肝細(xì)胞癌患者循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的檢測、分型鑒定及其臨床意義

齊魯楠向邦德吳飛翔馬良陳祖舜葉甲舟黎樂群，3

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；2廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心；3區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室

臨床研究

肝細(xì)胞癌患者循環(huán)血腫瘤細(xì)胞的檢測、分型鑒定及其臨床意義

齊魯楠1，2向邦德1，2吳飛翔1，2馬良1，2陳祖舜1，2葉甲舟1，2黎樂群1，2，3

作者單位：530021 南寧1廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科；2廣西肝癌診療工程技術(shù)研究中心；3區(qū)域性高發(fā)腫瘤早期防治研究教育部重點實驗室

目的 通過對肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者外周循環(huán)血腫瘤細(xì)胞（c irculating tumor cells，CTCs）的檢測及亞型鑒定，分析其與HCC臨床分期的關(guān)系及對手術(shù)預(yù)后的影響。方法 采用CanPatrolTMCTC-二代捕獲技術(shù)聯(lián)合RNA多重原位雜交分析（RNA in situ hybridisation，RNA-ISH），檢測112例可手術(shù)切除HCC患者術(shù)前1～2 d與術(shù)后8～10 d外周循環(huán)血中的腫瘤細(xì)胞，并根據(jù)上皮-間葉轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況對其進(jìn)行分型鑒定。同時，抽取20名健康志愿者的外周血作對照。結(jié)果 112例HCC患者術(shù)前1～2 d檢測出CTCs 101例（90.18%），20名健康志愿者的外周血中未檢測到CTCs。根據(jù)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況，將檢測出的CTCs分為上皮型CTCs、上皮為主型CTCs、上皮/間葉混合型CTCs、間葉為主型CTCs及間葉型CTCs。其中CTC總數(shù)及間葉型CTC的比例與HCC的巴塞羅那肝癌臨床（barcelona clinic liver cancer，BCLC），分期密切相關(guān)。當(dāng)以CTC總數(shù)等于16作為臨界點時，預(yù)測患者術(shù)后極早期復(fù)發(fā)的敏感性為55.3%，特異性為92.3%，曲線下面積（area under the curve，AUC）為0.74；當(dāng)以間葉型CTC的比例等于2%作為臨界點時，預(yù)測患者術(shù)后極早期復(fù)發(fā)的敏感性為80.9%，特異性為69.2%，AUC為0.748。CTC總數(shù)≥16且間葉型CTC的比例≥2%組的患者中位無瘤生存期為3.5個月，明顯低于單純CTC總數(shù)≥16或間葉型CTC的比例≥2%組（7個月）和CTC總數(shù)＜16且間葉型CTC的比例＜2%組（13.5個月），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。112例HCC患者術(shù)后8～10 d CTC總數(shù)較術(shù)前有所下降，但間葉型CTC的比例較術(shù)前增多。術(shù)后出現(xiàn)間葉型CTC的比例增多的患者無瘤生存期短于間葉型CTC的比例下降（或不變）的患者，其預(yù)后也較差（P＜0.05）。對10例患者進(jìn)行術(shù)后連續(xù)定期CTCs變化的動態(tài)監(jiān)測直至復(fù)發(fā)，發(fā)現(xiàn)其中8例患者于出現(xiàn)臨床可見復(fù)發(fā)病灶前的1～2個月，CTCs就可出現(xiàn)逐漸增多的趨勢。結(jié)論 HCC患者外周血CTC陽性率高，CTCs能被檢測出存在于早期HCC患者外周血中，提示HCC的播散轉(zhuǎn)移是早期事件；術(shù)前高CTC總數(shù)或高間葉型CTC的比例以及術(shù)后出現(xiàn)間葉型CTC的比例增多的患者，其復(fù)發(fā)時限較短，預(yù)后較差。術(shù)后動態(tài)監(jiān)測CTCs變化，對HCC極早期復(fù)發(fā)的預(yù)測具有一定的臨床意義。

