高效液相色譜/二極管陣列法快速測定白酒、配制酒與葡萄酒中5種人工合成甜味劑

包 懿，石金娥，劉 斌，王慶峰，李 寧，劉 洋

(吉林省食品檢驗所，吉林 長春 130103)

高效液相色譜/二極管陣列法快速測定白酒、配制酒與葡萄酒中5種人工合成甜味劑

包 懿*，石金娥，劉 斌，王慶峰，李 寧，劉 洋

(吉林省食品檢驗所，吉林 長春 130103)

建立了一種快速檢測白酒、配制酒和葡萄酒中安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜及紐甜5種人工合成甜味劑的高效液相色譜分析方法。采用C18柱為分離柱，對流動相的組成和洗脫方式、檢測波長等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，以乙腈和0.02 mol/L硫酸銨(pH 4.4)溶液為流動相，梯度洗脫，柱溫40 ℃，可使5種人工合成甜味劑在15 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離。最佳檢測波長下，5種甜味劑在4～200 mg/L濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。樣品加標(biāo)回收率為95.2%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)均不大于3.4%。該方法簡便、快捷、準(zhǔn)確、靈敏度較高，適用于白酒、配制酒和葡萄酒等各類酒中5種人工合成甜味劑的快速檢測。

高效液相色譜/二極管陣列；人工合成甜味劑；白酒；配制酒；葡萄酒

甜味劑是一類用于改善食品風(fēng)味的食品添加劑，按其來源可分為天然甜味劑和人工合成甜味劑[1-2]。人工合成甜味劑主要包括安賽蜜(Acesulfame-K，AK)、糖精鈉(Saccharin Sodium，SA)、阿斯巴甜(Aspartame，ASP)、阿力甜(Alitame，ALT)及紐甜(Neotame，NTM)等，其主要特點是在人體內(nèi)不進(jìn)行代謝吸收、低能量或無能量,其甜度為蔗糖的數(shù)十倍至數(shù)千倍，所以常稱其為非營養(yǎng)型甜味劑或高甜度甜味劑，是目前食品生產(chǎn)及加工領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的甜味劑[3]。

隨著我國人民生活水平的提高，酒的消費量呈現(xiàn)快速增長的趨勢，酒中添加人工合成甜味劑的安全性備受消費者的關(guān)注[4]。美國、歐盟、日本等國家對人工合成甜味劑的使用限量各不相同[5]。為了保障酒的飲用安全，我國對酒中允許使用的食品添加劑的種類和限量作了明確規(guī)定，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[6]中規(guī)定不允許安賽蜜、阿斯巴甜、阿力甜等人工合成甜味劑添加到各類酒中，僅允許配制酒和除葡萄酒之外的發(fā)酵酒可檢出少量的糖精鈉和紐甜，配制酒中糖精鈉的限量為0.15 g/kg，除葡萄酒之外的發(fā)酵酒中紐甜的限量為0.033 g/kg。然而，在生產(chǎn)過程中非法使用、超限使用人工合成甜味劑的情況時有發(fā)生，因此建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的測定酒中多種人工合成甜味劑的分析方法，對于保障消費者的飲酒安全尤為重要。

