胃促生長(zhǎng)素對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及線粒體融合蛋白2表達(dá)的影響

何永銘,宋明寶△,胡建波,張?jiān)雌?李佑美

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400037)

胃促生長(zhǎng)素對(duì)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖及線粒體融合蛋白2表達(dá)的影響

何永銘1,宋明寶1△,胡建波1,張?jiān)雌?,李佑美1

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院心血管內(nèi)科，重慶 400037)

目的 通過體外培養(yǎng)人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HASMCs)，研究胃促生長(zhǎng)素(ghrelin)對(duì)血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖及線粒體融合蛋白2(Mfn-2)表達(dá)的影響。 方法 體外培養(yǎng)HASMCs，第4～6代細(xì)胞用于試驗(yàn)。給予不同濃度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)的ghrelin 或10-6mol/L ghrelin不同時(shí)間(0、6、12、18、24 h)處理，用四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MMT)法觀察其對(duì)HASMC增殖的影響。RT-PCR，Western blot方法檢測(cè)不同處理方法對(duì)Mfn-2表達(dá)的影響。結(jié)果 10-7～10-5mol/L的ghrelin可明顯抑制HASMC增殖，濃度為10-6mol/L抑制作用最為明顯 (P<0.01)。ghrelin在6～24 h內(nèi)均能明顯抑制HASMC增殖，在24 h達(dá)最高峰 (P<0.01)。10-6mol/L ghrelin能明顯上調(diào)Mfn-2 mRNA和蛋白的表達(dá) (P<0.01)。10-6mol/L ghrelin在18 h上調(diào)Mfn-2 mRNA和蛋白表達(dá)的作用最為明顯 (P<0.01)。結(jié)論 ghrelin可能通過上調(diào)Mfn-2的表達(dá)來(lái)抑制HASMC增殖。

胃促生長(zhǎng)素；肌，平滑，血管；主動(dòng)脈；人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞；增殖；線粒體融合蛋白-2

血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖過度并向內(nèi)膜下遷移是血管增殖性疾病的主要發(fā)病機(jī)制。胃促生長(zhǎng)素(ghrelin)是90年代發(fā)現(xiàn)的生長(zhǎng)激素促分泌素受體(GHSR)的內(nèi)源性配體。研究發(fā)現(xiàn)，ghrelin除具有促生長(zhǎng)激素釋放功能外，還具有心臟保護(hù)功能，抑制炎癥反應(yīng)及炎癥相關(guān)的小鼠結(jié)腸癌變[1-4]，保護(hù)血管內(nèi)皮功能[5]等作用,而轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)錄因子kappa B(NF-κB)、Nkx2.2可調(diào)控人類ghrelin的啟動(dòng)子活性[6]；還有研究發(fā)現(xiàn)，女性外周血中g(shù)hrelin的水平與頸動(dòng)脈內(nèi)膜的厚度呈負(fù)相關(guān)[7-8]，推測(cè)ghrelin可能對(duì)動(dòng)脈再狹窄有抑制作用。線粒體融合蛋白2(Mitofusin 2，Mfn-2)又命名為增殖抑制基因,它被發(fā)現(xiàn)于1997年，因能夠抑制VSMC增殖而得名。Mfn-2能抑制大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷后誘導(dǎo)的再狹窄[9]，而Mfn-2缺陷通過干擾細(xì)胞自噬來(lái)抑制細(xì)胞增殖[10]。本文擬通過體外培養(yǎng)HASMCs，研究ghrelin對(duì)VSMC增殖及Mfn-2表達(dá)的影響，探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(human aortic smooth muscle cells，HASMCs)購(gòu)自美國(guó)Sciencell公司。

1.1.2 試驗(yàn)儀器 熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，美國(guó))，凝膠成像分析系統(tǒng)(UVP公司，美國(guó))，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(Bio-Rad公司，美國(guó))，PCR儀(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 ghrelin(Sigma公司，美國(guó))，胎牛血清(Sciencell公司，美國(guó))，SMCM培養(yǎng)基(Sciencell公司，美國(guó))，四甲基偶氮唑藍(lán)比色(MTT)試劑盒(江蘇碧云天生物公司)；大鼠抗人Mfn-2單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó)),大鼠抗人GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國(guó)),辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗(江蘇碧云天生物公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒(TAKARA公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 HASMCs培養(yǎng)及試驗(yàn)分組 HASMCs在含20.00%胎牛血清的SMCM培養(yǎng)基中于37 ℃、5.00%CO2條件下培養(yǎng)，細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)80.00%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶2比例進(jìn)行傳代。取第4～6代呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的HASMCs細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80.00%融合，無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換為試驗(yàn)用液。分為空白對(duì)照組(0 mol/L ghrelin),不同濃度ghrelin組(藥物終濃度分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L),不同時(shí)間組(10-6mol/L ghrelin,0、6、12、18、24 h)。

