軟骨細(xì)胞對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

徐訓(xùn)安，叢 波，韓 龍，姚旺林，張仲文

軟骨細(xì)胞對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的影響

徐訓(xùn)安，叢 波，韓 龍，姚旺林，張仲文

目的 明確軟骨細(xì)胞對(duì)滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSCs）向軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化情況的影響。 方法 （1）消化分離原代軟骨細(xì)胞和SMSCs，測(cè)定細(xì)胞存活率、計(jì)數(shù)并傳代培養(yǎng)。顯微鏡下觀察各代軟骨細(xì)胞和SMSCs生長(zhǎng)情況，并對(duì)軟骨細(xì)胞和SMSCs進(jìn)行類別鑒定。（2）取第1代兔軟骨細(xì)胞和第3代SMSCs共培養(yǎng)，第3代SMSCs單獨(dú)培養(yǎng)作為對(duì)照組。（3）5 d、10 d后分別對(duì)SMSCs進(jìn)行免疫熒光、免疫組化和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，通過觀察SMSCs對(duì)Ⅱ型膠原的表達(dá)情況，了解軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)SMSCs向軟骨細(xì)胞分化的影響。 結(jié)果 （1）原代軟骨細(xì)胞剛分離初為卵圓形，貼壁后呈三角形或梭形。每100 mg軟骨組織可分離出原代軟骨細(xì)胞為3～5×105個(gè)，細(xì)胞存活率為90.0%。甲苯胺藍(lán)染色后細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見散在藍(lán)紫色異染顆粒。（2）原代滑膜細(xì)胞剛分離初為圓形，貼壁生長(zhǎng)后可見少量較大卵圓形細(xì)胞和較多梭形細(xì)胞，傳代后幾乎都為梭形。每100 mg滑膜組織可分離出原代滑膜細(xì)胞為1～2×106個(gè)。SMSCs表面抗原CD68、CD90和CD105檢測(cè)陽性率分別為0.5%、92.5%和90.7%。（3）對(duì)SMSCs的免疫組化、檢測(cè)顯示，與第1代軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)5 d、10 d后的第3代SMSCs對(duì)于Ⅱ型膠原的表達(dá)陽性率比單一生長(zhǎng)的第3代SMSCs要高。（4）對(duì)SMSCs的流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示，與第1代軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)5 d、10 d后的第3代SMSCs對(duì)于Ⅱ型膠原的表達(dá)陽性率比單一生長(zhǎng)的第3代SMSCs要高，并與免疫組化、檢測(cè)的結(jié)果相吻合。 結(jié)論 與第1代軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)的SMSCs對(duì)Ⅱ型膠原表達(dá)持上升，出現(xiàn)向軟骨細(xì)胞分化的現(xiàn)象。軟骨細(xì)胞能較好地誘導(dǎo)SMSCs向軟骨細(xì)胞分化。

軟骨細(xì)胞；滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞；共培養(yǎng)；組織工程

根據(jù)基質(zhì)的復(fù)合物組成不同，將軟骨分為彈性軟骨、纖維軟骨、纖維彈性透明軟骨[1]，其中在關(guān)節(jié)活動(dòng)中起主要作用的透明軟骨再生修復(fù)極其困難[2]，損傷后很少能夠自愈，嚴(yán)重影響患者的運(yùn)動(dòng)功能和正常生活質(zhì)量[3]。傳統(tǒng)治療關(guān)節(jié)軟骨損傷的方法比較局限，長(zhǎng)期隨訪結(jié)果均不太理想[4]。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)（autologous chon-drocyte implantation，ACI）為解決人體軟骨組織修復(fù)問題提供了一種新的治療途徑。ACI技術(shù)中種子細(xì)胞的獲取是一個(gè)非常重要的部分。有研究報(bào)道工程化軟骨組織形成的最佳細(xì)胞濃度高達(dá)5×1010/L，最佳形成時(shí)間為第6周[5]。體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞存在去分化現(xiàn)象，即隨著傳代次數(shù)及培養(yǎng)時(shí)間的增加，體外單層培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞失去原有的細(xì)胞生物特性，如Ⅱ型膠原、蛋白聚糖和SOX9等基因表達(dá)下降，Ⅰ型膠原表達(dá)增加[6]，極大限制了組織工程軟骨修復(fù)技術(shù)的發(fā)展。

