動物頸脊髓壓迫模型的研究進展

姜 昊，田自開，徐浩欽，王瑞軍，彭寶淦

動物頸脊髓壓迫模型的研究進展

姜 昊，田自開，徐浩欽，王瑞軍，彭寶淦

脊髓型頸椎病是導(dǎo)致成人脊髓功能障礙最常見的疾病。矛盾的是，對于脊髓型頸椎病患者脊髓神經(jīng)組織進展性功能喪失的病理生物學(xué)機制卻不甚清楚。經(jīng)過20世紀本領(lǐng)域科學(xué)家的大量研究證實，脊髓壓迫模型不論是在研究治療脊髓型頸椎病功效方面還是在探索其發(fā)病機制方面都是重要的。脊髓壓迫的臨床前研究需要一個可分級、可量化、可重復(fù)的動物模型。筆者從動物的選擇、動物模型的制作和脊髓損傷神經(jīng)功能評估三個方面分別來闡述動物脊髓壓迫模型的建立。

脊髓型頸椎??；脊髓壓迫；脊髓損傷

脊髓型頸椎病是一種常見的運動和感覺功能漸進損害性疾病。脊髓型頸椎病是由于頸椎退行性改變造成的頸脊髓的損害[1,2]。據(jù)報道，脊髓型頸椎病在人群中的發(fā)病率約為1.6/105,且在亞洲男性及歐洲白人女性中發(fā)病率最高[3,4]。近些年，越來越多的學(xué)者致力于動物頸脊髓壓迫的研究，且國內(nèi)外學(xué)者為了更好應(yīng)對脊髓型頸椎病病理機制及其與相關(guān)疾病的關(guān)系進行研究，建立了多種脊髓壓迫模型[5-7]。筆者現(xiàn)從動物的選擇、動物模型的制作和脊髓損傷動物實驗?zāi)Ｐ蜕窠?jīng)功能評估等方面分別來闡述動物脊髓壓迫模型的建立。

1 動物的選擇及模型制作

1.1 動物的選擇 脊髓壓迫的臨床前研究需要一個實驗結(jié)果可分級、可量化、可重復(fù)的動物模型。通常，脊髓壓迫模型目標是產(chǎn)生非極量損害，可通過干預(yù)程度的調(diào)節(jié)來改善或加重損傷的程度。用于脊髓壓迫的動物種類很多，如鼠、猴、羊、犬、豬、貓、兔等。從解剖角度來說，猴、猿、狗等動物，越接近人類，越易可靠的觀察脊髓受壓后肢體功能情況，但是考慮實驗動物的來源及價格狀況，鼠因其相對便宜、具有較強的抗感染能力和生命力且易于處理，普遍應(yīng)用于實驗室脊髓壓迫研究的初期試驗。但是，若要考慮愈接近人類的實驗，則推薦選擇猴、猿等動物。

1.2 模型制作

1.2.1 螺釘壓迫脊髓模型 該模型為使用螺釘通過頸前路或頸后路穿透椎體或者椎板壓迫硬膜囊從而形成椎管內(nèi)占位，造成脊髓壓迫。1982年，Schramm[8]設(shè)計了后路螺釘直接壓迫模型，通過后路椎板，擰入直徑3 mm，螺距0.5 mm螺釘，擰入速率0.25 mm/次，4～7次/d，建立50%的壓迫模型。由于脊髓慢性壓迫所致脊髓病的發(fā)展和病理過程并未被完全闡明，Kanchiku等[9]等通過塑料螺釘建立了一個前路壓迫模型，并且用其來研究因慢性受壓所致脊髓病的病理表現(xiàn)。組織學(xué)發(fā)現(xiàn)，灰質(zhì)損傷與壓扁的前角及前角細胞的消失和壞死有關(guān)，且在灰質(zhì)中發(fā)現(xiàn)輕度的膠質(zhì)細胞增生，然而，白質(zhì)顯示海綿樣變性、軸索變性和輕微脫髓鞘改變。筆者發(fā)現(xiàn)，脊髓誘發(fā)電位可以用一個導(dǎo)管電極通過頸椎硬膜外將其安全記錄下來。通過脊髓動作電位，研究者不僅可以精確判定脊髓的病理學(xué)狀況，還可以觀察不同壓縮程度模型的神經(jīng)損害癥狀。近些年來，螺釘壓迫脊髓模型被廣泛應(yīng)用于各領(lǐng)域，Ning等[10]采用螺釘制作大鼠亞急性脊髓受壓模型，研究重組人紅細胞生成素阻止大鼠運動神經(jīng)元細胞凋亡，數(shù)據(jù)顯示，重組人紅細胞生成素可以被用于阻止由于亞急性壓迫引起的損傷，且可以保護頸椎亞急性脊髓損傷后運動功能，該方法的優(yōu)點：采用螺釘建立脊髓壓迫模型可以根據(jù)螺釘?shù)臄Q入控制壓迫程度，利于長期持續(xù)加壓；缺點：植入壓迫螺釘需要在不同時間反復(fù)擰入螺釘，這種造模方法的感染率和病死率較高。

