黑曲霉中β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵優(yōu)化及純化研究

高 倩,秦小明,鐘賽意,陳建平

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

黑曲霉中β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵優(yōu)化及純化研究

高 倩,秦小明*,鐘賽意,陳建平

(廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院,廣東湛江 524088)

為研究黑曲霉CICC 2475產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件及其分離純化過(guò)程。利用JMP 7.0中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái),對(duì)黑曲霉CICC 2475產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。通過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析,DEAE-52陰離子交換層析和Sephacryl S-300 High resolution對(duì)粗酶液進(jìn)行純化,采用SDS-PAGE凝膠電泳測(cè)定其分子量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,黑曲霉產(chǎn)酶的最佳發(fā)酵條件:接種量11.0%、初始pH5.6、發(fā)酵時(shí)間130.0 h、裝液量70.0 mL,在該條件下所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活力達(dá)118.73 U/mL;經(jīng)離子交換和凝膠色譜層析可有效純化β-葡萄糖苷酶,得其分子量約為1.3×105。

黑曲霉CICC2475,β-葡萄糖苷酶,神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),純化

β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21,β-glucosidase)是一種纖維素酶類水解酶,廣泛存在于各類生物體中,作用于芳基或羥基與糖基原子團(tuán)之間的糖苷鍵,生成β-D-葡萄糖及相應(yīng)配基[1]。β-葡萄糖苷酶是纖維素酶中的一種,可促進(jìn)纖維二糖的水解,提高纖維素酶系的水解活性,在纖維素降解過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[2],同時(shí)在食品[3-5]、醫(yī)藥[6-7]、煙草[8]、農(nóng)業(yè)[9]等領(lǐng)域具有重要的作用。

研究學(xué)者先后從各種植物和微生物中分離純化出β-葡萄糖苷酶,并研究其生物化學(xué)特性[10-12],但是國(guó)內(nèi)研究所純化出的β-葡萄糖苷酶酶活力較低、成本高,且來(lái)源不同、培養(yǎng)條件不同所產(chǎn)生的不同分子量的β-葡萄糖苷酶結(jié)構(gòu)和組成研究不足等問(wèn)題仍然是目前β-葡萄糖苷酶的研究瓶頸。因此需要在產(chǎn)酶的條件優(yōu)化及其分離純化技術(shù)的研究上取得突破。

黑曲霉發(fā)酵周期較短,安全可靠,無(wú)有毒物質(zhì),其所產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的安全性是國(guó)際公認(rèn)的[13],廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)。本文利用JMP 7.0中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),在接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間和裝液量等四個(gè)方面對(duì)黑曲霉CICC 2475發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶工藝條件進(jìn)行優(yōu)化,并先后通過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析、陰離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析,對(duì)該酶進(jìn)行分離純化,以獲得酶活力較高及純度較好的β-葡萄糖苷酶,為后續(xù)研究該酶的結(jié)構(gòu)組成及酶解機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑曲霉(Aspergillusniger)CICC 2475,購(gòu)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。將菌種接入PDA斜面培養(yǎng)基中,25 ℃活化5 d。

種子培養(yǎng)基:種子培養(yǎng)基(g/L):可溶性淀粉20,葡萄糖10,MgSO4·7H2O 1,KH2PO41,酵母膏5,自然pH(不加調(diào)整),121 ℃滅菌20 min;

液體發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)[14]:麩皮20,硫酸銨1.5,KH2PO42,MgSO4·7H2O 1,吐溫-80 2 mL,pH5.6,121 ℃滅菌20 min。

DEAE-52,SDS-PAGE凝膠配制試劑盒 購(gòu)于廣州鼎國(guó)生物科技有限公司;對(duì)硝基苯β-D-葡萄糖苷(pNPG),Sephacryl S-300 High resolution 購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司;考馬斯亮藍(lán) 購(gòu)于南京建成生物科技有限公司;檸檬酸,檸檬酸鈉,無(wú)水碳酸鈉、硫酸銨均為國(guó)產(chǎn)分析純。

SW-CJ-270凈化工作臺(tái) 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SPX-250B-Z恒溫培養(yǎng)箱 上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠;UV-3200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HZQ-A全溫培養(yǎng)搖床 蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司;高速落地離心機(jī) Thermo Lynx6000,Thermo Scientific;冷凍干燥機(jī) KA1013,韓國(guó);pHS-2C pH計(jì) 德國(guó)賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1β-葡萄糖苷酶活性測(cè)定 1.8 mL、0.1 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)中加入0.1 mL、10 mmol/L對(duì)硝基苯β-D-葡萄糖苷(pNPG)作為反應(yīng)底物,加入0.1 mL酶液,45 ℃反應(yīng)30 min后加入2 mL、1 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)并顯色,在410 nm處測(cè)定吸光值。45 ℃時(shí),每分鐘每毫升酶液酶解1 μmol pNPG的酶活力為一個(gè)酶活單位(U/mL)。

