正交試驗優(yōu)選山芪補腎消渴丸提取工藝的研究

陳震堯+劉燕

[摘要]目的 篩選山芪補腎消渴丸的最佳提取工藝條件。方法 采用正交試驗法，以續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取率和總固體物收率作為考察指標，針對對提取影響較大的加水量、提取次數(shù)、提取時間三因素進行考察，從而確定一個較為合理的提取工藝，根據(jù)研究結(jié)果進行三批中試，驗證提取工藝的可行性及產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。結(jié)果 實驗證明，正交試驗優(yōu)選出的最佳提取工藝條件是藥材飲片加水煎煮提取2次，每次加8倍水，第1次提取2 h，第2次提取1.5 h。結(jié)論 山芪補腎消渴丸優(yōu)選出的提取條件經(jīng)穩(wěn)定性驗證是可行的，適合大批量生產(chǎn)。

[關(guān)鍵詞]山芪補腎消渴丸；提取工藝；正交試驗；川續(xù)斷皂苷Ⅵ；總固體物收率

[中圖分類號] R927 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2016）12（b）-0015-04

Research on optimizing the extraction technique of Shanqibushenxiaoke Pills using orthogonal experiments

CHEN Zhen-yao1 LIU Yan2

1.Drug Manufacturing Room，Hospital of Traditional Chinese Medicine of Zhaoqing City in Guangdong Province，Zhaoqing 526020，China；2.Department of Pharmacy，Zhaoqing Medical College，Guangdong，Zhaoqing 526020，China

[Abstract]Objective To optimize the extraction technique of Shanqibushenxiaoke Pills.Methods Orthogonal experimental design was used to optimize the extraction technique.The extraction rate of the Dipsacus saponin Ⅵ and the recovery rate of total solids were used as observation indexes.To determine a more reasonable extraction technique，three factors which had greater influence on the extraction，including the amount of water used，the number of repetitions of extraction，and the extraction time were studied.According to the results of the orthogonal experiments，three pilot scale trials were performed to verify the feasibility of the extraction technique and the consistency of the product quality.Results The experimental result proved that the optimized extraction technique determined by using the orthogonal experiments was as follows：the Chinese herbal pieces was decocted with water and extracted for 2 times，each time with 8 times of water，extracted 2 hours in the first times，extracted 1.5 hours in the second times.Conclusion The optimized extraction technique for the Shanqibushenxiaoke Pills was feasible and which was suitable for the large scale production.

[Key words]Shanqibushenxiaoke Pills；Extraction technique；Orthogonal experiment；Dipsacus saponin Ⅵ；The recovery rate of total solid

山芪補腎消渴丸由山藥、黃芪、山茱萸、芡實、蓮子、太子參、續(xù)斷、五味子、白術(shù)、訶子、肉豆蔻、荷葉組成，具有健脾益氣、補腎澀精止漏功效，主治脾腎兩虛、腎陰虧虛、陰陽兩虛型的糖尿病。本制劑為濃縮丸，根據(jù)處方藥物性質(zhì)及資料研究，本研究擬對處方中的黃芪[1]、荷葉[2]、訶子[3]、續(xù)斷[4]、太子參[5]、五味子[6]、肉豆蔻[7]等七味藥物加水煎煮提取，采用正交試驗法，優(yōu)選最佳提取工藝并進行中試試驗驗證其可行性。

1儀器與試藥

1.1儀器

WATERS-515型高效液相色譜儀（美國沃特世公司），F(xiàn)A1004N電子天平（上海精密科學儀器有限公司），KQ5200DE型臺式數(shù)控超聲波清洗器（東莞科橋超聲波設(shè)備有限公司），JC101型電熱鼓風干燥箱（上海成順儀器光有限公司），立式萬用電爐（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）。

1.2試藥

川續(xù)斷皂苷Ⅵ（中國藥品生物制品檢定所，批號：111685-201304）；藥材購自肇慶得隆中藥飲片廠，經(jīng)鑒定均符合《中國藥典》2015年版一部各項下有關(guān)規(guī)定；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑為分析純，水為純化水。

2方法與結(jié)果

2.1提取工藝的確定

主要根據(jù)處方各藥有效成分的理化性質(zhì)及其藥理作用，同時考慮臨床需要、生產(chǎn)可行性以及生產(chǎn)設(shè) 備等方面的因素設(shè)計工藝流程，擬采用加水煎煮提取工藝。

2.2正交試驗設(shè)計

2.2.1因素水平選擇

影響提取結(jié)果的因素很多，主要有加水倍量、提取次數(shù)、提取時間等，本研究采用正交試驗法，選取加水量（A）、提取次數(shù)（B）、提取時間（C）作為考察因素[8]，每個因素設(shè)計3個水平，進行L9（34）正交試驗，篩選出最佳的工藝條件。因素水平見表1。