本研究旨在通過創(chuàng)造一個(gè)與關(guān)節(jié)腔類似的微環(huán)境，將滑膜細(xì)胞用transwell小室與軟骨共培養(yǎng)[7]，再運(yùn)用免疫組化和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，共培養(yǎng)后滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSCs）向軟骨細(xì)胞的分化程度。

1 材料與方法

1.1 材料 4周齡的新西蘭大耳兔，購(gòu)自北京市昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng)，動(dòng)物許可證號(hào)為[SCXK（京）2011-0010]。Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司）；4%多聚甲醛溶液（北京索萊寶科技有限公司）；胰蛋白酶（北京leagen公司）；Ⅱ型膠原（上海sigma公司）；吐溫-20磷酸鈉緩沖液（北京leagen公司）；胎牛血清（上海Gibco公司）；甲苯胺藍(lán)染液（北京Leagene公司）；鼠抗兔Ⅱ型膠原一抗（Abcam公司，美國(guó)）；山羊抗鼠熒光二抗（Abcam公司，美國(guó)）；鼠抗人CD68、CD90、CD105多克隆抗體（武漢博士德生物科技公司）；Ⅱ型膠原免疫組化試劑盒（武漢博士德生物科技公司）。

1.2 細(xì)胞的分離培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和存活率的測(cè)定 （1）細(xì)胞分離培養(yǎng)：取4周齡新西蘭大耳兔處死，在無菌操作下取出膝關(guān)節(jié)處的軟骨和滑膜組織。分別將軟骨和滑膜組織塊剪成1 mm3碎塊，用加有雙抗的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗3次。分別置入裝有等體積0.25%胰蛋白酶的小燒杯中，與磁力攪拌器一起置于培養(yǎng)箱中37℃恒溫消化30 min。加培養(yǎng)液終止消化。隨后將小燒杯內(nèi)的碎塊和液體一同吸出，過100目過濾網(wǎng)過濾，棄掉濾液，將碎塊吸出，再用PBS洗3遍后，將軟骨碎塊放入裝有等體積0.2%Ⅱ型膠原酶的燒杯中，將滑膜碎塊放入裝有等體積0.2%Ⅰ型膠原酶的燒杯中分別與磁力攪拌器一起置于培養(yǎng)箱中37℃恒溫消化2 h。加培養(yǎng)液終止消化。再將小燒杯內(nèi)的混懸液用100目過濾網(wǎng)過濾，取濾液放入15 ml離心管中（2000 r/min，8 min）。（2）棄上清，加入培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞。（2）細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率測(cè)定：用細(xì)胞計(jì)數(shù)板對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。滴少許臺(tái)盼藍(lán)染液于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，活細(xì)胞不被染色，死細(xì)胞被染成藍(lán)色。調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，以1×104個(gè)/cm2的濃度接種于25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液。如小燒杯內(nèi)殘留組織碎塊較多，可再加入膠原酶進(jìn)行2次消化。當(dāng)培養(yǎng)瓶中細(xì)胞融合至80.0%以上時(shí)，可將細(xì)胞消化傳代培養(yǎng)。

1.3 軟骨細(xì)胞和SMSCs的鑒定 軟骨細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定：將第1代軟骨細(xì)胞制作成細(xì)胞爬片，用PBS輕輕沖洗3次，再浸泡于4%多聚甲醛溶液固定10 min。將爬片放入干凈培養(yǎng)皿中，滴入適量0.1%甲苯胺藍(lán)染液孵育4 h。無水乙醇沖洗3 min，干燥后顯微鏡觀察并拍照。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)SMSCs的鑒定：消化收集第3代SMSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度在1×106/ml，分別加入異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）、藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）、抗原提呈細(xì)胞（antigen presenting cell，APC）標(biāo)記的20 μl鼠抗人白細(xì)胞分化抗原68（cluster of differentiation 68，CD68）、CD90、CD105混勻，4℃避光孵育30 min，再用流式洗滌液洗滌離心3次后，加固定液重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。