肝腫瘤；循環(huán)血腫瘤細(xì)胞（CTCs）；上皮-間葉轉(zhuǎn)化；復(fù)發(fā)；轉(zhuǎn)移；預(yù)后

肝細(xì)胞癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）是我國最常見的惡性腫瘤之一［1］。既往認(rèn)為通過HCC分期能很好地評估其預(yù)后。然而，某些處于早期的HCC患者，即使行根治性切除術(shù)，術(shù)后仍易短期內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移。因此，臨床上仍需探索與HCC術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的預(yù)測方法及防治措施。腫瘤細(xì)胞要實現(xiàn)循環(huán)系統(tǒng)的侵襲播散，首先必須發(fā)生細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)化。腫瘤細(xì)胞上皮-間葉轉(zhuǎn)化（e pithelial-mesenchymal transition，EMT）被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞血循環(huán)侵襲轉(zhuǎn)移關(guān)鍵的一步［2-3］。因此，檢測外周循環(huán)血腫瘤細(xì)胞（c irculating tumor cells，CTCs）及對其各亞型的鑒定分析具有重要的臨床價值。目前CTCs的檢測已經(jīng)被用于乳腺癌、肺癌、胃癌等患者預(yù)后的評估［4-9］。然而，關(guān)于CTCs在HCC患者中應(yīng)用的報道仍相對較少，特別是關(guān)于EMT轉(zhuǎn)化型CTCs檢測在評估可手術(shù)切除的HCC患者預(yù)后方面的報道。本研究采用CanPatrolTMCTC-二代捕獲技術(shù)聯(lián)合RNA多重原位雜交分析（RNA in situ hybridisation，RNA-ISH），檢測HCC患者術(shù)前與術(shù)后外周循環(huán)血中的CTCs，同時根據(jù)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況對其進(jìn)行分型鑒定，探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源

抽取2014年3月至2016年5月廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院肝膽外科112例可手術(shù)切除HCC患者外周血5mL。其中男性91例，女性21例；年齡32～65歲，中位年齡44.7歲。同時抽取20名健康志愿者外周血作對照。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療。所有選取的病例均履行告知義務(wù)并簽署知情同意書。

1.2 主要試劑及材料

CanPatrolTMCTC-二代捕獲技術(shù)及RNA-ISH試劑盒和相關(guān)材料購自廣州益善生物技術(shù)股份有限公司。其余試劑及儀器均由廣西醫(yī)科大學(xué)實驗中心提供。

1.3 操作方法

1.3.1 樣本采集 使用8號采血針和EDTA抗凝采血管采集5 mL外周血，將EDTA抗凝采血管上下顛倒混勻10次。將樣本保存管插入孔內(nèi)，EDTA抗凝采血管內(nèi)的血液自動輸入樣本保存管內(nèi)。待樣本保存管內(nèi)的液面不再上升后，拔出樣本保存管，上下顛倒混勻10次。室溫放置30min。

1.3.2 人外周循環(huán)血腫瘤細(xì)胞富集 離心去除上清液，固定劑固定8min。將真空管通過納米濾膜過濾器與真空泵連接。將樣本保存管中的液體轉(zhuǎn)移至過濾器中，實現(xiàn)腫瘤細(xì)胞納米技術(shù)截留與富集。濾過膜的樣本甲醛溶液室溫固定60min。

1.3.3 RNA多重原位雜交分析檢測 透化劑孵育5min，PBS洗滌3次。消化酶孵育60min，PBS洗滌3次。首先行EMT相關(guān)標(biāo)志物基因探針雜交（各探針序列詳見表1）。加入探針工作液，置于（40±1）℃生化培養(yǎng)箱中，孵育3 h，洗滌液洗滌3次。接著行擴(kuò)增探針雜交（目的是使用擴(kuò)增探針與捕獲探針進(jìn)行雜交，為雜交信號的放大做準(zhǔn)備），加入預(yù)擴(kuò)增工作液，置于（40±1）℃生化培養(yǎng)箱中，孵育30min，洗滌液洗滌3次。加入擴(kuò)增探針工作液，置于（40±1）℃生化培養(yǎng)箱中，孵育30min，洗滌液洗滌3次。最后進(jìn)行信號標(biāo)記探針雜交（使用標(biāo)記有熒光基團(tuán)的標(biāo)記探針與擴(kuò)增探針進(jìn)行雜交，產(chǎn)生熒光信號），加入顯色信號探針工作液，置于（40±1）℃生化培養(yǎng)箱中，孵育30 min，洗滌液洗滌3次。在樣本上加抗淬滅劑（含DAPI）。樣本放置5 min后利用自動識別系統(tǒng)閱讀熒光信號，自動判斷檢測結(jié)果［10］。