1.2.2 腫瘤細胞壓迫模型 腫瘤細胞壓迫模型為通過后路接種一定濃度的腫瘤細胞系到指定的區(qū)域，使腫瘤組織在硬膜外腔生長，逐漸對脊髓產(chǎn)生壓迫。1980年，Ikeda等[11]利用病毒誘導(dǎo)表皮樣癌建立兔腫瘤壓迫脊髓模型，壓迫模型組織學(xué)結(jié)果揭示：一個階段的脊髓受壓通常位于后外側(cè)或者前外側(cè)，在壓迫早期，脊髓壓迫階段存在白質(zhì)的腫脹，在壓迫晚期，白質(zhì)的改變更加明顯，且伴隨著壞死和出血，相比于白質(zhì)，灰質(zhì)相對保持完好。Delattre等[12]建立壓迫模型，研究地塞米松在腫瘤壓迫模型脊髓中劑量反應(yīng)，研究結(jié)果支持地塞米松治療由腫瘤引起的硬膜外脊髓壓迫，而且證實高劑量地塞米松在治療方面優(yōu)于低劑量。實驗數(shù)據(jù)表明，地塞米松可直接降低壓迫階段區(qū)域毛細血管對于小分子物質(zhì)的通透性[12]。腫瘤細胞壓迫法常被人們用來制作脊髓壓迫模型，但這種方法的局限性包括：（1）惡性腫瘤細胞會損害正常脊髓組織，甚至引起脊髓神經(jīng)纖維和神經(jīng)細胞功能的改變；（2）其生長速度較快，不適于脊髓慢性壓迫的研究；（3）無法控制腫瘤組織的形狀及大小，并且難以復(fù)制、重復(fù)實驗結(jié)果等。

1.2.3 膨脹材料壓迫模型 隨著科技的飛速發(fā)展，可膨脹材料逐漸進入人們的視野，采用可膨脹材料置于硬膜外特定位置壓迫脊髓建立壓迫模型變得日益成熟。1981年，de la Torre[13]把酪蛋白塑料物質(zhì)移植到椎板與脊髓之間建立了新型脊髓壓迫模型,并用此模型研究了脊髓損傷時誘發(fā)電位的改變。Kim等[14]采用膨脹的尿烷化合物為膨脹材料制作脊髓壓迫模型，此材料24 h內(nèi)膨脹至原有體積的230%，且能保持16 d。組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，脊髓壓迫階段神經(jīng)元缺失，偶爾在剩余的神經(jīng)元出現(xiàn)染色質(zhì)溶解；靜脈竇狀小管膨脹和灰質(zhì)小空泡也被發(fā)現(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)白質(zhì)的脫髓鞘改變。實驗數(shù)據(jù)表明，在慢性壓迫情況下，運動功能障礙只有在大量運動神經(jīng)元缺失的情況下才發(fā)生，在模型中可以觀察到，運動神經(jīng)元減少先于運動功能障礙[14]。2012年，Wang等[15]采用由聚乙烯醇和聚丙烯醇構(gòu)成的滲透聚合物網(wǎng)絡(luò)凝膠吸水材料制作脊髓壓迫模型用來研究透明質(zhì)酸四糖在大鼠慢性脊髓壓迫后自我修復(fù)的關(guān)系，組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在輕度壓迫和重度壓迫組大鼠出現(xiàn)不同程度的脫髓鞘改變，而對照組大鼠脊髓形態(tài)正常，髓鞘排列緊密。2015年，Cheng等[16]利用吸水膨脹材料制作脊髓壓迫模型，研究發(fā)現(xiàn)頸脊髓前動脈和前根動脈在慢性頸脊髓壓迫后有明顯改變，頸脊髓前動脈和前根動脈在慢性頸脊髓壓迫組神經(jīng)功能改變方面有重要作用。以上材料，無論是酪蛋白塑料物質(zhì)、甲基纖維素-聚丙烯腈還是尿烷化合物等都有其膨脹速度快的缺點，用于研究脊髓慢性壓迫有一定局限性。而且膨脹材料需要提前植入實驗動物，觀察是否有炎性反應(yīng)或組織變化以防排異反應(yīng)。試想將來如果有一種可以人為控制膨脹速度、膨脹方向、長期穩(wěn)定保持形狀、與組織無排異反應(yīng)的材料，脊髓壓迫模型的研究將迎來飛速發(fā)展。

