XRCC1基因多態(tài)性對晚期胃癌患者化療療效及生存期的影響Δ

鐘蘭，符生苗，謝賢和，黃濤，高允鎖，林瑜（.海南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，?？?70；.海南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，?？?70；.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院化療科，福州50005；.海南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)裝備處，?？?70）

·精準(zhǔn)醫(yī)療·

XRCC1基因多態(tài)性對晚期胃癌患者化療療效及生存期的影響Δ

鐘蘭1＊，符生苗2，謝賢和3，黃濤1，高允鎖4，林瑜1（1.海南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，海口570311；2.海南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，海口570311；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院化療科，福州350005；4.海南省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)裝備處，?？?70311）

目的：考察X射線損傷修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（XRCC1）Arg399Gln（G→A）多態(tài)性對晚期胃癌患者奧沙利鉑+氟尿嘧啶化療療效及生存期的影響。方法：選取2013年1月－2015年1月海南省人民醫(yī)院晚期胃癌患者52例，予奧沙利鉑+氟尿嘧啶聯(lián)合化療，每3周為1個周期，均治療3個周期以上。采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)法測定患者的基因型，比較不同基因型患者的疾病控制率和無進(jìn)展生存期。結(jié)果：52例晚期胃癌患者中，XRCC1 GG基因型28例（53.8%）、GA基因型21例（40.4%）、AA基因型3例（5.8%），各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。52例患者的疾病控制率為76.9%，其中GG基因型患者的疾病控制率（92.9%）顯著高于GA+AA基因型（58.3%），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；52例患者的平均無進(jìn)展生存期為（7.1±1.2）個月，其中GG基因型患者的無進(jìn)展生存期[（8.6±0.8）個月]顯著長于GG+GA基因型[（5.9±0.7）個月]，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論：XRCC1多態(tài)性與晚期胃癌患者奧沙利鉑+氟尿嘧啶化療療效及無進(jìn)展生存期有關(guān)，且XRCC1 GG基因型患者對化療藥物更敏感；該基因可能成為該類方案化療療效及生存期的預(yù)測標(biāo)志物。

XRCC1；基因多態(tài)性；晚期胃癌；奧沙利鉑；氟尿嘧啶；化療療效；無進(jìn)展生存期

胃癌是臨床高發(fā)的惡性腫瘤，且已成為全球病死率位列前三的腫瘤疾病[1]。有關(guān)腫瘤的檢測技術(shù)目前正趨于成熟，但仍有多數(shù)患者在確診為胃癌時病情已經(jīng)進(jìn)入中晚期，此時其治療成功率明顯降低，嚴(yán)重影響生存質(zhì)量[2]。晚期胃癌患者的治療主要以化療為主，臨床常用化療方案為奧沙利鉑+氟尿嘧啶，此化療方案已被多數(shù)研究證實(shí)具有良好的臨床效果，且安全性較好[3]。但近幾年也有研究指出，不同患者使用相同的化療方案得到的治療效果卻可能有所不同，使得臨床治療難度增大，若盲目統(tǒng)一用藥則有可能影響患者的預(yù)后。因此，有關(guān)影響奧沙利鉑+氟尿嘧啶化療療效的相關(guān)因素研究成為癌癥研究領(lǐng)域的新熱點(diǎn)[4]。隨著人類基因組計劃的發(fā)展，疾病相關(guān)基因越來越多地被發(fā)現(xiàn)，DNA修復(fù)基因作為惡性腫瘤相關(guān)的重要基因也日益受到關(guān)注[5]。鑒于此，本研究初步考察了DNA修復(fù)基因X射線損傷修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（XRCC1）Arg399Gln（G→A）多態(tài)性與晚期胃癌患者奧沙利鉑+氟尿嘧啶化療療效及生存期的相關(guān)性，以期為胃癌的治療提供新方向，為提高胃癌患者的生存質(zhì)量提供參考。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)和影像學(xué)檢驗(yàn)確診為胃癌，且病理分期處于Ⅲa、Ⅲb以及Ⅳ期的患者；（2）預(yù)計生存期≥5個月；（3）肝腎功能、心腦電圖均正常；（4）均接受奧沙利鉑+氟尿嘧啶聯(lián)合化療；（5）均知情且同意參與。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）預(yù)計生存期不足5個月者；（2）非化療患者；（3）合并嚴(yán)重心腦血管疾病者；（4）有認(rèn)知功能障礙、無法正常溝通者；（5）拒絕參與研究者。

