BMP-2在正常與壞死股骨頭骨組織中的表達差異

趙鵬飛李云萍李曉明宋祥義蘇明紅左世鋒楊玉寶*

（1 沂南縣人民醫(yī)院，山東 臨沂 276300；2 山東醫(yī)專附屬醫(yī)院，山東 臨沂 276000）

BMP-2在正常與壞死股骨頭骨組織中的表達差異

趙鵬飛1李云萍1李曉明1宋祥義1蘇明紅1左世鋒1楊玉寶2*

（1 沂南縣人民醫(yī)院，山東 臨沂 276300；2 山東醫(yī)專附屬醫(yī)院，山東 臨沂 276000）

目的 通過熒光原位雜交及RT-PCR實驗方法觀察骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）在正常與缺血壞死性股骨頭骨組織中的表達差異，探討B(tài)MP-2在兩種骨組織中的變化規(guī)律。方法 取股骨粗隆間骨折及缺血壞死性股骨頭需行人工股骨頭置換或全髖人工關(guān)節(jié)置換的正常股骨頭、缺血壞死性股骨頭骨組織患者各8例；分別取組織2～5 g放入冷凍管存入液氮用于熒光原位雜交及BMP-2基因的RT-PCR。結(jié)果 BMP-2的熒光原位雜交圖像顯示正常骨組織中的表達量比壞死組織增多，RT-PCR的2-ΔΔCt平均值分別為0.55±0.35，0.45±0.20；正常股骨頭骨組織中BMP-2基因RT-PCR的2-ΔΔCt平均值與缺血壞死性股骨頭骨組織平均值相比P＜0.05。結(jié)論 BMP-2基因在正常與缺血壞死性股骨頭骨組織有統(tǒng)計學(xué)意義，因此BMP-2基因表達量的減少也許是股骨頭缺血壞死的重要原因之一。

正常股骨頭；缺血壞死性股骨頭；熒光原位雜交；聚合酶鏈反應(yīng)

股骨頭壞死實際上是由多種因素所致股骨頭供血不足，或者是骨細胞變性引發(fā)的骨骼的活性成分死亡的病理學(xué)過程。目前國內(nèi)外都對其進行發(fā)病及進展過程做了大量實驗研究，但具體發(fā)病機制尚不完全清楚。隨著大量與骨折及骨壞死吸收及再生等相關(guān)細胞因子不斷被認識，臨床實驗研究發(fā)現(xiàn)有些細胞因子在治療早期股骨頭壞死方面有肯定的療效，骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）就是其中之一。

1 資料與方法

1.1 一般資料：在2014年6月至2016年1月于沂南縣人民醫(yī)院取股骨粗隆間骨折需行人工股骨頭置換或全髖人工關(guān)節(jié)置換的正常股骨頭骨組織8例；取酒精缺血壞死性股骨頭需行人工股骨頭置換或全髖人工關(guān)節(jié)置換骨組織8例，年齡在56～78歲，平均年齡（64.33±6.14）歲。

1.2 標本采取和保存方法：患者取健側(cè)臥位，取髖關(guān)節(jié)后外側(cè)常規(guī)切口，股骨頭取出后，在手術(shù)臺上用骨刀把股骨頭縱向剖開，不用電鋸剖開以免電鋸擺動時產(chǎn)生高能量引起蛋白變性而影響實驗數(shù)據(jù)，在實行股骨髓腔處理時用開口器取大粗隆處骨組織2～3 g，在2 min將正常股骨頭及缺血壞死性股骨頭、粗隆間骨組織各2～3 g，放入冷凍管存入液氮用于實驗。

1.3 受試病例排除標準：股骨粗隆間骨折及缺血壞死性股骨頭需人工股骨頭置換或全髖人工關(guān)節(jié)置換的患者，盡量選擇無高血壓、糖尿病，嚴重冠心病及免疫系統(tǒng)疾病。排除兒童患者和能夠非手術(shù)治療患者。對取標本患者向其家屬說明原因，有家屬或本人在手術(shù)或告知知情同意書上簽字。