1.2.4 氣囊壓迫模型 氣囊壓迫模型的原理是在硬膜囊外椎板下植入一個小氣囊，氣囊外連接一個導(dǎo)管向氣囊內(nèi)充氣，從而對脊髓造成壓迫損傷。1953年，Tarlov等[17]首次采用氣囊設(shè)備制作脊髓壓迫模型，該設(shè)備是應(yīng)用液壓原理，其核心是一個金屬壓縮機組和一個壓縮單元，由聚乙烯和金屬管連接兩個橡膠氣球，將手術(shù)植入裝置，待動物恢復(fù)后，通過擰緊壓縮螺釘使硬膜外氣囊充氣壓迫脊髓，螺釘擰入的圈數(shù)決定了氣囊膨脹和脊髓受壓的程度。Vanicky等[18]建立了一個新型氣囊模型，采用一個Fogarty導(dǎo)管經(jīng)過胸10椎弓植入硬膜外，通過灌注鹽水使氣囊膨脹從而對脊髓造成壓迫。最近，Cao等[7]運用氣囊技術(shù)制作脊髓壓迫模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)如果經(jīng)顱運動誘發(fā)電位信號丟失被發(fā)現(xiàn)且立即去除對脊髓的壓迫，術(shù)后小鼠的功能正常，然而，在延遲5 min去除脊髓壓迫組，術(shù)后會有嚴重的功能不足。因為制作此模型僅需一個微小手術(shù)，且造模過程快速、設(shè)備易于操作，氣囊模型被多次用于動物實驗研究。然而，氣囊膨脹時囊內(nèi)壓力并非呈直線樣改變等缺點仍限制其廣泛使用。

1.2.5 后縱韌帶骨化模型 慢性脊髓壓迫歸因于頸椎病、椎間盤突出[19]、后縱韌帶骨化等誘發(fā)的退行性脊髓變化，如髓鞘破壞、白質(zhì)和灰質(zhì)中軸突和少突細胞喪失等。1981年，Hosoda等[20]采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培養(yǎng)出一種隨著年齡增長致頸椎體鈣化沉積物增多的小鼠，該小鼠通常踮腳尖爬行,稱為Twy（tiptoe-walking Yoshimura）小鼠。Takenouchi等[21]利用Twy小鼠對慢性壓迫的病理及組織學(xué)改變進行了研究，在慢性壓迫小鼠脊髓檢測到細胞凋亡的表達和神經(jīng)元缺失、脫髓鞘改變等，并且證實細胞凋亡可能導(dǎo)致組織退變。Yu等[22]利用Twy小鼠進行研究發(fā)現(xiàn)，在脊髓壓迫階段伴隨神經(jīng)元密度的明顯減少；并且免疫組化分析證實，在Twy小鼠脊髓壓迫區(qū)域證實膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein，GFAP）是增加的。Twy小鼠是僅有的無創(chuàng)慢性進行性動物壓迫模型；病程發(fā)展緩慢，符合慢性壓迫的病理改變；無異物植入，不存在排異反應(yīng)。但此模型在慢性壓迫過程中不能認為控制壓迫程度等精細調(diào)節(jié)，且無法重復(fù)實驗結(jié)果。

2 脊髓損傷動物實驗?zāi)Ｐ蜕窠?jīng)功能評估

2.1 Talov評分標準 修訂版Talov運動功能評估標準分5級[7]：（1）0級，不能自主運動；（2）1級，可察覺關(guān)節(jié)、下肢活動；（3）2級，關(guān)節(jié)可活動自如，但無法站立；（4）3級，可以站立和行走，但不能跑動；（5）4級，正常。Talov法比較簡單，用于脊髓損傷程度的初步評估，不能觀察脊髓損傷后恢復(fù)的全過程。Cao等[7]采用此標準對脊髓損傷的山羊行神經(jīng)行為評分，以初步評估脊髓損傷的程度。