1.4 SMSCs與軟骨細(xì)胞分層共培養(yǎng)體系的建立 消化收取第3代SMSCs，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)2×105/ml，接種于4塊帶transwell小室的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加入1 ml SMSCs懸液，分為A1、A2、B1、B2四組，每組6個(gè)樣本。同樣消化收取第1代軟骨細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)2×105/ml，A1、A2組在上層小室中加入1 ml第1代軟骨細(xì)胞懸液；B1、B2組在上層小室中加入1 ml第3代SMSCs，作為對(duì)照組。用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

調(diào)整第3代SMSCs濃度為1×105/ml，接種于2塊帶transwell小室的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，培養(yǎng)板孔中，放入圓形載玻片，每孔加入500 μl SMSCs懸液，制成細(xì)胞爬片，同樣分為C1、C2、D1、D2四組，每組4個(gè)樣本。同樣消化收取第1代軟骨細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度達(dá)1×105/ml，C1、C2組在上層小室中加入500 μl軟骨細(xì)胞懸液；D1、D2組在上層小室中加入500 μl SMSCs懸液，作為對(duì)照組。用以進(jìn)行免疫組化檢測(cè)。

1.5 SMSCsⅡ型膠原表達(dá)的免疫組化 將之前建立好的共培養(yǎng)體系中，對(duì)C1、D1在共培養(yǎng)5 d后，C2、D2組10 d后，對(duì)共培養(yǎng)后的SMSCs進(jìn)行Ⅱ型膠原表達(dá)的免疫組化檢測(cè)。將有SMSCs貼附的細(xì)胞爬片取出，吐溫-20磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution Tween-20，PBST）輕微沖洗3遍。在室溫下，用4%多聚甲醛浸泡固定。再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行透化、封閉。加鼠抗兔Ⅱ型膠原一抗孵育，在4℃的溫度下過夜。PBST輕輕漂洗3遍再加山羊抗鼠二抗孵育室溫避光處孵育1 h。輕輕漂洗3遍。涼干后，封片，盡快觀察。免疫組化：重復(fù)上述步驟，在加入二抗時(shí)選用博士德DBA（diaminobenzidine）顯色二抗染色。

1.6 SMSCs對(duì)Ⅱ型膠原表達(dá)的流式細(xì)胞檢測(cè) 將之前建立好的共培養(yǎng)體系中，A1、B1在共培養(yǎng)5 d后，A2、B2組10 d后，對(duì)共培養(yǎng)后的SMSCs進(jìn)行Ⅱ型膠原表達(dá)進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。消化收集細(xì)胞，加入鼠抗兔Ⅱ型膠原一抗孵育。PBS洗滌細(xì)胞3次。加入適用流式細(xì)胞檢測(cè)的熒光二抗孵育。PBS洗滌細(xì)胞3次，再用冰冷PBS重懸細(xì)胞，立即上機(jī)檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)每組測(cè)得的6個(gè)樣本細(xì)胞陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以x ±s表示，檢測(cè)數(shù)據(jù)正態(tài)性及方差齊性后，對(duì)相同天數(shù)不同組間和同組間不同天數(shù)分別采用析因方差分析（ANOVA），如交互效應(yīng)顯著，再進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)分析，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 軟骨細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率 原代軟骨

細(xì)胞重懸后初為卵圓形，在培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d貼壁后和培養(yǎng)7 d后的軟骨細(xì)胞鏡下觀察（圖1）。高倍鏡下可見軟骨細(xì)胞胞核清楚，為圓形、橢圓形較多。每100 mg透明軟骨約可分離出原代軟骨細(xì)胞3～5×105個(gè)，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活率約為90.0%。傳代后的第1代軟骨細(xì)胞貼壁多為梭形或多角形。