1.4 FISH檢測：①切片預(yù)處理：石蠟包埋的組織芯片切片3 μm厚，置于干凈的涂膠片上，56 ℃下過夜烘烤，次日室溫條件下二甲苯中脫蠟10 min×2次，無水乙醇5 min，100%、85%、70%乙醇中各3 min，再將涂膠片浸入蒸餾水中5 min。高壓修復(fù)2 min，胃酶工作液37 ℃消化9～15 min。室溫條件下于2×SSC溶液中漂洗5 min，1%多聚甲醛PBS 10 min，2×SSC溶液中漂洗5 min，梯度乙醇75%、85%、100%中各3 min，自然晾干玻片。②變性雜交：暗處滴加10 μL探針，加蓋蓋玻片，樹脂膠封邊，上雜交儀（變性83 ℃，8 min，雜交42 ℃，16 h）。③洗滌對比染色：暗處取出切片揭去封膠，室溫浸于2×SSC液中使蓋玻片自然脫落，37 ℃，50%甲酰胺2×SSC15 min，2×SSC 15 min，梯度乙醇75%、85%、100%中各3 min，自然干燥玻片，滴加DAPI封片，放置15 min后于熒光顯微鏡下觀察。

1.5 RT-PCR：TaKaRa RNAiso Reagent試劑提取骨組織Total RNA，并進行逆轉(zhuǎn)錄及PCR反應(yīng)，操作按說明書進行，其中RT反應(yīng)條件為：96 ℃變性2 min，cDNA合成42 ℃ 30 min。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性2 min，變性20 s，50～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，72 ℃延伸5 min，步驟2～4為35個循環(huán)，BMP-2退火溫度為55 ℃，GAPDH退火溫度為57 ℃。BMP-2引物序列：5’-GGTATCACGCCTTTT ACTGCC-3’，GAPDH引物序列：5’-TGTTGCCATCAATGACCCCT T-3’。（RT-PCR相關(guān)試劑及試劑盒有北京博奧有限責(zé)任公司提供）。

2 結(jié) 果

2.1 BMP-2的熒光原位雜交表達圖像：見圖1、2，圖1示正常骨組織BMP-2表達陽性，圖2示壞死股骨頭BMP-2表達陰性。

圖1 正常骨組織（×200）

圖2 壞死骨組織（×200）

2.2 BMP-2基因的RT-PCR：見表1。

表1 BMP-2在正常及缺血壞死性股骨頭組織RT- PCR結(jié)果（2-ΔΔCt，）

表1 BMP-2在正常及缺血壞死性股骨頭組織RT- PCR結(jié)果（2-ΔΔCt，）

注：兩組比較與正常股骨頭骨組織相比P＜0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義，可以認為正常股骨頭組織中的BMP-2的相對表達量高于壞死骨組織

組別2-ΔΔCt和相對值正常股骨頭組織0.55±0.35壞死股骨頭組織0.45±0.20 P 0.019 t 0.36

3 討 論

股骨頭壞死又稱股骨頭缺血性壞死，目前國內(nèi)外臨床研究均證實，股骨頭壞死發(fā)生的主要原因是股骨頭內(nèi)部供血中斷，導(dǎo)致患者骨髓成分或骨細胞死亡。股骨頭壞死的主要臨床癥狀為患者髖部疼痛，下肢活動逐漸受限，且夜間癥狀相對明顯。如患者得不到及時、有效的治療，其病情將可能逐漸加重，甚至影響患者走路。在治療上，越早期給予治療干預(yù)，患者療效越好，因此，早期準確診斷及早期給予治療干預(yù)可有效改善患者預(yù)后，提高療效。

