外植體類型和培養(yǎng)基中激素濃度對香茶菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

劉 芳， 陶興魁， 張愛民， 滕井通， 丁盼盼， 薛建平，①

(1. 宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 安徽 宿州 234101； 2. 宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院， 安徽 宿州 234000； 3. 淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 淮北 235000)

外植體類型和培養(yǎng)基中激素濃度對香茶菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

劉 芳1， 陶興魁2， 張愛民3， 滕井通3， 丁盼盼3， 薛建平3，①

(1. 宿州職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 安徽 宿州 234101； 2. 宿州學(xué)院生物與食品工程學(xué)院， 安徽 宿州 234000； 3. 淮北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 安徽 淮北 235000)

香茶菜〔Isodonamethystoides(Benth.) H. Hara〕為唇形科(Lamiaceae)香茶菜屬〔Isodon(Schrader ex Benth.) Spach〕植物[1]，又名“王棗子”[2]，廣泛分布于江蘇、安徽、浙江、河南、湖北和廣西等省(自治區(qū))，為安徽宿州著名的傳統(tǒng)藥食兩用植物，以莖葉入藥，其主要活性成分為萜類化合物，具有一定的抑菌、殺菌和抗腫瘤作用，且無副作用[3-6]。自20世紀(jì)80年代以來，人們逐漸意識到香茶菜的經(jīng)濟(jì)價值并推廣應(yīng)用，但大規(guī)模的無序挖掘?qū)е缕湟吧Y源數(shù)量急劇下降，目前僅在偏僻山區(qū)有零星分布。

為滿足香茶菜的市場需求，保護(hù)香茶菜的野生資源，應(yīng)擴(kuò)大香茶菜的人工栽培規(guī)模并提升其產(chǎn)量和質(zhì)量。為此，作者研究了外植體類型和培養(yǎng)基中不同激素濃度對香茶菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響，以期篩選出適宜于香茶菜愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)條件，為該種類的組織培養(yǎng)以及人工繁殖技術(shù)的研究奠定基礎(chǔ)，并為利用植物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)對其有效成分進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

供試香茶菜種子于2014年10月采自宿州市夾溝。定株采種后挑選飽滿的種子，用1 mg·L-1GA3浸泡12 h，然后將種子用流水沖洗2～3 h；用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇消毒5～10 s，無菌水沖洗2～3次；然后用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)0.1%HgCl2溶液消毒5 min，無菌水沖洗2～3次；最后吸干種子表面水分接入MS培養(yǎng)基中，置于溫度(25±1) ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照時間10 h·d-1條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)約15 d得到供試的無菌苗。

1.2 方法

1.2.1 外植體類型的比較實驗 在超凈工作臺上將供試香茶菜無菌苗的莖和葉分別剪成0.5～0.8 cm小段，參照同屬植物總序香茶菜〔Isodonracemosa(Hemsl.) Hara〕的組織培養(yǎng)條件[7]，將無菌苗葉片和莖段分別接入添加了0.1 mg·L-16-BA和1.0 mg·L-12，4-D的MS培養(yǎng)基(含30 g·L-1蔗糖和7 g·L-1瓊脂，pH 5.8)中，葉片和莖段分別接種4瓶，每瓶接入4～6個外植體；置于溫度(25±1) ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照時間10 h·d-1條件下培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)過程中外植體的變化并拍照記錄，篩選出愈傷組織誘導(dǎo)效果較優(yōu)的外植體類型。

1.2.2 培養(yǎng)基中激素濃度的正交實驗設(shè)計 采用L9(32)正交實驗設(shè)計2因素(6-BA和2，4-D質(zhì)量濃度)3水平正交實驗，其中，6-BA質(zhì)量濃度設(shè)置為0.1、0.2和0.3 mg·L-1，2，4-D質(zhì)量濃度設(shè)置為1.0、1.5和2.0 mg·L-1，將不同質(zhì)量濃度6-BA和2，4-D分別添加至上述MS培養(yǎng)基中，共9組培養(yǎng)基。

根據(jù)上述外植體篩選的結(jié)果，選擇香茶菜無菌苗莖段作為外植體，在超凈工作臺上分別將供試無菌苗莖段接種至上述9組培養(yǎng)基中，每組培養(yǎng)基接種4瓶，每瓶接入4～6個無菌苗莖段；置于溫度(25±1) ℃、光照度2 000～3 000 lx、光照時間10 h·d-1條件下培養(yǎng)，定期觀察并記錄外植體的愈傷組織誘導(dǎo)狀況，共培養(yǎng)30 d。根據(jù)愈傷組織的統(tǒng)計結(jié)果計算愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.3 數(shù)據(jù)計算和分析

按照公式“愈傷組織誘導(dǎo)率=(誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù))×100 %”計算各組培養(yǎng)基中愈傷組織的誘導(dǎo)率，采用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行極差分析和方差分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 外植體類型對香茶菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