2.2 BBB評分標準 BBB（Basso-Beattie-Bresnahan）評分標準[16,23]包括下肢運動、軀干的姿態(tài)和穩(wěn)定性、步態(tài)、協(xié)調(diào)性、爪位置、腳趾間隙和尾巴位置。BBB評分主要代表脊髓損傷后的恢復(fù)情況，體現(xiàn)脊髓損傷后恢復(fù)的全過程。Cheng等[16]采用BBB評分來評估大鼠慢性脊髓壓迫模型癱瘓程度。

2.3 斜扳試驗 斜扳試驗同樣為評估脊髓損傷后小鼠運動功能的方法[24,25]，該方法為把動物放置在一個可以調(diào)節(jié)不同傾斜度的斜面上，增大傾斜角度，則動物可以維持其位置5 s的傾斜度為最大角度。斜扳試驗設(shè)備簡單、檢測迅速、重復(fù)性好，適用于對整體功能進行評價，缺點為無法體現(xiàn)細微運動恢復(fù)情況。Morris等[24]采用斜扳試驗測量脊髓損傷小鼠的最大角度，來評估脊髓損傷后小鼠的運動功能。

2.4 皮層體感誘發(fā)電位 皮層體感誘發(fā)電位[26]（cortical somatosensory evoked potentials, CSEP）是檢測脊髓感覺的電生理檢查之一，能夠準確對脊髓功能做出診斷及定量分析。CSEP分4型，Ⅰ型主要指Franke A級，Ⅱ型主要指Franke B、C級，Ⅲ型主要指Franke C、D級，Ⅳ型主要指Franke D、E級（表1）。其反應(yīng)靈敏，能較早反應(yīng)病情變化，可根據(jù)潛伏期縮短程度判斷預(yù)后情況。Jiang等[26]對脊髓損傷的山羊行CSEP檢測，以準確的分析損傷脊髓的功能。

表1 Frankel脊髓損傷分級

綜上所述，設(shè)計實驗動物模型的目的是為了模擬臨床疾病的發(fā)病機制，盡管許多學(xué)者應(yīng)用以上方法進行動物實驗，然而，無論任何方法均有其自身的局限性，目前仍需要創(chuàng)建一種動物模型使其病理過程恰如其分的復(fù)制到動物模型上，因此，此需要滿足以下要求：（1）可重復(fù)性；（2）可定量分級；（3）再現(xiàn)性好；（4）適用性廣泛。在研究中可要根據(jù)實驗的需求選用合適的動物模型?？傊?，相信不久的將來構(gòu)建脊髓壓迫模型的方法會不斷得到改進和完善，并更好地服務(wù)于脊髓型頸椎病的病理生理學(xué)機制和治療等研究。

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（2017-01-20 收稿 2017-04-10 修回）

（本文編輯 潘奕婷）

Advances in the animal model of cervical cord compression

JIANG Hao, TIAN Zikai, XU Haoqin, WANG Ruijun, and PENG Baogan. Department of Spine Surgery, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039，China

PENG Baogan, E-mail: pengbaogan@163.com

Cervical spondylotic myelopathy is the most common cause of spinal cord dysfunction in adults. Paradoxically, the pathobiological mechanisms associated with the progressive loss of neural tissue in the spinal cord of cervical spondylotic myelopathy patients is not clearly understood. The results of many studies in this field in 20th century have shown that spinal cord compression models are indispensible not only in investigating the efficacy of therapeutic interventions but also in gaining a better understanding into the molecular pathways involved. Preclinical studies on spinal cord compression require a reproducible, gradable, and quantifiable animal model. In this paper, the author elaborates on the establishment of an animal model of spinal cord compression from the aspects of the selection of animals, the production of animal models and neurological assessment in spinal cord injury.

cervical spondylotic myelopathy; spinal cord compression; spinal cord injury

R681.55

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.05.014

武警總醫(yī)院臨床類創(chuàng)新預(yù)研（WZ2015003）

100039 北京，武警總醫(yī)院脊柱外科

彭寶淦，E-mail：pengbaogan@163.com