Genistein對大鼠卵巢顆粒細胞CYP19表達的影響

溫海霞+孟毅++楊永斌+殷立維++張若瞳

[摘要] 目的 觀察大豆異黃酮主要活性成分金雀異黃素（Genistein）對大鼠卵巢顆粒細胞CYP19表達的影響，探討可能的分子機制。 方法 選擇25～28日齡的雌性大鼠21只，采用孕馬血清促性腺激素（PMSG）皮下注射法建立促卵泡發(fā)育模型，分離顆粒細胞進行培養(yǎng)。實驗分為0、0.1、1、5、10、100 μmol/L Genistein組、17β-E2（10 nmol/L）組、雌激素受體（ER）-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后加Genistein（1和10 μmol/L）組，空白對照組即0 μmol/L Genistein組。各組細胞處理48 h后，采用RT-PCR法檢測CYP19及其上游調(diào)控基因肝受體類似物（LRH-1）mRNA的表達。 結(jié)果 1、5和10 μmol/L Genistein組CYP19和LRH-1mRNA的表達高于空白對照組（P < 0.05）；而100 μmol/L Genistein組CYP19和LRH-1 mRNA的表達與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。與10 μmol/L Genistein相比，Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理細胞30 min后再加入10 μmol/L Genistein組LRH-1 mRNA的表達明顯下降（P < 0.05），而CYP19 mRNA的表達則未受Tamoxifen的影響（P > 0.05）。 結(jié)論 1、5和10 μmol/L Genistein可明顯上調(diào)大鼠卵巢顆粒細胞CYP19和LRH-1 mRNA表達，但這種促進作用可能并非通過ER-α介導(dǎo)。

[關(guān)鍵詞] 大豆異黃酮；Genistein；卵巢顆粒細胞；CYP19；LRH-1

[中圖分類號] R96 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（b）-0020-04

Effects of Genistein on the CYP19 expression in rat ovarian granulosa cells

WEN Haixia1 MENG Yi2 YANG Yongbin1 YIN Liwei1 ZHANG Ruotong1

1.Department of Physiology， Harbin Medical University， Heilongjiang Province， Harbin 150081， China； 2.Heilongjiang Nursing College， Heilongjiang Province， Harbin 150086， China

[Abstract] Objective To investigate the effects and molecular mechanism of Genistein， which is a major active component for soy isoflavones， on the CYP19 expression in the rat ovarian granulosa cells. Methods 21 female rats， 25-28 day-old， were injected subcutaneously with pregnant mare serum gonadotrophin （PMSG）， ovarian granulosa cells were collected， incubated and treated with Genistein （0， 0.1， 1， 5， 10， 100 μmol/L）， 17β-E2 （10 nmol/L）， and Genistein （1， 10 μmol/L） with estrogen receptor-α （ER-α） blocker Tamoxifen （1 μmol/L） pretreated for 30 min. Control group was 0 μmol/L Genistein group. After treated for 48 h， the CYP19 and upstream regulated gene liver receptor homolog-1 （LRH-1） mRNA expression levels were assessed by RT-PCR. Results Compared with the control group， the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA increased for 1， 5 and 10 μmol/L Genistein group （P < 0.05）； but the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA for 100 μmol/L Genistein group had no significant difference （P > 0.05）. Compared with 10 μmol/L Genistein group， the expression of LRH-1 mRNA decreased for Genistein （10 μmol/L） with Tamoxifen （1 μmol/L） pretreated for 30 min （P < 0.05）， but the expression of CYP19 mRNA was not influenced by Tamoxifen （P > 0.05）. Conclusion 1， 5 and 10 μmol/L Genistein can up-regulation the expression of CYP19 and LRH-1 mRNA in the rats ovarian granulosa cells. The molecular mechanism of Genistein effect on the CYP19 gene expression is not mediated by ER-α.

[Key words] Soy isoflavones； Genistein； Ovarian granulosa cells； CYP19； LRH-1

大豆異黃酮主要活性成分金雀異黃素（Genistein）具有極強的抗氧化能力[1-2]，因化學(xué)結(jié)構(gòu)與雌激素非常相似，能與雌激素受體（ER）結(jié)合發(fā)揮雌激素樣作用，也被稱為植物雌激素[3]。研究表明，大豆異黃酮可調(diào)節(jié)雌性內(nèi)分泌活動，改善圍絕經(jīng)期綜合征臨床癥狀[4-8]。卵巢顆粒細胞芳香化酶基因CYP19是雌激素生成的關(guān)鍵酶，之前研究發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可影響衰老模型大鼠卵巢芳香化酶的表達[9]，但分子機制尚不清楚。本研究采用細胞培養(yǎng)、RT-PCR等方法，觀察Genistein對大鼠卵巢顆粒細胞CYP19及上游調(diào)控基因表達的影響，并利用ER-α阻斷劑進一步觀察Genistein對CYP19基因表達的影響與ER-α的關(guān)系，探討大豆異黃酮調(diào)節(jié)卵巢局部內(nèi)分泌功能的分子機制。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