針對上述人工合成甜味劑的檢測，已報道的方法有離子色譜法[7]、毛細(xì)管電泳法[8-10]、氣相色譜法[11]、高效液相色譜-紫外分光光度法[12]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[13-17]、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法[18-19]和高效液相色譜-二極管陣列檢測法[20]等。由于阿斯巴甜、阿力甜和紐甜等二肽類人工合成甜味劑的分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不易氣化，衍生難度大，不易用氣相色譜法檢測；安賽蜜、糖精鈉屬于鹽類物質(zhì)，易溶于水，不能直接用氣相色譜法檢測，需衍生化后進(jìn)樣，方法復(fù)雜，現(xiàn)基本不采用氣相色譜檢測安賽蜜和糖精鈉；阿斯巴甜、阿力甜、安賽蜜及糖精鈉在水中以陰離子形式存在，可以用陰離子交換的離子色譜進(jìn)行分離檢測，然而用離子色譜法檢測紐甜目前尚未見報道；毛細(xì)管電泳法重現(xiàn)性和分離效果差的缺點限制了其在人工合成甜味劑檢測領(lǐng)域的應(yīng)用。在上述方法中，高效液相色譜法最為常用，可聯(lián)接紫外分光光度檢測器(UV)、質(zhì)譜型檢測器(MS)、蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)及二極管陣列檢測器(DAD)等多種檢測器。其中，紫外分光光度檢測器由于在檢測過程中波長固定，只適用單一或2種甜味劑的檢測；各類質(zhì)譜型檢測器具有分析速度快、靈敏度高、抗干擾性強等優(yōu)點，但設(shè)備費用昂貴，使用環(huán)境要求及后期運行維護(hù)成本較高，不適用于基層檢驗實驗室推廣；二極管陣列檢測器是一種具有極佳應(yīng)用前景的新型檢測器，具有操作簡單、設(shè)備成本及維護(hù)成本低等優(yōu)點，一次進(jìn)樣就能對被測物進(jìn)行190～800 nm全波長立體掃描，選擇被測物最佳檢測波長下對其進(jìn)行定量分析，可大大提高檢測靈敏度。鑒于此，本研究建立了一種高效液相色譜/二極管陣列檢測器同時檢測酒類產(chǎn)品中5種人工合成甜味劑的方法，該方法樣品前處理簡單、分析快速、靈敏度高，適用于白酒、配制酒及葡萄酒中人工合成甜味劑的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與設(shè)備

LC-20AT高效液相色譜儀，SPD-M20A型二極管陣列檢測器(日本Shimadzu公司)；BP211D型電子天平，賽多利斯儀器有限公司；NEVA-P型氮吹濃縮儀(美國Organomation)；Allegra 64型離心機(美國Beckman公司)；KQ-300VDE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q型超純水系統(tǒng)；IKA渦旋振蕩器；具塞錐形瓶、移液管、量筒等玻璃器皿均為天玻玻璃儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品：安賽蜜、糖精鈉，購于德國Dr.Ehrenstorfer GmbH；阿力甜、紐甜、阿斯巴甜，購于美國USP公司。試劑：甲醇、乙腈、甲酸、硫酸，均為色譜純，購于美國Fisher公司；甲酸銨、乙酸銨、硫酸銨，均為色譜純，購于上海阿拉丁有限公司；實驗用水由Milli-Q型超純水系統(tǒng)制備。白酒樣品10份、配制酒樣品10份、葡萄酒樣品10份(均為干型)，購于超市。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)儲備液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解并定容，配制成0.5 g/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，儲存于-4 ℃冰箱中備用。準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)儲備液于各容量瓶中，用流動相稀釋配制成質(zhì)量濃度范圍為4.0～200.0 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 儀器參數(shù)條件 色譜柱：Agilent XDB C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A為0.02 mol/L硫酸銨溶液(硫酸調(diào)pH值至4.4)，B為乙腈；流速：0.8 mL/min；二極管陣列檢測器：190～800 nm；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。梯度洗脫程序：0～2.0 min，95% A；2.0～8.0 min，95%～50% A；8.0～10.0 min，保持50% A；10.0～11.0 min，50%～95% A；11.0～15.0 min，保持95% A。

1.3.3 分析方法 分別取白酒、配制酒樣品5 mL于50 ℃氮吹儀中除去乙醇，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容，過0.22 μm濾膜后供HPLC分析。取葡萄酒樣品5 mL于10 000 r/min下離心5 min，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用水定容，過0.22 μm濾膜后供HPLC分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

對流動相的組成進(jìn)行優(yōu)化，首先考察了乙酸銨-甲醇、硫酸銨-甲醇、甲酸銨-甲醇及辛烷磺酸鈉-磷酸離子對試劑-甲醇等體系，發(fā)現(xiàn)甲酸銨-甲醇體系下分離效果較好且峰值響應(yīng)高，但在低波長檢測時基線漂移嚴(yán)重，干擾被測物的測定?？紤]到甲醇的截止波長為210 nm左右，乙腈的截止波長在190 nm左右，阿斯巴甜和阿力甜的檢測波長在200 nm，而且乙腈的洗脫能力強、粘度小，故選擇乙腈作為流動相的有機相。考察了各緩沖鹽溶液的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-硫酸銨緩沖溶液體系的效果最好，當(dāng)硫酸銨緩沖溶液的濃度為0.02 mol/L，pH值為4.4時，5種人工合成甜味劑的色譜峰形和分離度達(dá)到最佳。

