富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠缺血再灌注損傷指標(biāo)及炎性因子水平的影響

魏偉++邵洪波++張桂華++李晰++張慶富++馮建科

[摘要] 目的 探討富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠缺血再灌注損傷指標(biāo)、白細(xì)胞介素-8（IL-8）以及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平的影響。 方法 選取SPF級雄性大鼠60只，采用隨機數(shù)字表法分為四組，即使用生理鹽水進(jìn)行腹腔注射的高壓電燒傷實驗組、腹腔注射富氫鹽水治療高壓電燒傷的治療組、單純腹腔注射生理鹽且無高壓電燒傷的空白對照組，以及腹腔注射罌粟堿治療高壓電燒傷的陽性對照組，每組15只。治療后，檢測血漿中6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）水平，并檢測電燒傷組織黃嘌呤氧化酶（XOD）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、TNF-α及IL-8水平。 結(jié)果 治療組大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。治療組大鼠組織SOD水平顯著低于空白對照組（P < 0.01），顯著高于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）；治療組大鼠組織XOD及MDA水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。治療組大鼠組織TNF-α及IL-8水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。 結(jié)論 富氫鹽水治療高壓電燒傷大鼠可有效保護(hù)受損區(qū)，最大限度地降低缺血再灌注損傷，且有效抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激，控制炎性因子表達(dá)可能是富氫鹽水發(fā)揮生物學(xué)功能的主要機制。

[關(guān)鍵詞] 富氫鹽水；高壓電燒傷大鼠；缺血再灌注損傷；白細(xì)胞介素-8；腫瘤壞死因子-α

[中圖分類號] R-332 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）04（a）-0022-05

[Abstract] Objective To investigate influence of hydrogen rich saline on ischemia reperfusion injury indexes， IL-8， TNF-α levels in high voltage burn rats. Methods 60 male SPF rats were selected and divided into four groups by random number table method. There were intraperitoneal injection of saline as high-voltage burn experimental group， intraperitoneal injection of hydrogen rich saline as high voltage burn treatment group， injection of physiological saline without high voltage burn as blank control group， intraperitoneal injection of papaverine with high-voltage burn as positive control group. Each group had 15 rats. After treatment， plasma 6-Keto-PGF1α， TXB2 levels were detected. XOD， MDA， SOD， TNF-α and IL-8 levels of high voltage burn tissues were detected. Results Plasma 6-Keto-PGF1α， TXB2 levels in treatment group were significantly higher than those in blank control group （P < 0.01）， which were significantly lower than those in experimental group and positive control group （P < 0.01）. SOD level in treatment group was significantly lower than that in blank control group （P < 0.01）， which were significantly higher than that in experimental group and positive control group （P < 0.01）. XOD， MDA levels in treatment group were significantly higher than those in blank control group （P < 0.01）， which were significantly lower than those in experimental group and positive control group （P < 0.01）. TNF-α， IL-8 levels in treatment group were significantly higher than those in blank control group （P < 0.01）， which were significantly lower than those in experimental group and positive control group （P < 0.01）. Conclusion Hydrogen rich saline in the treatment of high voltage burn rats can effectively protect the damaged area and maximum degree of reduction ischemia reperfusion injury， which can also effective inhibition of cellular oxidative stress and control of inflammatory factor expression. Which may be the main mechanism of hydrogen rich saline.

[Key words] Rich hydrogen saline； High voltage burn rats； Ischemia reperfusion injury； IL-8； TNF-α