表1 EMT相關(guān)標(biāo)志物基因探針序列

1.3.4 結(jié)果分析及分型鑒定 試劑盒采用多重RNA探針（EMT相關(guān)標(biāo)志物基因探針），針對多種CTCs特異性基因，通過不同顏色熒光信號將CTCs分型。上皮型CTCs僅上皮相關(guān)標(biāo)志物（EpCAM、CK8/18/19）表達(dá)陽性，顯示為紅色熒光信號點；間葉型CTCs僅間葉相關(guān)標(biāo)志物（Vimentin和Twist）表達(dá)陽性，顯示為綠色熒光信號點；同時表達(dá)上皮和間葉特異性基因的CTCs為混合型（同時顯示紅色熒光及綠色熒光信號點）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。各指標(biāo)在組間陽性表達(dá)率的比較，采用四格表χ2檢驗或行×列表χ2檢驗；組間計量資料的比較采用Wilcoxom秩和檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法估計無瘤生存曲線，Log-rank檢驗比較無瘤生存曲線的差別。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC患者術(shù)前及健康志愿者外周血CTCs的檢測情況

根據(jù)EMT相關(guān)標(biāo)志物（EpCAM、CK8、CK18、CK9、Vimentin及Twist）的表達(dá)情況，將檢測出的CTCs分為上皮型CTCs（E-CTC）、上皮為主型CTCs（E＞M-CTC）、上皮/間葉混合型CTCs（E≈M-CTC）、間葉為主型CTCs（M＞E-CTC）及間葉型CTCs（M-CTC）（圖1A）。112例HCC患者術(shù)前1～2 d外周血可檢測出CTCs 101例（90.18%）（圖1B）。20名健康志愿者的外周血中未檢測到CTCs。其中手術(shù)前CTC總數(shù)及間葉型CTC的比例與HCC的巴塞羅那肝癌臨床（barcelona clinic liver cancer，BCLC）分期密切相關(guān)，即在BCLC B～C期患者中明顯高于BCLC 0～A期患者（P＜0.001）（圖1C、圖D）。

圖1 112例HCC患者術(shù)前CTC檢測及與BCLC分期的關(guān)系

2.2 HCC患者術(shù)前CTC檢測與手術(shù)預(yù)后的關(guān)系

圖2 HCC患者術(shù)前CTC檢測與手術(shù)預(yù)后的關(guān)系分析

由于術(shù)前CTC總數(shù)及間葉型CTC的比例與HCC的BCLC分期密切相關(guān)，本研究進(jìn)一步探討兩者作為預(yù)測術(shù)后極早期復(fù)發(fā)的可行性。將術(shù)后無瘤生存時間（復(fù)發(fā)時限）小于或等于6個月定義為術(shù)后極早期復(fù)發(fā)，以CTC總數(shù)及間葉型CTC的比例分別構(gòu)建受試者工作特征曲線（ROC），Youden指數(shù)（敏感性＋1-特異性）最大對應(yīng)的值作為臨界點（cut off）。當(dāng)以CTC總數(shù)等于16作為臨界點時，預(yù)測患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的敏感性為55.3%，特異性為92.3%，曲線下面積（area under the carve，AUC）為0.74；當(dāng)以間葉型CTC的比例等于2%作為臨界點時，預(yù)測患者術(shù)后早期復(fù)發(fā)的敏感性為80.9%，特異性為69.2%，AUC為 0.748（圖2A）。根據(jù)臨界點值，將112例患者分成3個亞組：CTC總數(shù)≥16并且間葉型CTC的比例≥2%組（n=25），單純CTC總數(shù)≥16或間葉型CTC的比例≥2%組（n=39）和CTC總數(shù)＜16且間葉型CTC的比例＜2%組（n=48）。在112例HCC患者中，共有91例患者在隨訪期間出現(xiàn)了HCC復(fù)發(fā)。所有患者6個月、12個月、24個月的腫瘤復(fù)發(fā)率分別為35.6%、54.3%、81.12%，中位無瘤生存期為13個月。其中CTC總數(shù)≥16且間葉型CTC的比例≥2%組患者的中位無瘤生存期為3.5個月，明顯低于單純CTC總數(shù)≥16或間葉型CTC的比例≥2%組（7個月）和CTC總數(shù)＜16且間葉型CTC的比例＜2%組（13.5個月）（P＜0.05）（圖2B）。