2.2 SMSCs的形態(tài)、細(xì)胞計(jì)數(shù)及存活率 原代滑膜細(xì)胞分為巨噬樣和成纖維樣細(xì)胞。48 h滑膜細(xì)胞大部分貼壁。巨噬樣滑膜細(xì)胞胞體較大呈卵圓形，有不規(guī)則短狀突起，胞核偏向一邊；成纖維樣滑膜細(xì)胞大量增殖生長(zhǎng)，胞體呈梭形，胞核呈卵圓形位于細(xì)胞中央。培養(yǎng)7 d時(shí)成纖維樣滑膜細(xì)胞鋪滿瓶底，巨噬樣滑膜細(xì)胞幾乎不可見（圖1）。每100 mg滑膜組織約可分離出原代滑膜細(xì)胞1～2×106個(gè)，臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)定細(xì)胞存活率約為90.0%。傳代后巨噬樣滑膜細(xì)胞基本不見，而成纖維樣滑膜細(xì)胞形態(tài)良好，呈指紋狀生長(zhǎng)。纖維樣滑膜細(xì)胞由胚胎干細(xì)胞分化而來，在純化傳代后，第3代的滑膜細(xì)胞即為SMSCs。形態(tài)多成梭形和多角形（圖1）。

圖1 貼壁軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞及軟骨細(xì)胞染色的鏡下觀察

2.3 軟骨細(xì)胞和SMSCs的鑒定 軟骨甲苯胺藍(lán)染色：軟骨細(xì)胞均被染色，可見較清晰細(xì)胞外形。細(xì)胞核深染，細(xì)胞質(zhì)淺染，鏡下觀察可區(qū)分。有藍(lán)紫色異染顆粒存在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)（圖1F）。SMSCs表面抗原的流式檢測(cè)：CD68是巨噬樣滑膜細(xì)胞表面標(biāo)志抗原，SMSCs表面標(biāo)志抗原也是多符合干細(xì)胞譜系的抗原，即CD90、CD105等。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果第3代SMSCs，CD68陽性率0.5%，CD90陽性率92.5%、CD105陽性率95.0%。傳代后，巨噬樣滑膜細(xì)胞基本消失，多為成纖維樣的SMSCs。

2.4 軟骨細(xì)胞對(duì)Ⅱ型膠原表達(dá)的免疫組化 在共培養(yǎng)5 d后，檢測(cè)C1、D1組的軟骨細(xì)胞對(duì)Ⅱ型膠原表達(dá)免疫組化，鏡下觀察C1組的陽性率比D1組的陽性率表達(dá)要高。共培養(yǎng)10 d后，檢測(cè)C2、D2組，鏡下觀察C2組陽性率表達(dá)比D2組高（圖2）。

圖2 兩組SMSCs不同時(shí)間的Ⅱ型膠原表達(dá)（免疫組化染色×200）

2.5 軟骨細(xì)胞對(duì)Ⅱ型膠原表達(dá)的流式細(xì)胞檢測(cè) 在共培養(yǎng)5 d時(shí)，對(duì)A1、B1組SMSCsⅡ型膠原表達(dá)的6個(gè)樣本進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，共培養(yǎng)10 d時(shí)，對(duì)A2、B2組6個(gè)樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：A1組Ⅱ型膠原表達(dá)率（11.2±1.2）%，B1組（3.3±1.2）%，A2組（17.4±1.9）%，B2組（3.6±1.1）%，共培養(yǎng)（F=362.60，P＜0.001）及時(shí)間因素（F=28.45，P＜0.001），交互作用顯著（F=23.40，P＜0.001）；再進(jìn)行簡(jiǎn)單效應(yīng)比較發(fā)現(xiàn)，A1組的Ⅱ型膠原表達(dá)率高于B1組（F=100.75，P＜0.001）；A2組的Ⅱ型膠原表達(dá)率分別高于A1組（F=51.82，P＜0.001）、B2組（F=285.34，P＜0.001）；B1、B2組表達(dá)率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討 論

ACI經(jīng)歷了3次更新?lián)Q代，從第1代到第3代基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)（matrix-induced autologous chondrocyte implantation，MACI），其治療效果得到了極大的改善和提高。張仲文等[8]報(bào)道了10例接受MACI治療的患者，術(shù)后隨訪1～2 年，均有較好的愈后，生活質(zhì)量顯著提高。隨著ACI技術(shù)的發(fā)展，對(duì)種子細(xì)胞這一重要內(nèi)容和難點(diǎn)的研究也得到飛速發(fā)展[9]。