一般情況下，將流通過人體誘發(fā)的電接觸燒傷、電弧燒傷以及閃電燒傷等統(tǒng)稱為電燒傷，其中臨床中最為常見的為電接觸燒傷。電燒傷與傳統(tǒng)意義上的燒傷存在明顯的臨床特征，常可在患者創(chuàng)口發(fā)現(xiàn)明顯的誘發(fā)燒傷的電流出入口[1-2]。一般情況下，在患者電燒傷創(chuàng)面可見較為明顯的平滑肌纖維變性壞死和小動脈中層彈力纖維斷裂等病理性變化，造成炎性細(xì)胞在受損血管處大量聚集，改變微環(huán)境，甚至造成患者形成血栓[3-4]。有研究證實，在電燒傷患者患處其如細(xì)胞黏附分子、一氧化氮（NO）、內(nèi)皮素（ET）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子等情況出現(xiàn)明顯異常，導(dǎo)致血管進(jìn)一步損傷，并可能誘發(fā)患處微循環(huán)障礙，造成組織缺氧缺血[5-7]。富氫鹽水是在經(jīng)脫氣、低溫、注入及加壓處理后所制備的一類具有廣泛生物活性的物質(zhì)，Cai等[8]研究發(fā)現(xiàn)，富氫鹽水可以預(yù)防并治療由腦缺血誘發(fā)的臟器和組織功能障礙。但在使用富氫鹽水對高壓電燒傷進(jìn)行治療的作用機制仍有諸多空白。本文旨在探討富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠治療后其缺血再灌注損傷指標(biāo)、IL-8以及TNF-α的水平，為進(jìn)一步的深入研究提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

使用的60只SPF級體重為（220±34）g的雄性大鼠，均購買自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，合格證號為DK103144，該研究經(jīng)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)，全部大鼠均在室溫24～26℃環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)。將全部大鼠依照隨機數(shù)字表法分為四組，即高壓電燒傷實驗組（腹腔注射生理鹽水，實驗組）、高壓電燒傷富氫鹽水治療組（腹腔注射富氫鹽水，治療組）、假高壓電燒傷組（單純腹腔注射生理鹽水且不通電，空白對照組）和高壓電燒傷罌粟堿治療組（腹腔注射罌粟堿溶液，陽性對照組），每組15只。研究中使用的6-酮-前列腺素F1α（6-Keto-PGF1α）及血栓素B2（TXB2）均購買自南京生工生物有限公司，大鼠TNF-α及白細(xì)胞介素-8（IL-8）均購買自南京福麥斯生物技術(shù)有限公司。TC-30-20KVA型調(diào)壓器、TDJ-10KVA型變壓器均購買自得福電氣有限公司，PG270A型電流表購買自申華儀表有限公司。

1.2 造模方法

實驗組、治療組及陽性對照組全部45只大鼠均采用如下方法進(jìn)行高壓電燒傷造模：用生理鹽水稀釋戊巴比妥鈉粉劑和己酮可可堿粉劑，制作成1%注射液，備用，用75%乙醇擦拭大鼠腹部正中皮膚，用5 mL注射器吸取配置好的1%注射液，按照40 mg/kg給予大鼠腹腔注射，觀察大鼠的麻醉程度，待大鼠完全麻醉后，用手術(shù)剪刀去除大鼠左上肢、右下肢和胸腹部的被毛，用電動剃須刀將殘余被毛剃除，將準(zhǔn)備好的大鼠固定于絕緣臺面上，將2個1 cm ×1 cm電極銅片分別置于大鼠左上肢、右下肢的備皮區(qū)，將室內(nèi)溫度控制在20℃左右，適度控制在40%RH，穿戴好絕緣防護(hù)服后，確定高壓電路連接無誤，給予大鼠電擊，電流入口與電流出口分別作為造模時的電流入口及出口，選擇2 kV電壓作為造模時的電擊電壓，（1.80±0.20）A作為造模的電擊電流強度，通電時間3 s。造模過程中，大鼠電流出入口創(chuàng)傷面積為1 cm2。

造模成功條件如下：電擊即刻，可見大鼠全身肌肉明顯痙攣，關(guān)閉電路并接觸電極后，可見電極固定區(qū)域毛皮和肌肉發(fā)生碳化為黑色，有灼焦氣味，部分大鼠創(chuàng)口深度可達(dá)骨骼處，且部分大鼠甚至出現(xiàn)肢體脫落或斷裂等，對少數(shù)心跳驟停大鼠立即開展心臟外按壓復(fù)蘇，以確保高壓電燒傷大鼠造模成功。