1.2.2 蛋白含量的測(cè)定 蛋白含量的測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)法。

1.2.3 酶蛋白純度的測(cè)定 酶蛋白純度的測(cè)定采用SDS-PAGE法。

1.2.4 粗酶液的制備 在PDA斜面培養(yǎng)基中取一環(huán)菌種,接種于裝有200 mL種子培養(yǎng)液的500 mL搖瓶中,28 ℃下培養(yǎng)48 h,按一定接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中,28 ℃,170 r/min下培養(yǎng),4500 r/min條件下離心10 min,取上清液。檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH5.0)稀釋5倍,用于酶活性的測(cè)定。

1.2.5 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型建立 本研究以接種量(X1)、初始pH(X2)、發(fā)酵時(shí)間(X3)、裝液量(X4)4個(gè)實(shí)驗(yàn)因素為主,以酶活(U/mL)為響應(yīng)因素。采用Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平編碼表(表1)。采用JMP 7.0數(shù)據(jù)處理軟件中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)平臺(tái),建立神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型及對(duì)產(chǎn)酶工藝條件的優(yōu)化分析。

在經(jīng)過(guò)多次對(duì)交叉驗(yàn)證組數(shù)K及隱藏節(jié)點(diǎn)的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練之后,確定交叉驗(yàn)證組數(shù)K值為5,采用4×5×1結(jié)構(gòu)的三層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(圖1)。設(shè)置隱藏節(jié)點(diǎn)數(shù)5,過(guò)擬合罰項(xiàng)0.001,歷程數(shù)16,最大迭代數(shù)50,收斂準(zhǔn)則0.00001,交叉驗(yàn)證組數(shù)K為5,執(zhí)行神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的擬合迭代過(guò)程,擬合決定系數(shù)R2值為0.99以上。

表1 因素水平編碼表

圖1 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of artificial neural network

1.2.6 酶的分離純化 利用優(yōu)化后的產(chǎn)酶參數(shù)進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn),離心得到粗酶液。將一定體積的粗酶液分成15份,每份50 mL,分別加入硫酸銨使硫酸銨飽和度分別為20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%,4 ℃條件下靜置過(guò)夜后10000 r/min離心10 min。分離沉淀和上清,沉淀溶于50 mL檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中,分別測(cè)定上清和沉淀的相對(duì)酶活,確定硫酸銨的分級(jí)飽和度。經(jīng)初步純化后的樣品依次經(jīng)過(guò)DEAE-52陰離子交換柱及Sephacryl S-300 High resolution層析,收集活性部分用SDS-PAGE電泳檢測(cè)純度。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)酶工藝條件優(yōu)化

2.1.1 Box-Behnken設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn) 結(jié)果如表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)及結(jié)果

圖2 接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間和裝液量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effect of inoculation amount、fermentation pH、fermentation time and broth content on production of enzymes

2.1.2 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型分析 固定接種量(X1)、初始pH(X2)、發(fā)酵時(shí)間(X3)和裝液量(X4)四個(gè)因素中的兩個(gè)因素為中間水平,作三維曲面圖,將得到四個(gè)因素對(duì)黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酶活力的影響規(guī)律進(jìn)行預(yù)測(cè)分析,結(jié)果見(jiàn)圖2。

從圖2a、圖2b、圖2c中可以看出,在pH約低于5.5時(shí),酶活逐漸增加;而高于5.5后,酶活逐漸降低,可見(jiàn)環(huán)境的酸堿程度會(huì)明顯影響酶的活力。菌體的生長(zhǎng)及產(chǎn)物的合成都有一個(gè)最適的酸堿環(huán)境,偏酸或偏堿的環(huán)境會(huì)改變膜的通透性,進(jìn)而影響黑曲霉的正常生長(zhǎng),進(jìn)而導(dǎo)致產(chǎn)酶量及酶活力降低[15]。

圖2a、圖2d和圖2e中顯示,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),酶活明顯增加,在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到約130 h后逐漸平穩(wěn)。這是因?yàn)樵谝欢ǖ陌l(fā)酵時(shí)間內(nèi),產(chǎn)酶量逐漸增加,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),培養(yǎng)基內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)逐漸減少,這導(dǎo)致菌體停止產(chǎn)酶并開(kāi)始衰亡。

圖3 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測(cè)刻畫器Fig.3 Prediction plot of the neural network