25～28日齡未成年健康雌性SD大鼠21只，平均體重（70±10）g，由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗動物使用許可證號：（黑）2013-002。

1.2 主要儀器及試劑

PTC-100型PCR擴增儀（美國MJ. Research）；UV-752紫外分光光計（英國Amersham）；GIS凝膠圖像掃描及分析系統(tǒng)（上海天能生物）。

Genistein（GEN）、17β-雌二醇（17β-E2）及Tamoxifen（TAM）（美國Sigma）；Trizol（美國Invitrogen）；BcaBESTTM RNA PCR Kit（大連Takara）；PCR引物（上海英駿生物合成）。Genistein、17β-E2和Tamoxifen均溶解于70%乙醇，-20℃保存。

1.3 實驗分組及處理

實驗大鼠7只，頸部皮下注射血清促性腺激素（PMSG，60 U/只），建立促卵泡發(fā)育模型。48 h后急性斷髓處死大鼠，仔細剝離出雙側(cè)卵巢，用小號針頭反復(fù)刺破卵泡并吹打，使顆粒細胞充分釋放，200 μm濾網(wǎng)去除組織殘渣后離心，向細胞沉淀中加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液（含青/鏈霉素），用培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至3×105～5×105個/mL，充分混勻。將細胞懸液分至6孔板（1 mL/孔），37℃培養(yǎng)箱（5%CO2，95%空氣）孵育。細胞培養(yǎng)48 h后，加入Genistein（濃度參考文獻[10-11]）等因素處理。

細胞共分9組：① 0 μmol/L Genistein組（空白對照組，A組）；②17β-E2（10 nmol/L）組（B組）；③0.1 μmol/L Genistein組（C組）；④1 μmol/L Genistein組（D組）；⑤5 μmol/L Genistein組（E組）；⑥10 μmol/L Genistein組（F組）；⑦100 μmol/L Genistein組（G組）；⑧ER-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后加1 μmol/L Genistein組（H組）；⑨1 μmol/L Tamoxifen預(yù)處理30 min后加10 μmol/L Genistein組（I組）。繼續(xù)培養(yǎng)細胞48 h后，收集細胞于-70℃保存，用于總RNA提取和RT-PCR。各組實驗重復(fù)3次。

1.4 觀察指標及檢測方法

采用RT-PCR法檢測基因mRNA表達。Trizol提取細胞總RNA，按BcaBESTTM RNA PCR Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄。采用Gene Runner軟件設(shè)計引物，以β-actin作為內(nèi)參。引物序列及產(chǎn)物長度見表1，PCR擴增條件及循環(huán)數(shù)見表2。產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，GIS凝膠成像系統(tǒng)掃描及條帶灰度分析，以目的基因與β-actin灰度比值代表其相對表達量。每組實驗重復(fù)3次。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Genistein對顆粒細胞CYP19 mRNA表達的影響

RT-PCR電泳結(jié)果顯示，各組細胞均擴增出一條清晰的大小約289 bp的CYP19特異片段。見圖1。

條帶分析結(jié)果顯示：1、5和10 μmol/L Genistein作用細胞48 h后，D、E、F組CYP19 mRNA表達顯著增加，顯著高于A組（均P < 0.05）；100 μmol/L Genistein作用后，G組CYP19 mRNA的表達與A組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后，分別加入1和10 μmol/L Genistein繼續(xù)處理48 h，H組CYP19 mRNA表達與D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），I組與F組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

與A組比較，*P < 0.05；A～I為A～I組；A組：0 μmol/L Genistein組（空白對照組）；B組：17β-E2（10 nmol/L）組；C組：0.1 μmol/L Genistein組；D組：1 μmol/L Genistein組；E組：5 μmol/L Genistein組；F組：10 μmol/L Genistein組；G組：100 μmol/L Genistein組；H組：ER-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后加1 μmol/L Genistein組；I組：1 μmol/L Tamoxifen預(yù)處理30 min后加10 μmol/L Genistein組

