時也能消除基質效應的影響，以保證測定結果的準確性。

圖2 雞肉樣品的GC-MS/MS色譜圖Fig.2 GC-MS/MS chromatograms of chicken samplesa:blank sample；b:blank sample spiked at 5.0 μg/kg

2.5 方法的線性范圍、定量下限、回收率及精密度

分別進樣測定濃度為0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，20.0，40.0 ng/mL的系列基質匹配標準溶液，以氯羥吡啶衍生物的響應值為縱坐標，對應濃度為橫坐標，繪制標準曲線。結果表明，氯羥吡啶在0.5～40.0 ng/mL范圍內具有良好的線性關系(r2=0.999 4)，其回歸方程為Y=79.07X+0.44。

用空白基質加標方法進行回收率和精密度實驗。對雞肉樣品分別進行5.0，10，20 μg/kg 3個水平的加標回收實驗，每個濃度水平平行測定6次，計算回收率和相對標準偏差。結果表明，3個添加水平的平均回收率為101.5%～111.8%，相對標準偏差為4.2%～7.7%。本方法有較好的準確度和精密度，以實際最低加標濃度5.0 μg/kg作為定量下限，能夠滿足動物組織中氯羥吡啶殘留監(jiān)控的定量分析要求。雞肉樣品空白基質和5.0 μg/kg 水平加標的圖譜見圖2。

3 結 論

本文建立了氣相色譜-串聯(lián)質譜快速測定雞肉組織中氯羥吡啶殘留量的方法，無需濃縮和固相萃取處理，更加簡單、快速，且方法靈敏度高，可以滿足日常進出口禽類產品中該類藥物殘留的高通量快速檢測和確證的要求。

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Determination of Clopidol Residues in Chicken Muscle by Gas Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

CHEN Shu-bing1*,LIU Zhong-yi2,LI Lu-qing2，ZHOU Hong-ling2,LI Shuang2,3

(1.Technical Center of Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Ningbo 315012,China；2.Ningbo Zhongsheng Product Testing Company，Ningbo 315012,China；3.School of Marine Sciences, Ningbo University，Ningbo 315211,China)

A rapid method was established for the determination of clopidol in chicken by gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS).Samples were extracted with acetonitrile-water.The extract was frozen to remove the lipid within,and derivated with propionic anhydride.Then,it was analyzed by GC-MS/MS under MRM mode.The calibration curve for clopidol was linear in the concentration range of 0.5-40 ng/mL with a correlation coefficient of 0.999 4.The limit of quantitation for this method was 5.0 μg/kg.The average recoveries at spiked concentrations of 5.0,10,20 μg/kg ranged from 101.5% to 111.8%,with relative standard deviations less than 7.7%.The method is simple,quick and high sensitive,and could be applied to detect clopidol residues in real samples.

clopidol；gas chromatography-tandem mass spectrometry(GC-MS/MS)；chicken

2016-12-12；

2017-01-20

國家質檢總局科研計劃項目(2016IK169)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.020

O657.71；TQ460.72

A

1004-4957(2017)05-0689-04

*通訊作者：陳樹兵，碩士，高級工程師，研究方向：食品農產品中污染物分析，Tel：0574-87022808,E-mail:shubingchen@126.com