從圖2b、圖2d和圖2f中顯示出酶活隨著接種量的增加,呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)。接種量過(guò)低,產(chǎn)酶活力則低;接種量過(guò)大,可能會(huì)使菌體的濃度增大,培養(yǎng)液對(duì)菌體的供養(yǎng)不足,則產(chǎn)酶降低[16]。圖中顯示在約小于11%時(shí),酶活逐漸增加;當(dāng)約大于11%后,酶活逐漸下降,這說(shuō)明接種量存在一個(gè)最適值。

從圖2c、圖2e和圖2f中可以看出,裝液量對(duì)黑曲霉產(chǎn)酶的影響顯著,在裝液量大于約70 mL時(shí),酶活有顯著下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)楹谇篂楹醚跷⑸?裝液量過(guò)大,則溶氧量減少,致使菌體的生長(zhǎng)緩慢,產(chǎn)酶隨之降低[17]。

根據(jù)接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間和裝液量四個(gè)因素對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的影響規(guī)律,采用JMP 7.0軟件中的預(yù)測(cè)刻畫器,優(yōu)化黑曲霉產(chǎn)酶的條件,預(yù)測(cè)刻畫見(jiàn)圖3。

從圖3中得出,在接種量為11.09%,初始pH為5.65,發(fā)酵時(shí)間為130.91 h,裝液量為70.38 mL時(shí),黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的預(yù)測(cè)酶活值達(dá)到最大。考慮到實(shí)驗(yàn)條件的可控性,確定在接種量11.0%,初始pH5.6,發(fā)酵時(shí)間130 h,裝液量70 mL條件下進(jìn)行產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn),該條件下預(yù)測(cè)酶活值120.24 U/mL,實(shí)驗(yàn)得到的平均酶活118.73 U/mL,相對(duì)誤差0.63%,說(shuō)明可利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型對(duì)黑曲霉產(chǎn)β-葡萄糖苷酶進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2.2 硫酸銨分級(jí)鹽析

不同百分飽和度的硫酸銨鹽析曲線如圖4。

圖4 硫酸銨分級(jí)鹽析曲線Fig.4 Precipitation fractional curve by saturated ammonium sulfate注：相同小寫字母和大寫字母分別表示上清液相對(duì)酶活 和沉淀相對(duì)酶活在不同硫酸銨飽和度之間的 差異不顯著(p>0.05),否則差異顯著(p<0.05)。

由圖4可知,當(dāng)硫酸銨飽和度在0～35%時(shí),上清和沉淀的相對(duì)酶活差異性不顯著,說(shuō)明在此區(qū)間內(nèi),硫酸銨對(duì)酶的作用很小;當(dāng)硫酸銨飽和度在35%～60%時(shí),上清和沉淀的相對(duì)酶活開(kāi)始出現(xiàn)顯著差異,但曲線相對(duì)平穩(wěn),原因是此階段鹽離子與溶液中的自由態(tài)水分子結(jié)合,對(duì)酶表面的水分子影響較小[18],當(dāng)硫酸銨飽和度在60%～80%時(shí),鹽析作用增強(qiáng),原因可能是在該濃度下,鹽離子大量爭(zhēng)奪酶表面的水分子,破壞了酶表面水化膜,暴露出疏水區(qū)域,降低溶解度[19];當(dāng)硫酸銨飽和度大于80%時(shí),雖然上清液相對(duì)酶活存在差異,但沉淀相對(duì)酶活差異性不顯著。從以上分析來(lái)看,先選用飽和度為35%的硫酸銨除去雜蛋白,再采用80%飽和度的硫酸銨沉淀酶蛋白。

2.3 離子交換層析

鹽析后的蛋白沉淀溶于檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液中,4 ℃下透析脫鹽,樣品經(jīng)0.22 μm的水系微孔濾膜過(guò)濾除去雜質(zhì),上樣至DEAE-52陰離子交換層析柱中。依次用pH為5.0的20 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液、含0.1 mol/L NaCl的緩沖液、0.3 mol/L NaCl的緩沖液梯度洗脫,流速為1.0 mL/min,每8 mL收集1管。洗脫得到3個(gè)蛋白峰如圖5。

圖5 β-葡萄糖苷酶DEAE-52陰離子交換層析Fig.5 The ion-exchange chromatography for β-glucosidase on DEAE-52

從圖中可以看出,β-葡萄糖苷酶經(jīng)過(guò)離子交換層析后在280 nm下檢測(cè)出現(xiàn)3個(gè)峰。收集各峰組分在410 nm下檢測(cè)則出現(xiàn)2個(gè)明顯的峰,且峰值較高,其中第1個(gè)蛋白峰在410 nm時(shí)沒(méi)有吸收峰,可以斷定該峰為雜蛋白峰,峰2比酶活相對(duì)較低,且收集量較少。因此收集第3峰的酶液進(jìn)行后續(xù)分離純化。