2.2 Genistein對顆粒細胞LRH-1mRNA表達的影響

RT-PCR電泳結(jié)果顯示，各組細胞均擴增出一條清晰的大小約540 bp的LRH-1特異片段。見圖3。

M：DNA分子量標準（bp） ；A～I為A～I組；A組：0 μmol/L Genistein組（空白對照組）；B組：17β-E2（10 nmol/L）組；C組：0.1 μmol/L Genistein組；D組：1 μmol/L Genistein組；E組：5 μmol/L Genistein組；F組：10 μmol/L Genistein組；G組：100 μmol/L Genistein組；H組：ER-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后加1 μmol/L Genistein組；I組：1 μmol/L Tamoxifen預(yù)處理30 min后加10 μmol/L Genistein組

條帶分析結(jié)果顯示，1、5和10 μmol/L Genistein及10 nmol/L 17β-E2作用顆粒細胞48h后，B、D、E、F組LRH-1 mRNA表達增加，顯著高于A組（均P < 0.05）；100 μmol/L Genistein作用后，G組LRH-1 mRNA的表達與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。Tamoxifen（1 μmol/L）預(yù)處理30 min后，分別加入1和10 μmol/L Genistein繼續(xù)處理48 h，H組LRH-1 mRNA表達與D組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05），I組則顯著低于F組（P < 0.05）。見圖4。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，Genistein可增加卵巢癌細胞對常規(guī)化療藥物的敏感性[10]，但其作用機制尚不明確。還有報道Genistein可調(diào)節(jié)肝細胞HepG2的CYP19表達，誘導(dǎo)細胞系芳香化酶的活性[11]。筆者前期實驗發(fā)現(xiàn)，大豆異黃酮可上調(diào)衰老大鼠卵巢ER-α表達，并促其下游LRH-1和CYP19的表達[9，12]；離體實驗也發(fā)現(xiàn)，Genistein可調(diào)節(jié)大鼠卵巢顆粒細胞ER-α mRNA表達[13]。然而，大豆異黃酮對卵巢CYP19表達的影響是否通過ER-α介導(dǎo)，目前仍不明確。因此，本研究以卵巢顆粒細胞CYP19的轉(zhuǎn)錄調(diào)控為切入點，通過細胞培養(yǎng)，給予不同劑量的Genistein及ER-α阻斷劑Tamoxifen等因素處理細胞，應(yīng)用RT-PCR技術(shù)，檢測Genistein對CYP19基因表達的影響，探討其可能的作用機制。RT-PCR結(jié)果顯示，1、5和10 μmol/L Genistein作用顆粒細胞48 h，可上調(diào)CYP19 mRNA的表達；ER-α阻斷劑Tamoxifen（1 μmol/L）對Genistein上調(diào)CYP19 mRNA的表達無明顯抑制作用，提示Genistein對CYP19 mRNA表達的促進作用可能并非通過ER-α途徑實現(xiàn)。

孤兒核受體LRH-1作為CYP19上游重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控卵巢芳香化酶的表達[14-15]。此外，17β-E2能高效誘導(dǎo)乳腺癌細胞LRH-1表達，通過ER-α直接結(jié)合于LRH-1啟動子[16-17]。LRH-1是否介導(dǎo)ER和CYP19之間的信號傳遞，從而在卵巢局部發(fā)揮對雌激素生成的調(diào)節(jié)作用目前尚不清楚。本研究結(jié)果顯示，1、5和10 μmol/L的Genistein及10 nmol/L 17β-E2均可上調(diào)卵巢顆粒細胞LRH-1 mRNA的表達，應(yīng)用ER-α阻斷劑Temoxifen預(yù)處理細胞后，可明顯抑制10 μmol/L Genistein對LRH-1mRNA表達的上調(diào)作用，提示ER-α可能介導(dǎo)了Genistein對LRH-1表達的調(diào)控。然而，結(jié)合CYP19表達及前期ER-α mRNA表達的結(jié)果，筆者進一步推測，Genistein雖可調(diào)節(jié)顆粒細胞ER-α、LRH-1和CYP19的表達，但對CYP19表達的調(diào)控可能并非通過ER-α介導(dǎo)。近年有研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癌CYP19啟動子Ⅰ的表達是通過一種新型膜性ER（G蛋白偶聯(lián)雌激素受體，GPER）介導(dǎo)的，與經(jīng)典ER無關(guān)，下游經(jīng)過LRH-1及ERK的信號通路激活CYP19[18-20]。由此推測，Genistein影響卵巢顆粒細胞CYP19的表達也可能是由GPER介導(dǎo)，這還需后續(xù)展開更深入的研究證實。

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（收稿日期：2016-09-02 本文編輯：程 銘）