本研究為了解軟骨細(xì)胞對(duì)于SMSCs誘導(dǎo)分化的影響，取同只實(shí)驗(yàn)兔子膝關(guān)節(jié)的滑膜和軟骨組織，采用兩步酶消化法獲取細(xì)胞，進(jìn)行分層共培養(yǎng)，模擬膝關(guān)節(jié)微環(huán)境。獲取細(xì)胞時(shí)注意控制好消化時(shí)間、酶的濃度和適宜溫度，使組織塊酶充分混合消化，可以極大地增加細(xì)胞獲取效率。軟骨細(xì)胞的細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)均為酸性，甲苯胺藍(lán)染液是一種堿性染料。細(xì)胞中陽離子能與之結(jié)合，染色為深藍(lán)色的是細(xì)胞核，染色為淺藍(lán)色的是細(xì)胞質(zhì)?？蓪?duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定[10]。對(duì)于軟骨細(xì)胞的鑒定可通過細(xì)胞形態(tài)觀察和甲苯胺藍(lán)染色[11]。軟骨細(xì)胞貼壁后剛開始是三角或多角形，集落生長(zhǎng)80%融合后，呈“鋪路石”樣典型的軟骨細(xì)胞形態(tài)[12]。

原代滑膜細(xì)胞分為巨噬樣滑膜細(xì)胞和成纖維樣滑膜細(xì)胞，經(jīng)過傳代陪養(yǎng)后，增殖活性低的巨噬樣滑膜細(xì)胞逐漸消失，剩下是增殖活性高的SMSCs。SMSCs也具有干細(xì)胞譜系的大部免疫表型，主要對(duì)CD9、CD105高度表達(dá)，巨噬樣滑膜細(xì)胞對(duì)CD68具有特異性，因此對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行CD90、CD105和CD68的流式細(xì)胞檢測(cè)，可以對(duì)SMSCs進(jìn)行鑒定分離[13]。但是CD90、CD105對(duì)于SMSCs特異性較差，目前對(duì)于其較高特異性表達(dá)的鑒定還有待進(jìn)一步研究。

共培養(yǎng)的技術(shù)分為接觸式和非接觸式，常見的共培方式有單層共培養(yǎng)、分層滲透共培養(yǎng)、懸浮共培養(yǎng)、細(xì)胞團(tuán)塊共培養(yǎng)、細(xì)胞層共培養(yǎng)及三維支架共培養(yǎng)[14]。在滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的共培養(yǎng)體系上，本研究采用的是插入式細(xì)胞培養(yǎng)皿,即transwell小室培養(yǎng)系統(tǒng)。培養(yǎng)時(shí)將小室插入杯內(nèi)以建立細(xì)胞的共培養(yǎng)[7]，從而很好地實(shí)現(xiàn)了關(guān)節(jié)腔內(nèi)微環(huán)境的模擬。

滑膜細(xì)胞在傳第3代后基本都為SMSCs，且具有較高增殖活性和分化原性。而軟骨細(xì)胞在原代還處于生長(zhǎng)潛伏期，在第1代具有較高增殖活性和細(xì)胞生物活性，繼續(xù)體外培養(yǎng)從P2代以后開始出現(xiàn)去分化現(xiàn)象，細(xì)胞外基質(zhì)的分泌改變，最先是蛋白糖胺聚糖的分泌減少，第3代開始出現(xiàn)Ⅱ型膠原、蛋白聚糖和SOX9等基因表達(dá)的下調(diào)[15，16]。因此，選取具有較高增殖活性劑分化原性的第3代SMSCs細(xì)胞與同樣具有較高增殖活性和細(xì)胞生物活性的軟骨細(xì)胞第1代進(jìn)行共培養(yǎng)。

檢測(cè)方法選擇上，采用免疫組化及流式細(xì)胞檢測(cè)。軟骨細(xì)胞相對(duì)其他細(xì)胞特異性且大量的表達(dá)Ⅱ型膠原。在共培養(yǎng)組中，上層小室中的細(xì)胞也會(huì)分泌Ⅱ型膠原到培養(yǎng)液中，所以測(cè)量培養(yǎng)液中Ⅱ型膠原含量方法并不準(zhǔn)確。而免疫組化及流式細(xì)胞檢測(cè)能比較準(zhǔn)確的反應(yīng)下層SMSCs對(duì)Ⅱ型膠原在胞質(zhì)內(nèi)的表達(dá)情況[17]。根據(jù)SMSCs的增殖和分化的特性取5 d、10 d進(jìn)行檢測(cè)，培養(yǎng)時(shí)間過短，細(xì)胞增殖分化程度差異不明顯，培養(yǎng)時(shí)間過長(zhǎng)細(xì)胞貼滿平底，對(duì)檢測(cè)結(jié)果也會(huì)有影響[18]。對(duì)SMSCs免疫組化檢測(cè)后，鏡下的直觀觀察，再結(jié)合流式細(xì)胞儀檢測(cè)的SMSCs對(duì)Ⅱ型膠原的表達(dá)陽性率值的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，可表明軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)SMSCs分化的影響。