2.4 凝膠柱層析

表3 β-葡萄糖苷酶純化及結(jié)果

將離子交換層析后收集到的樣品經(jīng)蒸餾水透析,冷凍干燥濃縮及0.22 μm的水系微孔濾膜過(guò)濾,上樣于Sephacryl S-300 High resolution中層析,用pH為5.0的20 mmol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液洗脫,流速為0.5 mL/min,每4 mL收集1管。洗脫結(jié)果如圖6。

圖6 β-葡萄糖苷酶Sephacryl S-300 High resolution層析Fig.6 The chromatography for β-glucosidase by Sephacryl S-300 High resolution

凝膠柱層析的結(jié)果如圖所示,經(jīng)過(guò)Sephacryl S-300 High resolution層析后,樣品得到兩個(gè)蛋白峰。經(jīng)過(guò)酶活力測(cè)定后發(fā)現(xiàn)峰1相比峰2酶活性較高且蛋白量較多,從經(jīng)濟(jì)方面考慮收集第1個(gè)峰的蛋白組分進(jìn)行后續(xù)應(yīng)用研究。

2.5 純度檢測(cè)及得率

將收集得到的各純化步驟的葡萄糖苷酶進(jìn)行SDS-PAGE電泳,結(jié)果如圖7。

圖7 SDS-PAGE電泳結(jié)果Fig.7 SDS-PAGE result of β-glucosidase注：1.蛋白Marker;2.粗酶液;3.鹽析透析液; 4.離子后收集液;5.凝膠后收集液。

經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳后可看出,每步的分離純化均達(dá)到了一定的純化效果且純化后酶液呈單一條帶,說(shuō)明純化的程度較高。與蛋白Marker相比較,純化后的酶液蛋白分子量約為1.3×105Da。

經(jīng)過(guò)硫酸銨分級(jí)鹽析,DEAE-52陰離子交換層析及Sephacryl S-300 High resolution凝膠柱層析后,β-葡萄糖苷酶的比活力從初始的481.15提高到854.57,純化倍數(shù)逐漸增加到1.78,最終得率為27.94%。

3 結(jié)論

本研究利用JMP 7.0軟件中的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型,從接種量、初始pH、發(fā)酵時(shí)間及裝液量四個(gè)方面優(yōu)化了黑曲霉CICC 2475產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的發(fā)酵工藝,得到最佳發(fā)酵工藝條件為接種量11.0%,初始pH5.6,發(fā)酵時(shí)間130 h,裝液量70.0 mL,制備的β-葡萄糖苷酶的最大酶活力平均為118.73 U/mL。同時(shí)經(jīng)過(guò)分級(jí)鹽析及柱層析對(duì)該酶進(jìn)行分離純化,得到分子量約為1.3×105Da的β-葡萄糖苷酶,為β-葡萄糖苷酶的提取純化、結(jié)構(gòu)性質(zhì)及應(yīng)用研究提供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Study on the fermentation conditions and purification ofβ-glucosidase fromAspergillusniger

GAO Qian,QIN Xiao-ming*,ZHONG Sai-yi,CHEN Jian-ping

(College of Food Science and Technology,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China)

To find the conditions of fermentation and purification process ofβ-glucosidase fromAspergillusnigerCICC 2475. The fermentation conditions ofβ-glucosidase fromAspergillusnigerCICC 2475 were optimized by artificial neural network in JMP 7.0. The crude enzyme was precipitated with ammonium sulfate,purified with DEAE-52 anion exchange chromatography and Sephacryl S-300 High resolution,and the enzyme molecular weights were identified by SDS-PAGE. The results showed that,the optimal fermentation conditions were as follows,inoculation amount 11.0%,initial pH5.6,fermentation time 130 h and broth content 70.0 mL,at this point,the enzyme activity reached 118.73 U/mL. Theβ-glucosidase could be efficiently purify by anion exchange chromatography and gel chromatography,and the enzyme molecular weights were about 1.3×105.

AspergillusnigerCICC2475;β-glucosidase;artificial neural network;purification

2016-09-13

高倩(1990-)，女，在讀碩士研究生，研究方向：農(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏,E-mail:spygaoqian2010@sina.com。

*通訊作者:秦小明(1964-)，男，博士，教授，研究方向：亞熱帶食品新資源開(kāi)發(fā)與利用,E-mail:xiaoming0502@21cn.com。

亞熱帶果蔬加工與利用技術(shù)研究(廣東省教育廳創(chuàng)新強(qiáng)校工程項(xiàng)目2013050214)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)05-0174-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.05.024