1.2 研究對象

本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核通過，選取2013年1月－2015年1月于海南省人民醫(yī)院接受奧沙利鉑+氟尿嘧啶聯(lián)合化療的晚期胃癌患者52例，其中男性30例，女性22例；年齡47～58歲，平均年齡（52.3±4.8）歲；病程9～17個月，平均病程（14.7±3.3）個月；腺癌36例，印戒細(xì)胞癌10例，其他類型6例；肝臟轉(zhuǎn)移11例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移27例，合并肝臟和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移9例，其他部位轉(zhuǎn)移5例。

1.3 治療方法

所有患者均行奧沙利鉑+氟尿嘧啶聯(lián)合化療：注射用奧沙利鉑（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20000337，規(guī)格：50 mg）75 mg/m2，靜脈滴注2 h，d1+氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H31020593，規(guī)格：10 mL∶0.25 g）400 mg/m2，靜脈滴注，以靜脈泵持續(xù)滴注22 h，d1。每3周為1個周期，均治療3個周期以上。

1.4 DNA提取與制備

所有患者均于首次化療前統(tǒng)一抽取靜脈血3 mL，置于抗凝管中，于－20℃下冷凍保存。將血漿樣品進(jìn)行紅細(xì)胞降解分離、蛋白質(zhì)沉淀、RNA分離等處理后，于抗凝管中加入WB洗滌液（Western blot wash buffer，上海遠(yuǎn)慕科技有限公司）700 μL，以離心半徑2.5 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心30 s后，棄去廢液；加入WB洗滌液400 μL，以離心半徑2.5 cm、轉(zhuǎn)速11 000 r/min離心30 s后，棄去廢液；于管中放入吸附柱（上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司），以離心半徑2.5 cm、轉(zhuǎn)速12 000 r/min離心2 min后，取出吸附柱，將其放入吮吸膜內(nèi)，于室溫下靜置5 min，收集沉淀中的DNA，并于－20下保存。

1.5 XRCC1基因分型檢測與分析

采用聚合酶鏈反應(yīng)-連接酶檢測反應(yīng)（PCR-LDR）法測定各患者的基因型。根據(jù)UCSC數(shù)據(jù)庫（http：//genome.ucsc.edu）中相關(guān)的基因序列，使用Primer Premier 5軟件對PCR擴(kuò)增引物進(jìn)行設(shè)計，并利用PubMed在線數(shù)據(jù)庫（http：//www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）核對引物的正確性和特異度，引物序列和目的條帶長度根據(jù)所選擇的多態(tài)性位點(diǎn)和基因的目標(biāo)序列進(jìn)行確定。PCR引物序列如下：XRCC1上游引物：5′-TCTCCCTTGGTCTCCAACCT-3′；下游引物：5′-AGTAGTCTGCTGGCTCTGG-3′。PCR反應(yīng)體系包括上、下游引物（5 μmol/L）各0.4 μL，2×實(shí)時PCR混合物（2×Real-time PCR mix）10 μL，miRNA RT產(chǎn)物2 μL，DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL和水7.4 μL。PCR反應(yīng)條件：95預(yù)變性30 s，52℃變性30 s，72℃延伸反應(yīng)10 s，30退火30 s，60℃再延伸2 min，共8個循環(huán)。產(chǎn)物于4℃放置。

使用Prism 3730XL型基因分析儀（美國ABI公司）、BigDye?Terminator V3.1測序試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]、采用直接測序法檢測產(chǎn)物序列，使用DNA Star 5.0軟件[生工生物工程（上海）股份有限公司]分析測序結(jié)果，并與NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi. nlm.nih.gov）中的基因序列進(jìn)行對比，以確定單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)的具體序列位置。

1.6 評價指標(biāo)及標(biāo)準(zhǔn)

比較不同基因型患者的化療療效和無進(jìn)展生存期。療效評價標(biāo)準(zhǔn)[6]——完全緩解（CR）：病灶全部消失；部分緩解（PR）：病灶明顯好轉(zhuǎn)，基線病灶長徑縮小30%以上；病情穩(wěn)定（SD）：病情好轉(zhuǎn)但未達(dá)PR；病變進(jìn)展（PD）：病灶未消失或出現(xiàn)。疾病控制率（%）＝（CR例數(shù)+PR例數(shù)+SD例數(shù)）/總例數(shù)×100%。無進(jìn)展生存期是指患者從入院治療開始到腫瘤進(jìn)展或死亡的時間[7]。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以率或例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法。采用χ2檢驗(yàn)考察患者各基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基因型分布

52例晚期胃癌患者中，XRCC1 GG基因型28例（53.8%）、GA基因型21例（40.4%）、AA基因型3例（5.8%），各基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡（χ2＝2.334，P＞0.05），表示研究對象具有群體代表性。