2.3 術(shù)后CTC變化的動態(tài)監(jiān)測

112例HCC患者于術(shù)后8～10 d復(fù)測CTC變化，結(jié)果顯示：112例患者術(shù)后8～10 d CTC的總數(shù)、上皮型CTC比例及各混合型CTC比例均有所下降（圖3A），但間葉型CTC比例有所增高（圖3B）。我們根據(jù)術(shù)后8～10 d CTC變化情況，將112例患者分為CTC總數(shù)減少（或無變化）組與CTC總數(shù)增多組，采用Kaplan-Meier法分析比較兩組無瘤生存時間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩組的無瘤生存時間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖3C）。根據(jù)術(shù)后間葉型CTC的比例變化分為間葉型CTC比例下降（或無變化）組與間葉型CTC比例增高組，兩組比較結(jié)果顯示，間葉型CTC比例增高組的無瘤生存時間明顯短于間葉型CTC比例下降（或無變化）組，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3D）。

接著對其中10例患者進(jìn)行術(shù)后連續(xù)定期CTC變化的動態(tài)監(jiān)測直至出現(xiàn)復(fù)發(fā)，發(fā)現(xiàn)其中8例患者于臨床出現(xiàn)可見復(fù)發(fā)病灶前的1～2個月，CTC便開始出現(xiàn)逐漸增多的趨勢。圖3E為其中1例典型患者的術(shù)后CTC總數(shù)及各亞型變化的動態(tài)監(jiān)測情況（直到復(fù)發(fā)時間截點），該患者術(shù)后第4個月臨床確診復(fù)發(fā)，但在術(shù)后第2個月CTC表現(xiàn)出上升趨勢。

3 討論

圖3 術(shù)后CTC數(shù)量及各亞型變化的檢測

腫瘤患者外周血中CTCs的檢測對于患者的診斷、預(yù)后評估具有重要的意義。包括HCC在內(nèi)的多數(shù)研究中，通過CellSearch系統(tǒng)檢測外周血CTCs是最常用的方法之一［6-8，11-12］。由于腫瘤細(xì)胞大多數(shù)來源于上皮細(xì)胞，所以會帶有上皮細(xì)胞特有的表面抗原EpCAM，CellSearch用帶抗EpCAM的磁珠富集循環(huán)血CTC細(xì)胞。然而，腫瘤細(xì)胞要發(fā)生轉(zhuǎn)移，首先要經(jīng)過“上皮-間葉轉(zhuǎn)化”，經(jīng)過EMT轉(zhuǎn)化獲得間葉表型的腫瘤細(xì)胞更容易播散進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)。因此，采用CellSearch檢測系統(tǒng)的局限在于其往往無法富集到“間葉表型CTC”。本研究中，我們采用CanPatrolTMCTC-二代捕獲技術(shù)對HCC患者外周血進(jìn)行CTCs俘獲，同時根據(jù)EMT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá)情況，采用RNA-ISH對俘獲到的CTC進(jìn)行亞型分型鑒定并鑒定出5種不同亞型的CTCs，其中包括“間葉表型CTC”，彌補了CellSearch的不足。