2.2.2考察指標的確定

續(xù)斷為方中主要藥味，主要成分為三萜皂苷類[9]，具有抗炎鎮(zhèn)痛作用[10]。設(shè)計本實驗方案時，選取HPLC法測定水提取液中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，其為重要的考察指標，權(quán)重系數(shù)定為0.6；水提取液中總固體物（即干膏得率）作為浸膏總有效成分考察的另一個指標，權(quán)重系數(shù)定為0.4，以兩者的結(jié)果進行綜合評分，考察加水倍量、提取次數(shù)、提取時間三因素對提取工藝的影響，優(yōu)選出最佳的工藝參數(shù)。

2.3正交試驗的實驗方法

2.3.1樣品的制備

按處方比例稱取訶子、肉豆蔻、續(xù)斷、黃芪、荷葉、五味子、太子參等藥材，按實驗方案設(shè)定的方法提取，過濾，濾液靜置過夜，取上清濃縮至適量，定容至1000 ml，備用。

2.3.2續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測定

2.3.2.1色譜條件 色譜柱：Agilent Extend C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（30∶70）；檢測波長：212 nm；流速：0.8 ml/min；柱溫：25℃[11]。

2.3.2.2對照品溶液的制備 精密稱取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品15 mg，置于10 ml量瓶中，加甲醇搖勻使全部溶解，稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得對照品溶液，濃度為0.15 mg/ml。

2.3.2.3供試品溶液的制備 將提取液濃縮并定容至1000 ml的樣品，精密量取0.7 ml置于10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，用甲醇補足損失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.2.4標準曲線的制備 精密吸取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對照品溶液3、5、10、15、20 μl進樣，按上述色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以峰面積積分值為縱坐標（Y），對照品溶液進樣量為橫坐標（X），按最小二乘法進行回歸，得回歸方程為Y=274X-4910，r=0.9999，顯示川續(xù)斷皂苷Ⅵ在0.45～3.00 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖1）。

2.3.2.5樣品含量的測定 精密吸取各正交試驗設(shè)計的供試品溶液各10 μl，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，根據(jù)供試品吸收度積分值與對照品積分值，采用外標兩點法計算，即得。

2.3.3干膏得率的測定

精密吸取實驗方案中各樣品濃縮液10 ml，置于已恒重的蒸發(fā)皿里，水浴蒸干，按照干燥失重測定法[12]103測定，計算干膏得率，公式如下：

干膏得率（%）=×100%

W為各樣品10 ml濃縮液中干浸膏重量，V為定容體積，Wt為飲片重量。

2.3.4評價指標綜合評分

根據(jù)“2.2.2”項下考察指標的確定，以水提液中續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量和總固體物的收率為指標，采用公式[Y=（60/續(xù)斷皂苷Ⅵ含量max）×續(xù)斷皂苷Ⅵ含量+（40/得膏率max）×得膏率][13]計算綜合評分，采用SPSS 12.0統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行處理。

2.4正交試驗結(jié)果及分析

2.4.1實驗結(jié)果

取“2.3.1”項下制備好的樣本，按正交表設(shè)定條件及上述實驗方法試驗，正交試驗安排及結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

2.4.2結(jié)果分析

對正交試驗結(jié)果作直觀分析，結(jié)合方差分析，判斷各因素對提取效果的影響程度，篩選出最佳的提取條件。由表2的實驗結(jié)果可知，對提取效果有影響的因素順序為提取次數(shù)（B）>提取時間（C）>加水倍量（A），由此得到的最佳工藝條件為A2B3C3。由表3的方差分析可知，提取次數(shù)（B）對提取結(jié)果有顯著性影響，提取時間（C）對提取結(jié)果有一定影響，而加水倍量（A）對實驗結(jié)果無顯著性影響。提取次數(shù)之間的主要差異體現(xiàn)在提取1次和提取2次之間，通過綜合分析，認為以縮短生產(chǎn)周期，降低生產(chǎn)成本等綜合因素為宜，選擇A1B2C3作為本實驗的最佳提取工藝條件，即藥材飲片加水回流提取2次，每次加8倍水量，第1次提取2 h，第2次提取1.5 h。

2.5穩(wěn)定性試驗

為確定本工藝的優(yōu)劣與穩(wěn)定性，依據(jù)上述分析優(yōu)選出的最佳工藝條件（即A1B2C3）進行三批驗證實驗，結(jié)果見表4。由表4可知，驗證實驗的結(jié)果與正交試驗優(yōu)選的結(jié)果相符，提示正交試驗優(yōu)選出的工藝條件合理，方法穩(wěn)定可行。

3討論

續(xù)斷性苦味辛，微溫，有補肝腎作用[12]329，續(xù)斷皂苷是其有效成分之一，含量指標川續(xù)斷皂苷Ⅵ有成熟的高效液相色譜測定方法，《中國藥典》2015年版及相關(guān)文獻都有收載[14-15]，所以本試驗以川續(xù)斷皂苷Ⅵ的提取率和總固體物收率作為考察指標，在操作應(yīng)用上是切實可行的。

本提取工藝條件在實際工作中經(jīng)中試放大驗證，結(jié)果與小試基本一致，所以該提取工藝條件優(yōu)選出的條件是合理可行的，可在大生產(chǎn)中應(yīng)用。

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