香茶菜葉片和莖段愈傷組織的誘導(dǎo)狀況見圖1。觀察結(jié)果表明：培養(yǎng)約9 d，部分莖段的兩端切口處開始膨大，并誘導(dǎo)出淡黃色愈傷組織(圖1-A)；培養(yǎng)約16 d，個別葉片邊緣微卷，傷口處有少量愈傷出現(xiàn)(圖1-B)，葉片表面出現(xiàn)淡黃色的透明顆粒。從誘導(dǎo)所需時間和愈傷組織生長狀況看，莖段的愈傷組織誘導(dǎo)效果優(yōu)于葉片。

A： 培養(yǎng)9 d莖段愈傷組織的誘導(dǎo)狀況 Status of callus induction from stem segments cultured for 9 d； B： 培養(yǎng)16 d葉片愈傷組織的誘導(dǎo)狀況 Status of callus induction from leaves cultured for 16 d.圖1 香茶菜莖段和葉片愈傷組織誘導(dǎo)狀況的比較Fig. 1 Comparison on status of callus induction from stem segments and leaves of Isodon amethystoides (Benth.) H. Hara

2.2 激素濃度對香茶菜愈傷組織誘導(dǎo)的影響

不同激素濃度對香茶菜莖段愈傷組織誘導(dǎo)影響的正交實驗結(jié)果見表1。

由表1可見：在添加不同質(zhì)量濃度6-BA和2，4-D的9組培養(yǎng)基中，香茶菜莖段均能誘導(dǎo)出愈傷組織。其中，在6號培養(yǎng)基(添加0.2 mg·L-16-BA和2.0 mg·L-12，4-D)中愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為72%；在8號培養(yǎng)基(添加0.3 mg·L-16-BA和1.5 mg·L-12，4-D)中愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為93%；在5號培養(yǎng)基(添加0.2 mg·L-16-BA和1.5 mg·L-12，4-D)中愈傷組織誘導(dǎo)率次之，為92%。從莖段形態(tài)看，培養(yǎng)約10 d部分莖段的兩端切口處開始膨大并呈不對稱的啞鈴型，淡黃色；培養(yǎng)20 d后莖段兩端均不同程度膨大；培養(yǎng)30 d后絕大部分莖段均已長出愈傷組織。

極差分析結(jié)果表明：因子B(2，4-D質(zhì)量濃度)的極差較大，因子A(6-BA質(zhì)量濃度)的極差較小，表明2，4-D質(zhì)量濃度對香茶菜莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響效應(yīng)相對較大，而6-BA質(zhì)量濃度對莖段愈傷組織誘導(dǎo)的影響效應(yīng)相對較小。方差分析結(jié)果表明：因子B(2，4-D質(zhì)量濃度)對莖段的愈傷組織誘導(dǎo)有顯著作用(P<0.05)，而因子A(6-BA質(zhì)量濃度)對莖段的愈傷組織誘導(dǎo)無顯著作用(P=0.567)，與極差分析結(jié)果一致。

由極差分析結(jié)果可知：適合香茶菜莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最優(yōu)激素組合為A1B2，即0.1 mg·L-16-BA和1.5 mg·L-12，4-D。

表1 培養(yǎng)基中激素濃度對香茶菜莖段愈傷組織誘導(dǎo)影響的正交實驗結(jié)果1)

Table 1 Orthogonal experiment result for effect of hormone concentration in culture medium on callus induction from stem segments ofIsodonamethystoides(Benth.) H. Hara1)

培養(yǎng)基序號No.ofmedium因子和水平FactorandlevelAB愈傷組織誘導(dǎo)率/%Inductionrateofcallus10.11.08420.11.58730.12.08340.21.08050.21.59260.22.07270.31.08380.31.59390.32.078K184.782.3K281.390.7K384.777.7R3.413.0

1)A： 6-BA質(zhì)量濃度 Mass concentration of 6-BA (mg·L-1)； B： 2，4-D質(zhì)量濃度 Mass concentration of 2，4-D (mg·L-1).K1，K2，K3： 分別表示各因子同一水平的實驗結(jié)果的平均值Representing the average of the experiment results of each factor in the same level.R： 極差 Range.