本研究112例HCC患者術(shù)前1～2 d，有101例檢測出CTCs，陽性率高達(dá)90.18%。并且，CTC在BCLC0-A期患者中具有較高的陽性率，提示在HCC的早期，癌細(xì)胞就可以出現(xiàn)體循環(huán)擴(kuò)散，即HCC的播散轉(zhuǎn)移可能是早期事件，符合腫瘤轉(zhuǎn)移“早期平行轉(zhuǎn)移學(xué)說”［13］。正因為CTC的播散可能發(fā)生在早期，甚至可能發(fā)生在傳統(tǒng)影像學(xué)檢查（B超、CT等）還無法檢測出可見病灶的極早期，因此，CTCs檢測作為一項“液態(tài)活檢”技術(shù)，有望成為HCC早期篩查、早期診斷的又一重要手段，為HCC早期干預(yù)治療提供有價值的依據(jù)。

雖然，肝癌CTC播散轉(zhuǎn)移可能是早期事件，但本研究仍然發(fā)現(xiàn)與BCLC分期密切相關(guān)，即CTC總數(shù)及間葉型CTC的比例在BCLC B～C期患者中明顯高于BCLC0～A期患者。并且，以CTC總數(shù)等于16或間葉型CTC的比例為2%作為臨界點，預(yù)測術(shù)后極早期復(fù)發(fā)（復(fù)發(fā)時限小于等于6個月）具有較高的敏感性及特異性，提示CTC總數(shù)及間葉型CTC的比例與HCC的進(jìn)展及患者的不良預(yù)后有關(guān)。某些乳腺癌、結(jié)腸癌及肺癌等研究也提示外周血中CTCs檢測陽性的患者術(shù)后復(fù)發(fā)率高，放化療療效不佳［4，11，14-15］。這些研究與本研究結(jié)果具有一致性。

以CTCs的變化評估肝癌治療方案療效的研究也有相關(guān)報道。比如，Wu等［10］研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)患者術(shù)后CTC總數(shù)出現(xiàn)明顯下降，且出現(xiàn)CTC總數(shù)明顯下降的患者，其無瘤生存期明顯延長。本研究對112例HCC患者術(shù)后8～10 d CTCs變化進(jìn)行復(fù)測，同樣發(fā)現(xiàn)CTCs總數(shù)較術(shù)前有所下降，但間葉型CTCs的總比例較術(shù)前增多。但CTC總數(shù)減少（或無變化）組與CTC總數(shù)增多組之間無瘤生存時間卻無明顯差別。甚至某些患者雖然術(shù)后8～10 d表現(xiàn)為CTC總數(shù)增加，但卻有著相對較長的無瘤生存時間。出現(xiàn)此結(jié)果的具體原因尚不明，可能與手術(shù)方式有關(guān)，即由于手術(shù)操作過程中對腫瘤產(chǎn)生擠壓作用，促使CTCs的循環(huán)播散，從而導(dǎo)致術(shù)后早期體循環(huán)中CTC總數(shù)增加。然而，此類CTC很可能由于缺乏抗“失巢凋亡”的能力在循環(huán)系統(tǒng)中很快發(fā)生凋亡，并不影響患者的無瘤生存期。換句話說，術(shù)后早期的CTC總數(shù)變化并不是評估預(yù)后的良好指標(biāo)。另有研究報道［4］，間葉型CTSs具有較強的轉(zhuǎn)移侵襲及抗凋亡能力。本研究亦發(fā)現(xiàn)術(shù)后間葉型CTCs比例增多的患者，其無瘤生存期較短，預(yù)后較差。