本研究顯示，SMSCs和軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)后對(duì)Ⅱ型膠原表達(dá)持續(xù)上升，出現(xiàn)向軟骨細(xì)胞分化的現(xiàn)象，軟骨細(xì)胞能有效誘導(dǎo)SMSCs向軟骨細(xì)胞分化。但要完全明確其對(duì)SMSCs分化的影響，還需對(duì)SMSCs在基因水平，以及分化后細(xì)胞特性保持和利用上進(jìn)行大量的研究。伴隨著組織工程學(xué)的進(jìn)步和發(fā)展，本研究相信隨著研究的深入和探索，不久的將來或發(fā)展出能對(duì)軟骨細(xì)胞大量增殖有能維持其性狀表型的培養(yǎng)方式。

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（2017-01-08收稿 2017-04-16修回）

（本文編輯 羅發(fā)菊）

Effects of chondrocytes on the induction of differentiation of synovial mesenchymal stem cells

XU Xun'an, CONG Bo, HAN Long, YAO Wanglin, and ZHANG Zhongwen. The Fourth Department of Orthopaedics, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China

ZHANG Zhongwen, E-mail: zhang6816151@163.com

Objective This study was conducted to determine the effect of chondrocytes on the differentiation of SMSCs into chondrocytes. Methods (1) Primary chondrocytes and SMSCs were digested and separated, the cells were subcultured after their viability and counting were determined. The growth of chondrocytes and SMSCs was observed under microscope, and chondrocytes and SMSCs were identified. (2) The 1st generation chondrocytes and the 3rd generation SMSCs were co-cultured, and the 3rd generation SMSCs was cultured as control group. (3) After 5 days and 10 days, immunohistochemistry and flow cytometry were both performed on SMSCs, respectively. The effect of chondrocytes on the differentiation of SMSCs was observed by observing the expression of type Ⅱ collagen in SMSCs. SPSS17.0 software was used to analyze the data measured by flow cytometry. Results (1) Primary chondrocytes were oval in shape when it was just seperated out at the beginning, and displayed triangular or spindle after adherent to the wall. Each 100 mg cartilage tissue can be isolated from the original chondrocytes of about 3-5×105. The cell viability was determined to be about 90% by trypan blue staining. Toluidine blue staining after the cytoplasm can be seen scattered in the blue and purple stained particles. (2) Primary synovial cells just isolated early round, adherent growth can be seen after a small amount of larger oval cells and more spindle cells, after passing almost all are spindleshaped. Each 100 mg synovial tissue can be isolated from the original synovial cells of about 1.5×106. The positive rates of CD68, CD90 and CD105 in synoviocytes were 0.5%, 92.5% and 90.7%, respectively. (3) The immunohistochemical assay of SMSCs showed that the expression of 3rd generation SMSCs for type Ⅱ collagen was higher than that of single-growth 3rd generation SMSCs for 5 days and 10 days. (4) Flow cytometry analysis of SMSCs showed that the expression of 3rd generation SMSCs for type Ⅱ collagen was higher than that of single-growth 3rd generation SMSCs, which was consistent with the detection results of immunohistochemistry. Conclusions The expression of typeⅡ collagen in SMSCs cocultured with chondrocytes continued to increase and the differentiation into chondrocytes appeared. Chondrocytes can induce the differentiation of SMSCs into chondrocytes.

chondrocytes; synovial mesenchymal stem cells; co-culture; tissue engineering

R681.3；R686.7

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.05.008

首都特色臨床應(yīng)用研究（Z161100000516013）

100039 北京，武警總醫(yī)院骨四科

張仲文，E-mail: zhang6816151@163.com