3 結(jié) 論

觀察結(jié)果表明：與葉片相比，以莖段作為外植體，獲得的愈傷組織量大且疏松，因此，對于香茶菜的組織培養(yǎng)，莖段是較為合適的外植體。由正交實驗結(jié)果可見：培養(yǎng)基中2，4-D質(zhì)量濃度對香茶菜莖段愈傷組織的誘導(dǎo)影響效應(yīng)相對較大，可見在香茶菜莖段組織培養(yǎng)過程中2，4-D質(zhì)量濃度對其愈傷組織誘導(dǎo)起關(guān)鍵作用，這與張獻(xiàn)龍等[8]的研究結(jié)果一致。根據(jù)上述實驗結(jié)果，獲得香茶菜莖段愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基為添加0.1 mg·L-16-BA和1.5 mg·L-12，4-D的MS培養(yǎng)基(含30 g·L-1蔗糖和7 g·L-1瓊脂，pH 5.8)。

本研究初步篩選出香茶菜莖段愈傷組織誘導(dǎo)的最適培養(yǎng)基，但其他植物生長調(diào)節(jié)劑對其愈傷組織誘導(dǎo)的影響及不同形態(tài)愈傷組織的誘導(dǎo)條件還有待進(jìn)一步研究；另外，還需對不定芽誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)條件、試管苗生根培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，完善香茶菜組織培養(yǎng)技術(shù)，以期為香茶菜的規(guī)模化種植提供優(yōu)良種苗。此外，以本實驗獲得的愈傷組織為材料，摸索愈傷組織懸浮培養(yǎng)條件，可為香茶菜藥用活性成分的工廠化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

[1] RAVEN P H， WU Z Y. Flora of China： Vol. 17[M]. Beijing： Science Press， 1994： 273-274.

[2] 安徽省宿縣地方志編纂委員會. 宿縣縣志[M]. 黃山： 黃山書社出版， 1988： 76.

[3] 李廣義， 王玉蘭， 徐宗沛， 等. 王棗子化學(xué)成分的研究[J]. 藥學(xué)學(xué)報， 1981， 16(9)： 9-13.

[4] 王先榮， 王兆全， 石鵬程， 等. 王棗子的新二萜： 王棗子甲素[J]. 安徽醫(yī)學(xué)， 1982(2)： 50-53.

[5] 崔 佳， 施務(wù)務(wù)， 宿 玉， 等. 王棗子三萜成分的研究[J]. 安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 2011， 30(3)： 57-59.

[6] 張修華. 草藥王棗子抗菌作用的臨床應(yīng)用[J]. 煤礦醫(yī)學(xué)， 1982， 4(5)： 13-15.

[7] 丁 蘭， 呂軍旺， 汪漢卿. 總序香茶菜的組織培養(yǎng)與快繁研究[J]. 中草藥， 2005， 36(1)： 115-117.

[8] 張獻(xiàn)龍， 唐克軒. 植物生物技術(shù)[M]. 北京： 科學(xué)出版社， 2004： 65.

(責(zé)任編輯： 郭嚴(yán)冬)

Effects of explant type and hormone concentration in medium on callus induction ofIsodonamethystoides

LIU Fang1， TAO Xingkui2， ZHANG Aimin3， TENG Jingtong3， DING Panpan3， XUE Jianping3，①

(1. Suzhou Vocational and Technical College， Suzhou 234101， China； 2. School of Biological and Food Engineering， Suzhou University， Suzhou 234000， China； 3. College of Life Science， Huaibei Normal University， Huaibei 235000， China)，

J.PlantResour. &Environ.， 2017， 26(1)： 113-115

Effects of explant type (leaf and stem segment) and hormone concentration (0.1， 0.2 and 0.3 mg·L-16-BA； 1.0， 1.5 and 2.0 mg·L-12，4-D) in medium on callus induction ofIsodonamethystoides(Benth.) H. Hara were studied by using single-factor and L9(32) orthogonal experiments. The results show that compared with callus induction from leaves， calli can be induced from stem segments within a short time， which are loose and large in quantity. The results of orthogonal experiment show that the callus induction rate of stem segments ofI.amethystoidesvaries from 72% to 93% in different media， in which， mass concentration of 2，4-D has a significant (P<0.05) effect on callus induction rate， while that of 6-BA has no significant effect. According to the results， MS medium (containing 30 g·L-1sucrose and 7 g·L-1agar， pH 5.8) with 0.1 mg·L-16-BA and 1.5 mg·L-12，4-D is considered as an optimum medium for callus induction from stem segments ofI.amethystoides.

香茶菜； 外植體類型； 激素濃度； 正交實驗

Isodonamethystoides(Benth.) H. Hara； explant type； hormone concentration； orthogonal experiment

2016-12-09

安徽省高校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目(2013SQRL151ZD)； 淮北市人才培育計劃(20140315)； 宿州學(xué)院特色種植業(yè)苗種生產(chǎn)工程技術(shù)研究中心開放課題(2014XKF19)； 安徽省高校自然科學(xué)研究項目(KJ2014B21)

劉 芳(1982—)，女，安徽濉溪人，博士，副教授，主要從事生物技術(shù)及園林植物應(yīng)用方面的研究。

①通信作者E-mail： xuejp@163.com

Q813.1+2； Q945

A

1674-7895(2017)01-0113-03

10.3969/j.issn.1674-7895.2017.01.17