本研究定期連續(xù)監(jiān)測10例患者術(shù)后CTCs的變化，發(fā)現(xiàn)其中8例患者于臨床檢測出可見復(fù)發(fā)病灶前的1～2個月，CTC出現(xiàn)逐漸增多的趨勢。目前，暫無腫瘤細(xì)胞脫離原發(fā)瘤進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)后獲得自我增殖潛能的報道。然而，在Klein［13］的報道中提到這樣一個觀點：原發(fā)瘤被手術(shù)切除后，若監(jiān)測循環(huán)血CTCs出現(xiàn)動態(tài)變化，特別是當(dāng)其總量逐漸增加時，則可能提示原發(fā)瘤已經(jīng)在某些靶器官發(fā)生了定植轉(zhuǎn)移，盡管轉(zhuǎn)移灶或許還不能被傳統(tǒng)檢驗手段檢測出。如前所述，原發(fā)瘤的播散可能是早期事件，復(fù)發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶或許也能在極早期釋放CTCs進(jìn)入血循環(huán)。術(shù)后定期動態(tài)檢測CTCs變化，有可能先于傳統(tǒng)影像學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)并提示腫瘤極早期復(fù)發(fā)。因此，術(shù)后CTCs動態(tài)檢測有望成為HCC患者預(yù)測術(shù)后極早期復(fù)發(fā)的重要手段，為HCC復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的早期干預(yù)治療提供有價值的線索。

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［2016-11-07收稿］［2017-01-14修回］［編輯 江德吉］

Detection and classification of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma patients and their clinical significance

Qi Lunan1，2，Xiang Bangde1，2，Wu Feixiang1，2，Ma Liang1，2，Chen Zushun1，2，Ye Jiazhou1，2，Li Lequn1，2，3（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Guangxi Liver Cancer Diagnosis and Treatment Engineering and Technology Research Center；3Key Laboratory of High-Incidence-Tumor Early Prevention and Treatment，Ministry of Education，Nanning 530021，P.R.China）

Li Lequn.E-mail:Li_lequn@263.com

Objective To explore the distribution of circulating tumor cells（CTCs）in hepatocellular carcinoma（HCC）patients and to analyze their relationship with HCC clinical stage and prognosis after surgery.M ethods CanPatrolTMCTC-enrichment and in situhybridization（ISH）were used to isolate，identify and classify CTCs from the blood of 112 HCC patients and 20 healthy donors.Blood was collected from HCC patients at 1 or 2 days before resection as well as 8-10 days after resection.Results CTCs were detected in 101（90.18%）HCC patients but not in any of the healthy donors.CTCswere classified into five subpopulations based on EMTmarkers: epithelial CTCs（E-CTC），epithelial-predominant hybrid CTCs（E＞M-CTC），epithelial/mesenchymal hybrid CTCs（E≈M-CTC），mesenchymal-predominant hybrid CTCs（M＞E-CTC）and mesenchymal CTCs（M-CTC）.CTC count and M-CTC percentagewere closely related to BCLC stage of HCC.The cut-off value of 16 for CTC count predicted early recurrence with sensitivity of 55.3%，specificity of 92.3%and AUC of 0.74.The cut-off value of 2%for M-CTC percentage predicted recurrence with sensitivity of 80.9%，specificity of 69.2%and AUC of 0.748.Tumor-free survival analyses indicated that patientswith both CTC count≥16 and M-CTC≥2%showed significantly lower tumor-free survival than patientswith both CTC count<16 and M-CTC<2%and patientswith only CTC count≥16 or M-CTC≥2%.Postoperative levels were measured in all 112 patients at 8-10 days following resection.CTC count dropped after surgery，whereas M-CTC percentage increased.Patients in whom M-CTC percentage increased，showed significantly shorter tumor-free survival than patients in whom M-CTC percentage decreased or stayed the same（P＜0.05）.In 10 patientsmonitored postoperatively for CTC changes，8 displayed an increase in CTC count at 1-2months before recurrence or appearance ofmetastatic lesions.Conclusions CTCs were detected in a high percentage of HCC patients，including early-stage HCC patients，suggesting that tumor dissemination may be an early event.Patients with high CTC count and/or M-CTC percentage and patients in whom M-CTC percentage increased after surgery show lower tumor-free survival and worse prognosis.Postoperativemonitoring of changes in CTC counts after surgerymay allow early prediction of recurrence.

Liver neoplasms；Circulating tumor cells；Epithelial-mesenchymal transition；Recurrence；Metastasis；Prognosis

R735.7

A

1674-5671（2017）01-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2017.01.11

國家自然科學(xué)基金青年基金資助項目（81502533）；廣西科學(xué)基金青年基金資助項目（2013GXNSFBA019196）

黎樂群。E-mail：Li_lequn@263.com