采用梯度洗脫的方式，起始為95%的硫酸銨緩沖溶液，2 min后逐漸降至50%，隨著有機相比例的增加，洗脫能力增強，阿斯巴甜、阿力甜及紐甜的出峰時間提前，分析時間縮短。8～10 min范圍內(nèi)有機相的比例保持在50%，10～11 min范圍內(nèi)有機相的比例降至5%，直至5種被分析物完全基線分離。實驗發(fā)現(xiàn)，在起始階段1～2 min內(nèi)，硫酸銨緩沖溶液的比例在95%～50%范圍內(nèi)變化對安賽蜜和糖精鈉的出峰順序和分離度影響較小，只是在出峰時間上略有差異。在2～11 min范圍內(nèi)，硫酸銨緩沖溶液的比例不恰當(dāng)會導(dǎo)致阿力甜和紐甜峰形變差或者峰丟失。

圖1 5種人工合成甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(200.0 mg/L)的液相色譜圖Fig.1 Chromatogram of five artificial sweeteners (200.0 mg/L) mixed standard solution

二極管陣列檢測器(DAD)在實驗過程中采用全波長掃描的形式，利用被分析物的紫外光譜圖，確定其最大吸收波長，并在此波長下積分計算其峰面積或峰高。本實驗的測定波長分別為：安賽蜜(AK)和糖精鈉(SA)230 nm，阿斯巴甜(ASP)和阿力甜(ALT)200 nm，紐甜(NTM)218 nm。實驗也分別考察了柱溫(25，30，35，40 ℃)對5種人工合成甜味劑分離情況的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種人工合成甜味劑的保留時間隨著溫度的升高而減小，但分離度降低，當(dāng)柱溫高于40 ℃后分離度基本無變化，故柱溫設(shè)定為40 ℃。

在優(yōu)化后的色譜條件下，對5種人工合成甜味劑進(jìn)行分析，在15 min內(nèi)實現(xiàn)基線分離，分離度均大于1.5，色譜圖見圖1。

2.2 樣品處理條件的選擇

白酒和配制酒的主要成分是乙醇和水，在進(jìn)行實際樣品分析時，高濃度的乙醇會導(dǎo)致被分析物在色譜柱上的保留作用減弱，使峰位前移，保留時間不穩(wěn)定，為了消除白酒和配制酒中高濃度乙醇對分析結(jié)果的影響，實際樣品先用氮吹儀在50 ℃下除去乙醇，然后用水定容，過0.22 μm濾膜后供HPLC分析。葡萄酒中乙醇的含量低，對結(jié)果影響不明顯，可直接用水稀釋，離心除去葡萄酒中少量沉淀后，過0.22 μm濾膜，待測。

2.3 方法學(xué)評價

2.3.1 線性范圍及檢出限 基于優(yōu)化后的前處理及色譜條件，考察了5種人工合成甜味劑在4～200 mg/L濃度范圍的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)，并在空白樣品中添加低濃度的各目標(biāo)化合物，以信噪比為3(S/N=3)時對應(yīng)的濃度為此方法的檢出限，S/N=10對應(yīng)的濃度為定量下限。結(jié)果表明，5種人工合成甜味劑在4～200 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)不小于0.999 1，定量下限均不大于1.50 mg/kg(見表1)。方法靈敏度能滿足白酒、配制酒和葡萄酒中5種人工合成甜味劑的檢測要求。