1.2.2 細(xì)胞增殖活力檢測(cè)(MTT法) 以5×103/孔的密度接種于96孔板內(nèi)，37 ℃、5.0%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h。在細(xì)胞約80.0%融合狀態(tài)下，96孔板中的HASMCs換上含0.2% BSA的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，換以含0.2% BSA的含藥培養(yǎng)基，孵育48 h后換上MTT液100 μL，繼續(xù)孵育4 h，然后將培養(yǎng)基吸干，每孔加入200 μL二甲基亞砜，混勻后于酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)光密度(OD)值，以檢測(cè)細(xì)胞的數(shù)目和活力。

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)法檢測(cè)Mfn-2的表達(dá) 收集處理完畢后的6孔板中的細(xì)胞，用4 ℃預(yù)冷PBS(0.01 mol/L，pH7.2～7.3)洗3遍，加入1 mL TRizol溶液裂解，按TRizol試劑盒使用說(shuō)明書提取總RNA，以DNA/RNA測(cè)定儀測(cè)定RNA的濃度和純度。將2 μL總RNA加入到20 μL體系中按逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒使用說(shuō)明書合成cDNA待用。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參照。Mfn-2目的片段為2 271 bp，引物序列為：5′-ATG TCC CTG CTC TTC TCT CGA TGC-3′(上游)和5′-TCT GCT GGG CTG CAG GTA CTG GT-3′(下游)；GAPDH引物序列：5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′(上游)和5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′(下游)。PCR條件94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共32個(gè)循環(huán)；再72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳并在紫外光下顯像。

1.2.4 Western blot法檢測(cè) 制作10%的分離膠和5%積層膠進(jìn)行蛋白電泳，通過電轉(zhuǎn)移法將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含3%血清的TBS-T封閉1 h，分別加入3%血清的TBS-T稀釋的1∶3 000鼠抗人Mfn-2單克隆抗體一抗4 ℃孵育過夜，再同結(jié)合辣根過氧化物酶的二抗孵育1 h，用化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)結(jié)果，采用GAPDH作為內(nèi)參照。

2 結(jié) 果

2.1 HASMCs形態(tài)學(xué)觀察 培養(yǎng)的第4～6代人HASMCs在顯微鏡下觀察可見呈典型“峰-谷”狀生長(zhǎng)。細(xì)胞形體多呈長(zhǎng)梭形，核大，可見明顯的肌絲纖維，見圖1。

A:典型“峰-谷”狀生長(zhǎng)(×40);B:細(xì)胞形體多呈長(zhǎng)梭形、核大(×100)。

圖1 HASMCs形態(tài)學(xué)觀察

2.2 ghrelin對(duì)HASMC增殖的影響 與空白對(duì)照組相比，ghrelin在10-7～10-5mol/L濃度范圍內(nèi)均可抑制HASMC增殖，其中以10-6mol/L ghrelin抑制增殖的作用最為明顯，10-6mol/L ghrelin組與空白對(duì)照組OD值比較：(45.74±4.78)%vs.(91.48±6.85)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與0 h組相比，ghrelin在6～24 h均可抑制HASMC增殖，24 h達(dá)到高峰[36.22±0.81)%vs.(57.28±0.99)%，P<0.01]，見圖2。

A:不同濃度ghrelin對(duì)HASMC的增殖作用；B：不同時(shí)間ghrelin(10-6mol/L)對(duì)HASMC的增殖作用。*：P<0.05，與0 mol/L比較。#：P<0.05，與10-6mol/L組比較;△:P<0.05，與0 h比較。

圖2 ghrelin對(duì)HASMC增殖的影響

2.3 ghrelin對(duì)Mfn-2 mRNA表達(dá)的影響 對(duì)照組Mfn-2 mRNA為1.0。10-7～10-5mol/L的ghrelin均能明顯上調(diào)Mfn-2 mRNA的表達(dá)(10-7、10-6、10-5mol/L ghrelin 分別為：2.44±0.55、2.70±0.45和2.71±0.46，P<0.05)。10-6mol/L ghrelin在12～24 h內(nèi)能明顯上調(diào)Mfn-2 mRNA的表達(dá)，18 h達(dá)最高峰(4.48±1.57，P<0.01)，但在6 h，ghrelin對(duì)Mfn-2 mRNA的表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05)，見圖3。

A:不同濃度ghrelin對(duì)Mfn-2 mRNA的作用；B：不同時(shí)間ghrelin對(duì)Mfn-2 mRNA的作用。*：P<0.05，與0 mol/L比較。#：P<0.05，與10-6mol/L組比較;△:P<0.05，與0 h比較。

圖3 ghrelin對(duì)Mfn-2 mRNA表達(dá)的影響

A:不同濃度ghrelin對(duì)Mfn-2蛋白的作用；B：不同時(shí)間ghrelin對(duì)Mfn-2蛋白的作用。*：P<0.05，與0 mol/L比較;#:P<0.05，與0 h比較。