1.3 方法

在0.4 MPa大氣壓下將氫氣通入250 mL的袋裝生理鹽水中，在通入氫氣4 h后達(dá)到過飽和狀態(tài)，7 d后，抽出袋中氣體后再次以相同條件下通入氫氣以制備富氫鹽水，并使用氣相色譜法檢測結(jié)果顯示，富氫鹽水濃度為0.6 mmol/L。

本研究中所有大鼠依照分組不同采用不用的干預(yù)方式。實驗組：該組大鼠在造模成功后腹腔注射4 mL生理鹽水，作為模型對照組即實驗組。治療組：該組大鼠在造模成功后依照Parkland公式進(jìn)行換算，依照4 mL/kg劑量使用富氫鹽水對大鼠進(jìn)行腹腔注射。陽性對照組：該組大鼠在造模成功后依照3.18 mg/kg的劑量使用4 mL生理鹽水溶解并進(jìn)行腹腔注射?？瞻讓φ战M：該組大鼠不進(jìn)行造模，且僅腹腔注射4 mL生理鹽水進(jìn)行干預(yù)。

1.4 檢測指標(biāo)

在治療1周后，去眼球取血，對血漿中的6-Keto-PGF1α、TXB2水平進(jìn)行測定，由于兩者性質(zhì)較不穩(wěn)定，因而采用放射免疫分析法對兩項指標(biāo)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行操作檢測，并由計算機系統(tǒng)自動處理結(jié)果。大鼠電燒傷組織的黃嘌呤氧化酶（XOD）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）三項指標(biāo)嚴(yán)格參照試劑盒說明書進(jìn)行檢測，測量吸光度并計算缺血再灌注組織的XOD、MDA及SOD活力。使用雙抗夾心法（ABC-ELISA）檢測組織中TNF-α及IL-8水平，其具體操作過程嚴(yán)格依照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件包對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，以M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平比較

四組大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；治療組大鼠血漿6-keto-PGF1α和TXB2水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。見表1。

2.2 各組大鼠組織SOD、XOD及MDA水平比較

四組大鼠組織SOD、XOD及MDA水平比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；治療組大鼠組織SOD水平顯著低于空白對照組（P < 0.01），顯著高于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）；治療組大鼠組織XOD及MDA水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。見表2。

2.3 各組大鼠組織TNF-α及IL-8水平比較

四組大鼠組織TNF-α及IL-8水平比較，差異有高度統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.01）；治療組大鼠組織TNF-α及IL-8水平顯著高于空白對照組（P < 0.01），顯著低于實驗組和陽性對照組（P < 0.01）。見表3。

3 討論

當(dāng)患者皮膚經(jīng)電流通過后，由于物理學(xué)特性電流沿電阻最小路線運行，對患者的神經(jīng)、血管、心臟、晶狀體和肌肉等產(chǎn)生直接損害，此外電流可以迅速地通過血管，故對血管造成極其明顯的損傷，特別是分散在身體各處的小動脈[9]。當(dāng)電流通過血管時，造成患者血管內(nèi)皮細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，甚至出現(xiàn)脫落和變性壞死。有研究發(fā)現(xiàn)，微循環(huán)障礙時高壓電燒傷早期的主要臨床癥狀，隨著時間的延長患者出血以及微栓等數(shù)目明顯增多[10-11]。現(xiàn)階段電流損害機體的具體機制仍有諸多待解之謎，而微循環(huán)障礙時臨床工作中公認(rèn)的病理性變化，因而針對微循環(huán)障礙進(jìn)行有效干預(yù)和治療在高壓電燒傷的臨床實踐中具有重要意義。本研究也證實高壓電燒傷大鼠血清中TXB2和6-keto-PGF1α及組織中MDA、SOD、XOD、IL-8、TNF-α水平較正常大鼠均存在顯著性差異，因而其電燒傷患處微環(huán)境出現(xiàn)明顯變化[12]。