2.2 不同基因型患者臨床資料比較

GG基因型患者中男性20例，女性8例，平均年齡（52.1±3.9）歲，平均病程（15.1±3.8）個月，其中腺癌18例、印戒細(xì)胞癌5例、其他類型5例；GA+AA基因型男性10例，女性14例，平均年齡（52.5±5.1）歲，平均病程（15.7±2.2）個月，其中腺癌18例、印戒細(xì)胞癌5例、其他類型1例。各基因型患者臨床資料比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

2.3 不同基因型患者化療療效比較

52例晚期胃癌患者中，疾病控制（CR+PR+SD）的共40例，PD 12例，疾病控制率為76.9%。其中，GG基因型患者的疾病控制率為92.9%（26/28），而GA+AA基因型患者的疾病控制率僅為58.3%（14/24），組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 不同基因型患者化療療效和無進(jìn)展生存期比較Tab 1 Comparison of therapeutic efficacy and progression free survival between different genotypes

2.4 不同基因型患者平均無進(jìn)展生存期比較

52例晚期胃癌患者的平均無進(jìn)展生存期為（7.1± 1.2）個月。由表1可見，GG基因型患者的平均無進(jìn)展生存期為（8.6±0.8）個月，而GA+AA基因型患者的平均無進(jìn)展生存期為（5.9±0.7）個月，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

隨著生活水平的提高和生活方式的改變，胃癌成為影響人類生命健康的重要惡性腫瘤，近幾年的發(fā)病率呈不斷上升趨勢，因此奧沙利鉑+氟尿嘧啶在胃癌患者尤其是中晚期胃癌患者中的應(yīng)用變得越來越廣泛[8]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，對于治療環(huán)境相同且用藥相同的不同患者而言，奧沙利鉑的臨床療效有很大的差異性，導(dǎo)致療效及預(yù)后評估變得更加困難。因此，有關(guān)不同癌癥患者對于化療藥物的不同耐藥性機(jī)制成為近幾年癌癥領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

目前臨床普遍認(rèn)為，鉑類藥物治療惡性腫瘤的機(jī)制為鉑原子與腫瘤細(xì)胞DNA中的鳥嘌呤發(fā)生結(jié)合，改變了后者DNA原有的雙鏈結(jié)構(gòu)，最終導(dǎo)致其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程不能正常進(jìn)行，從而起到殺滅腫瘤細(xì)胞的作用[9]；而鉑類藥物的耐藥性則主要受以下幾個方面的影響：藥物蓄積降低、藥物滅活增加、腫瘤細(xì)胞抵抗程度增加以及腫瘤細(xì)胞DNA修復(fù)能力增強(qiáng)[10]。在臨床治療過程中，當(dāng)治療環(huán)境以及用藥劑量相同時，患者仍會出現(xiàn)不同的反應(yīng)與療效，提示極有可能受到患者不同基因的調(diào)控或影響。

XRCC是一組能夠參與修復(fù)受損DNA的基因，而XRCC1是該組基因中首次被發(fā)現(xiàn)能夠參與修復(fù)因離子輻射和氧化而受損的DNA的修復(fù)基因，對維持基因穩(wěn)定性十分重要[11]。目前臨床認(rèn)為，DNA的修復(fù)主要包括5種方式：核苷酸切除修復(fù)、堿基切除修復(fù)、錯配修復(fù)、同源重組修復(fù)和非同源末端連接修復(fù)，XRCC1基因則主要作用于堿基切除修復(fù)過程[11]。該基因內(nèi)含3個功能域，主要參與堿基切除修復(fù)過程中蛋白質(zhì)的連接，3個不同的功能域分別作用于3種不同的DNA酶，在DNA氨基末端、羧基末端以及DNA受損處進(jìn)行蛋白質(zhì)連接，最終形成復(fù)合體；若XRCC1基因發(fā)生突變，則有可能影響DNA的修復(fù)過程，從而影響患者對于治療藥物的敏感性[12]。XRCC1基因常見的單堿基突變?yōu)榈?0外顯子第399密碼子G→A轉(zhuǎn)換，導(dǎo)致其編碼的精氨酸替換為谷氨酰胺，最終使XRCC1編碼的蛋白質(zhì)功能發(fā)生變化。有報道稱，XRCC1 Arg399Gln野生型（GG基因型）晚期胃癌患者在接受含鉑化療方案后，存在一定的生存優(yōu)勢[13]。

本研究納入的52例晚期胃癌患者中，XRCC1 GG基因型28例（53.8%）、GA基因型21例（40.4%）、AA基因型3例（5.8%），各基因型分布與文獻(xiàn)[13]基本一致。XRCC1 GG基因型的疾病控制率為92.9%（26/28），而GA+AA基因型患者僅為58.3%（14/24）；28例GG基因型患者的平均無進(jìn)展生存期為（8.6±0.8）個月，而GA+ AA基因型患者僅為（5.9±0.7）個月，提示XRCC1野生型患者對鉑類藥物的敏感性更高，給予相同劑量的藥物能夠獲得更好的治療效果。其原因可能為該位點(diǎn)發(fā)生突變后，導(dǎo)致其編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，破壞了XRCC1基因的功能，改變了DNA的修復(fù)能力，從而降低了藥物敏感性。