圖4 ghrelin對(duì)Mfn-2蛋白表達(dá)的影響

2.4 ghrelin對(duì)Mfn-2蛋白表達(dá)的影響 對(duì)照組Mfn-2 蛋白為1.0。10-8～10-5mol/L濃度的ghrelin均能上調(diào)Mfn-2蛋白的表達(dá)，在10-6mol/L ghrelin達(dá)最高峰(2.46±0.11，P<0.01)。而10-9mol/L濃度的ghrelin對(duì)Mfn-2蛋白表達(dá)無(wú)影響(P>0.05)。ghrelin在12～24 h內(nèi)能明顯上調(diào)Mfn-2蛋白的表達(dá)，18 h達(dá)最高峰(2.18±0.03，P<0.01)。而18 h和24 h之間蛋白表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、支架內(nèi)再狹窄等血管增殖性疾病的發(fā)病率逐年增加。目前已證實(shí)，VSMC增殖-凋亡失衡是此類疾病的主要特征。抑制VSMC增殖，有望成為預(yù)防和治療血管增殖性疾病新的方法。

ghrelin是1999年Kojima等[11]發(fā)現(xiàn)的一種可促進(jìn)生長(zhǎng)激素釋放的?；摹＝暄芯堪l(fā)現(xiàn)，ghrelin具有廣泛的生理作用，且與心血管疾病、免疫炎癥反應(yīng)、糖尿病、腫瘤等密切相關(guān)。研究認(rèn)為ghrelin是一個(gè)心臟保護(hù)因子，可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖[12]，具有血管內(nèi)皮保護(hù)功能，但對(duì)血管平滑肌的作用目前仍不清楚。本研究結(jié)果顯示， ghrelin能抑制HASMC增殖且能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，推測(cè)其對(duì)動(dòng)脈再狹窄有抑制作用。

Mfn-2是具有抑制VSMC增殖功能的基因，參與血管平滑肌細(xì)胞分化，有望成為血管增殖性疾病干預(yù)的新靶點(diǎn)[13]。研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷再狹窄模型上，適度上調(diào)Mfn-2的表達(dá)可以明顯抑制VSMC增殖，抑制率分別為97.2%和82.0%[14]，Mfn-2在控制細(xì)胞增殖中起重要作用。

本課題組發(fā)現(xiàn)在HASMCs，ghrelin上調(diào)Mfn-2 mRNA和蛋白的表達(dá)和其抑制HASMC增殖的作用在濃度和時(shí)間上基本上是一致的，也就是說(shuō)ghrelin在上調(diào)Mfn-2的表達(dá)的同時(shí)能明顯抑制HASMC增殖。這提示，ghrelin可能通過上調(diào)Mfn-2的表達(dá)來(lái)抑制HASMC增殖。進(jìn)一步探討ghrelin在心血管疾病發(fā)病過程中的作用及機(jī)制，可為心血管疾病的防治提供新的靶點(diǎn)。

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Effect of ghrelin on proliferation and mitofusin-2 expression of human aortic smooth muscle cells

HeYongming1,SongMingbao1△,HuJianbo1,ZhangYuanping1,LiYoumei1

(DepartmentofCardiology,XinqiaoHospitalofThirdMedicalMilitaryUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To investigate the effects of ghrelin on proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) and the expression of mitochondrial fusion 2 (Mfn-2) in cultured human aortic smooth muscle cells (HASMCs).Methods HASMCs were cultured in vitro，treated with different concentrations(10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol/L)ghrelin or 10-6mol/L ghrelin for different time(0，6，12，18，24 h).Subconfluent HASMCs at passage 4-6 were used in experiments.MTT essay was used to investigate the effect on proliferation of HASMCs.RT-PCR and Western blot were used to analyse the expression of Mfn-2.Results 10-7-10-5mol/L ghrelin inhibited the proliferation of HASMCs,and the inhibitory effect of concentration of 10-6mol/L was the most obvious(P<0.01).Ghrelin inhibited the proliferation of HASMCs in 6-24 h，and it reached the peak at 24 h(P<0.01).10-6mol/L ghrelin significantly increased the expression of Mfn-2 mRNA and protein(P<0.01).The up-regulation of 10-6mol/L ghrelin on Mfn-2 mRNA and protein expression reached the peak at 18 h(P<0.01).Conclusion Ghrelin might inhibit the proliferation of HASMC by up-regulating the expression of Mfn-2.

ghrelin；muscle,smooth,vascular；aorta;human aortic smooth muscle cells；proliferation;mitofusin 2

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.006

何永銘(1976-)，主治醫(yī)師，本科，主要從事冠心病臨床與基礎(chǔ)方面研究?！?/p>

,E-mail：smb0939@163.com。

R543.1

A

1671-8348(2017)15-2034-03

2016-11-26

2017-01-14)