BMP-2是重要的成骨誘導(dǎo)因子，近年來隨著對BMP-2作用機制研究的深入，以及組織工程和基因治療技術(shù)的迅速發(fā)展，為治療骨壞死提供了新途徑，BMP有誘導(dǎo)成骨作用，其中BMP-2成骨誘導(dǎo)作用最強，是最有前途的骨誘導(dǎo)物質(zhì)[1]。BMP-2存在于骨基質(zhì)中，能夠誘導(dǎo)未分化的干細胞分化為成骨細胞，在骨形成與修復(fù)中起重要作用[2]。通過對吸附質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染丙交脂/膠原蛋白Ⅰ重組人骨形態(tài)形成蛋白-2（rhBMP-2）復(fù)合物在小鼠肌肉囊模型的生長情況觀察發(fā)現(xiàn)rhBMP-2mRNA和蛋白質(zhì)表達和刺激了異位骨形成[3]。有實驗研究重組人骨形態(tài)形成蛋白-2（rhBMP-2）負載殼聚糖（CS）/硫酸葡聚糖（DS）復(fù)合物的異味成骨作用的實驗中發(fā)現(xiàn)通過微CT檢查發(fā)現(xiàn)，rhBMP-2/CS/DS微粒比單一rhBMP-2具有較強異位骨形成的能力[4]。Li[5]等通過研究表明rhBMP-2懸浮在纖維蛋白中能表現(xiàn)出更強的促進兔子的骨形成作用。Sun wei[6]等在研究重組人類骨形成蛋白- 2在治療股骨頭骨壞死對移植骨骼的影響中的實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過平均6.1年的隨訪觀察，并通過X線和CT平掃評估療效，發(fā)現(xiàn)rhBMP-2可提高臨床療效和骨修復(fù)質(zhì)量。Ma[7]等也通過實驗證實VEGF-165/BMP-2基因轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞（bmsc）可在數(shù)量和質(zhì)量上加強成骨的影響，加速股骨頭骨壞死的修復(fù)合新骨的生成。

本實驗取正常股骨頭、缺血壞死性股骨頭骨組織進行BMP-2的熒光原位雜交和RT-PCR檢測，來了解正常股骨頭、缺血壞死性股骨頭骨組織存在的BMP-2差異。實驗證明BMP-2基因正常股骨頭和缺血壞死性股骨頭骨組織中RT-PCR的2-ΔΔCt平均值分別為0.55±0.35、0.45 ±0.20；正常股骨頭骨組織中BMP-2基因RT-PCR的2-ΔΔCt平均值與缺血壞死性股骨頭骨組織相比P＜0.05。了解BMP-2基因在兩種骨組織中的變化規(guī)律為股骨頭缺血性壞死的治療提供必要的理論依據(jù)。雖然BMP-2治療股骨頭壞死的動物模型和臨床前期實驗都取得了顯著成效，但仍然有許多問題有待更深入地去探索和研究。

當(dāng)然，本實驗僅通過熒光原位雜交及RT—PCR檢測了解了BMP-2在正常和壞死股骨頭骨組織的表達和分布，要想確切了解BMP-2治療股骨頭缺血壞死具體機制，還需從分子生物學(xué)基礎(chǔ)之上對其機制得到更全面的了解。

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The BMP - 2 Different Expression in the Normal and Necrosis of Femoral Head

ZHAO Peng-fei1, LI Yun-ping1, LI Xiao-ming1, SONG Xiang-yi1, SU Ming-hong1, ZUO Shi-feng1, YANG Yu-bao2
(1 Yinan County People's Hospital, Linyi 276300, China; 2 Shandong Medical College Affiliated Hospital, Shandong Province, Linyi 276000, China)

Objective By fluorescence in situ hybridization and rt-pcr method to observe the BMP - 2 (BMP-2) expression differences in the normal and ischemic and necrotic femoral head bone, BMP-2 variation in two kinds of bone tissue. Methods Intertrochanteric fractures and ischemic and necrotic femoral head requires artificial femoral head replacement or total hip joint replacement of normal femoral head, all the 8 patients with ischemic and necrotic femoral head bone tissue; respectively in group 2-5 g in liquid nitrogen freezing tube used in fluorescent in situ hybridization and BMP-2 gene RT-PCR. Results BMP-2 of fluorescence in situ hybridization images show that the amount of expression in normal tissue than the necrotic tissue increased, RT-PCR2-ΔΔCtaverage is (0.55±0.35) and (0.45±0.20); in normal femoral bone BMP-2 gene RT-PCR2-ΔΔCtaverage compared with average ischemic and necrotic femoral head bone tissue P＜0.05. Conclusion BMP-2 gene in normal and ischemic and necrotic femoral head bone tissue was statistically significant, therefore decreases may BMP-2 gene expression is one of the important reasons of the ischemic necrosis of the femoral head.

Normal femoral head; Ischemic and necrotic femoral head; Fluorescence in situ hybridization; Polymerase chain reaction

R687.3

B

1671-8194（2017）10-0031-02

*通訊作者