表1 5種人工合成甜味劑的線性關(guān)系、檢出限及定量下限Table 1 Linear relationships，limits of detection(LOD，S/N=3) and limits of quantitation (LOQ，S/N=10) of five artificial sweeteners

x:concentration of sweeteners，mg/L;y:peak area

2.3.2 回收率與精密度 向空白樣品(白酒、配制酒和葡萄酒)中添加低、中、高3個濃度水平的人工合成甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行測定5次，計算加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果列于表2，色譜圖見圖2。5種人工合成甜味劑的加標(biāo)回收率為95.2%～103.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.8%～3.4%，方法顯示了較高的準(zhǔn)確度及精密度。

表2 5種人工合成甜味劑的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Recoveries and RSDs of five artificial sweeteners(n=5)

圖2 空白葡萄酒(A)、配制酒(B)和白酒(C)樣品中添加5種人工合成甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶 液(20.0 mg/L)后的色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank white spirit(A)，mixed liquor(B) and wine samples(C) after spiking with five artificial sweeteners(20.0 mg/L) mixed standard

2.4 實際樣品的檢測

對吉林省市售的不同品牌的白酒、配制酒和葡萄酒各10個批次進(jìn)行檢測，根據(jù)保留時間、紫外光譜及峰面積進(jìn)行定性定量分析。結(jié)果表明，白酒和配制酒中均未檢出上述5種人工合成甜味劑，1個葡萄酒樣品中檢出安賽蜜(26.10 mg/kg)和糖精鈉(5.62 mg/kg)。向此葡萄酒樣品中添加已知濃度的安賽蜜和糖精鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在安賽蜜和糖精鈉色譜峰附近未出現(xiàn)新的色譜峰，且安賽蜜和糖精鈉的峰面積顯著增大。通過計算，其加標(biāo)回收率分別為99.2%和98.1%，表明該方法可避免錯判的發(fā)生。

3 結(jié) 論

本文建立了白酒、配制酒和葡萄酒中安賽蜜、糖精鈉、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜5種人工合成甜味劑的高效液相色譜/二極管陣列快速檢測方法。該方法快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，前處理步驟簡單，能夠滿足廣大基層食品檢驗實驗室的需要，也為我國廣大中小型酒類生產(chǎn)企業(yè)的原料把關(guān)及成品質(zhì)量控制提供了簡便可靠的分析方法。此方法對其他種類食品中人工合成甜味劑的檢測具有借鑒意義，有望在保障食品安全的過程中發(fā)揮重要作用。

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Rapid Determination of Five Artificial Sweeteners in White Spirit，Mixed Liquor and Wine by High Performance Liquid Chromatography/Diode Array Detector

BAO Yi*， SHI Jin-e， LIU Bin， WANG Qing-feng， LI Ning， LIU Yang

(Jilin Institute for Food Control，Changchun 130103，China)

A high performance liquid chromatographic(HPLC) method was developed for the rapid determination of five synthetic sweeteners，including acesulfame-K(AK)，saccharin sodium(SA)，aspartame(ASP)，alitame(ALT) and neotame(NTM) in white spirit，mixed liquor and wine.The HPLC separation was carried out on a C18column.Several parameters，including the composition and gradient elution program of the mobile phase，column temperature and optimum detection wavelength of diode-array detector(DAD) were optimized for improving the chromatographic performance and the sensitivity of determination.The results demonstrated that the separation could be completed within 15 min by gradient elution with acetonitrile and 0.02 mol/L ammonium sulfate solution(pH 4.4) as mobile phase.The column temperature was set at 40 ℃.The calibration curves of five synthetic sweeteners were linear in the range of 4-200 mg/L with correlation coefficients more than 0.999.The recoveries were in the range of 95.2%-103.2%，with relative standard deviations(n=5) not more than 3.4%.The experimental results indicated that the established method was simple，efficient and sensitive，and was suitable for the determination of five synthetic sweeteners in white spirit，mixed liquor and wine.

HPLC/DAD;artificial sweeteners;white spirit;mixed liquor;wine

2016-11-29；

2017-01-05

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.05.017

O657.72;TS202.3

A

1004-4957(2017)05-0674-05

*通訊作者：包 懿，博士，工程師，研究方向：食品及相關(guān)產(chǎn)品檢測，Tel:0431-88675932，E-mail:baoyi81@126.com