有研究指出，在血小板活化的生理過程中氧自由基扮演著重要的作用，其可大量生產(chǎn)TXA2并造成前列腺素I2（PGI2）的大量生產(chǎn)與釋放，起到抑制血小板聚集和擴血管的生理學(xué)作用[13]。TXA2是一類主要由血小板合成并釋放的一類強血管收縮物，還可以造成血小板聚集。在正常情況下，TXA2與PGI2處于動態(tài)平衡中，因而臨床中常依據(jù)兩者的比例分析患者血小板受損及活化程度[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，使用富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠進(jìn)行干預(yù)治療后，大鼠的TXB2（TXA2代謝產(chǎn)物）和6-keto-PGF1α（PGI2代謝產(chǎn)物）指標(biāo)出現(xiàn)顯著性改善，且其改善程度明顯優(yōu)于罌粟堿，但仍無法完全達(dá)到正常水平，這可能與治療時間不足有關(guān)。分析認(rèn)為，富氫鹽水可以有效糾正血液中TXA2/PGI2的代謝失衡，并達(dá)到減輕細(xì)胞受損和降低炎性反應(yīng)的目的，最大限度地起到維持細(xì)胞完整超微結(jié)構(gòu)的目的。

SOD是機體內(nèi)一類典型的具有清除自由基活性的酶，其在維持機體微環(huán)境平衡過程中起到十分重要的作用，其能夠有效地將超氧陰離子清除以達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的目的[15]。XOD是經(jīng)典的脫氫酶類，其在自由基的產(chǎn)生過程中起十分重要的作用，而MDA則是可以有效直接反映脂質(zhì)過氧化和間接反映組織受損程度的生物標(biāo)志物[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在富氫鹽水干預(yù)治療后，高壓電燒傷大鼠組織中SOD明顯高于模型組和罌粟堿組，XOD和MDA水平明顯低于模型組和罌粟堿組，但較正常大鼠組織中SOD水平仍偏低，XOD和MDA水平仍偏高。研究結(jié)果也反映，富氫鹽水可以有效提高機體氧自由基的清除能力，顯著降低炎性反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化程度。有學(xué)者在對兔的肺部缺血再灌注模型進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，富氫鹽水可以有效降低MDA和MPO水平，并提高肺部組織的SOD水平，與本研究結(jié)果相似[19]。

IL-8是現(xiàn)階段公認(rèn)的一類中性粒細(xì)胞趨化因子，其在中性粒細(xì)胞的黏附、遷移和浸潤等生理變化過程中起到重要作用[20]。單核巨噬細(xì)胞合成并分泌的TNF-α是典型的前炎性因子，其以血管內(nèi)皮細(xì)胞作為其主要的靶點[21]。IL-8和TNF-α可以使血管內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)功能異常，導(dǎo)致血管通透性、張力等失控，導(dǎo)致血栓生成。通過研究發(fā)現(xiàn)，富氫鹽水治療后，高壓電燒傷大鼠組織中IL-8和TNF-α水平較模型組和罌粟堿組顯著性降低，但與正常大鼠仍存在一定差別，其可能與治療時間短有關(guān)，若延長治療時間有可能恢復(fù)至正常水平。其可以表明富氫鹽水治療后，損傷區(qū)的炎性反應(yīng)明顯改善，已達(dá)到改善微環(huán)境并最終實現(xiàn)的治療目的。此外，Zheng等[22]在對腸缺血再灌注損傷模型進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)，使用富氫鹽水干預(yù)后患處的IL-6、IL-1β、TNF-α、MDA以及MPO均顯著性降低，與本研究結(jié)果類似。

綜上所述，在使用富氫鹽水對高壓電燒傷大鼠進(jìn)行治療后，可有效起到保護(hù)受損區(qū)，最大限度地降低缺血再灌注損傷，且有效地抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激，控制炎性因子表達(dá)可能是富氫鹽水發(fā)揮生物學(xué)功能的主要機制，因而認(rèn)為，富氫鹽水可用于高壓電燒傷患者的臨床治療，可能發(fā)揮良好的治療效果。但此次研究也存在一定弊端，樣本量較少，仍需要進(jìn)一步擴大再研究。同時富氫鹽水是否具有良好的安全性，是否會引發(fā)明顯的不良反應(yīng)，而影響到治療效果，也是此次研究的繼續(xù)。此次研究采用了腹腔注射是否為最佳的用藥方案，也仍有待進(jìn)一步探討研究。

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（收稿日期：2016-12-19 本文編輯：李亞聰）