胃癌的發(fā)生、發(fā)展是環(huán)境和遺傳因素共同作用的結(jié)果，不同地區(qū)人群所暴露的致癌原不同將涉及到不同的DNA修復(fù)途徑。同時，有關(guān)XRCC1基因第399密碼子G→A轉(zhuǎn)換在不同人群中的研究結(jié)果也不盡相同，可能與不同地區(qū)人群的遺傳背景、飲食習(xí)慣、生活方式的差異有關(guān)[14]。盡管目前腫瘤治療取得了一定的進(jìn)展，但在不同種族人群中、不同個體間仍有顯著的疾病控制率或毒性反應(yīng)的異質(zhì)性。而針對海南地區(qū)XRCC1多態(tài)性與奧沙利鉑+氟尿嘧啶聯(lián)合化療的療效及晚期胃癌患者生存的相關(guān)性研究尚未見報道，本研究具有一定的新穎性。

綜上所述，DNA修復(fù)基因XRCC1與晚期胃癌患者奧沙利鉑+氟尿嘧啶化療療效及無進(jìn)展生存期有關(guān)，XRCC1 GG基因型患者對化療藥物更敏感，臨床療效更顯著；該基因可能成為該類方案化療療效及生存期的預(yù)測標(biāo)志物。但本研究尚處于初級階段，且由于樣本量有限，難免會存在分析不當(dāng)或數(shù)據(jù)偶然性等問題，尚有待后續(xù)研究進(jìn)一步確證。

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Effects of XRCC1 Polymorphism on Efficacy of Chemotherapy and Survival Time of Advanced Gastric Cancer Patients

ZHONG Lan1，F(xiàn)U Shengmiao2，XIE Xianhe3，HUANG Tao1，GAO Yunsuo4，LIN Yu1（1.Dept.of Laboratory，Hainan Provincial People’s Hospital，Haikou 570311，China；2.Medical Examination Center，Hainan Provincial People’s Hospital，Haikou 570311，China；3.Dept.of Chemotherapy，the First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，F(xiàn)uzhou 350005，China；4.Dept.of Medical Equipment，Hainan Provincial People’s Hospital，Haikou 570311，China）

OBJECTIVE：To investigate the effect of X-ray repair cross complementing gene（XRCC1）Arg399Gln（G→A）polymorphism on efficacy of oxaliplatin+fluorouracil chemotherapy and survival time of advanced gastric cancer patients.METHODS：Totally 52 cases of advanced gastric cancer were selected from Hainan Provincial People’s Hospital during Jan.2013-Jan. 2015.They were given oxaliplatin+fluorouracil chemotherapy，for 3 courses（a treatment course lasted for 3 weeks）.The genotypes of patients were detected by PCR-LDR.Disease control rate and progression free survival were compared among different genotypes.RESULTS：Among 52 cases of advanced gastric cancer，there were 28 cases of XRCC1 GG genotype（53.8%），21 cases of GA genotype（40.4%），3 cases of AA genotype（5.8%），frequencies of which were all in line with Hardy-Weinberg balance（P＞0.05）.Disease control rates of 52 cases were 76.9%，among which disease control rate（92.9%）of GG genotype was significantly higher than that of GA+AA genotype（58.3%），with statistical significance（P＜0.05）.The average progression free survival of 52 cases was（7.1+1.2）months，among which progression free survival of GG genotype[（8.6±0.8）months]was significantly longer than that of GG+GA genotype[（5.9±0.7）months]，with statistical significance（P＜0.05）.CONCLUSIONS：XRCC1 polymorphism is correlated with efficacy of oxaliplatin+fluorouracil chemotherapy and progression free survival，and XRCC1 GG genotype is more sensitive to chemotherapy drugs.XRCC1 gene can be regarded as predictive indicator for therapeutic efficacy of chemotherapy and survival.

XRCC1；Gene polymorphism；Advanced gastric cancer；Oxaliplatin；Fluorouracil；Efficacy of chemotherapy；Progression free survival

R735

A文章編號1001-0408（2017）14-1873-04

2016-10-26

2017-03-08）

（編輯：張元媛）

海南省醫(yī)學(xué)普通科研課題（No.瓊衛(wèi)2012PT-17）

＊副主任技師。研究方向：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)。電話：0898-68642540。E-mail：zhonglanhaikou@126.com

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2017.14.01