可得然膠高產(chǎn)菌株的亞硝基胍誘變育種及其發(fā)酵條件的優(yōu)化

王欽　靳曉菡　牛寶琳　阮寬容　陸澤赟　金明飛　常忠義　高紅亮

摘要[目的]研究用亞硝基胍（NTG）對產(chǎn)可得然膠菌株進(jìn)行誘變育種及發(fā)酵條件優(yōu)化，為可得然膠產(chǎn)量提升的研究提供參考。[方法]以土壤桿菌HS615（Agrobacterium sp.）為出發(fā)菌株，通過NTG誘變篩選高產(chǎn)菌株，再利用單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，提高得率。[結(jié)果]根據(jù)致死率確定了NTG的誘變條件為0.5 mg/mL，NTG處理30 min。其次根據(jù)菌落顏色和大小確定了初篩平板培養(yǎng)基為1.0%葡萄糖，0.2%酵母粉，0.05%苯胺藍(lán)，初始pH為7.0。經(jīng)過NTG誘變得到1株可得然膠得率比出發(fā)菌株高11.79%的高產(chǎn)菌株。單因素和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基成分為11.0%蔗糖，0.3%玉米漿，0.2% KH2PO4，0.2%K2HPO4，0.2%NH4Cl，0.2%CaCO3，0.1% MgSO4·7H2O，此時(shí)可得然膠得率為5.67%，比優(yōu)化前提高了6.78%，比初始產(chǎn)量提高了19.37%。[結(jié)論]該研究可為可得然膠高產(chǎn)菌株篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞土壤桿菌；可得然膠；誘變育種；發(fā)酵

中圖分類號TQ920.6文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）33-0083-04

Mutagenesis Breeding of Nitrosoguanidine and Optimization of Fermentation Conditions in High Yield Strain of Curdlan

WANG Qin， JIN Xiaohan， NIU Baolin，GAO Hongliang* et al

（College of Life Sciences， East China Normal University， Shanghai 200241）

Abstract[Objective]To study the mutagenic breeding and fermentation conditions optimization of the strain producing guar gum by NTG， and to provide reference for the study of the increase of available gum yield. [Method] The strain was screened by Agrobacterium sp. HS615 （Agrobacterium sp.）， And the fermentation medium was optimized by single factor and orthogonal design. [Result]The mutagenic conditions of NTG were determined to be 0.5 mg/mL and NTG for 30 min. Followed by the colony color and size of the screening medium was identified as： 1.0% glucose， 0.2% yeast powder， 0.05% aniline blue， the initial pH of 7.0. A strain with high yield of Curdlan was 11.79% higher than that of the original strain. The single factor and orthogonal design optimized fermentation medium components were： 11.0% sucrose， 03% corn steep liquor， 0.2% KH2PO4， 0.2% K2HPO4， 0.2% NH4Cl， 0.2% CaCO3， 0.1% MgSO4·7H2O at this time Curdlan yield Was 5.67% higher than the preoptimization of 6.78%， compared with the initial yield increased by 19.37%.[Conclusion] This study can provide a reference for the selection of Curdlan high yield strains and optimization of fermentation conditions.

Key wordsAgrobacterium sp. ；Curdlan；Mutation breeding；Fermentation

可得然膠多糖（Curdlan）又稱為熱凝膠多糖，是由單一的D-葡萄糖在 C1和C3位置以β-1，3-糖苷鍵連接而成的無分支的均一多糖聚合物[1]。由于其具有獨(dú)特的熱成膠性質(zhì)，被用于食品中作為穩(wěn)定劑、增稠劑和調(diào)質(zhì)劑使用[2]；同時(shí)可得然膠由于其獨(dú)特的大分子結(jié)構(gòu)及特殊的三股螺旋高級立體分子構(gòu)造[3]，經(jīng)過修飾后還具有良好的生物活性，可以應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域，起抗腫瘤、預(yù)防癌癥、治療瘧疾以及抗凝血等作用[4-8]。因此，可得然膠在食品醫(yī)藥工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

提高可得然膠產(chǎn)量的關(guān)鍵是獲得高性能的生產(chǎn)菌株。在微生物育種中，利用亞硝基胍（NTG）化學(xué)誘變劑處理菌株是常用的誘變方法。為有效快速地分離出高產(chǎn)菌株，該研究利用苯胺藍(lán)平板進(jìn)行菌株顯色篩選。苯胺藍(lán)是一種分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的酸性染料[9]，可得然膠中的β-1，3鍵與其結(jié)合具有特異性[10-11]，能產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物，且藍(lán)色復(fù)合物的合成率與聚合物濃度相關(guān)。因此苯胺藍(lán)平板顯色法將會是篩選產(chǎn)微生物多糖菌株的優(yōu)良方法。筆者用NTG對1株土壤桿菌HS615（Agrobacterium sp.）進(jìn)行化學(xué)誘變，將誘變后的菌液涂布在苯胺藍(lán)平板上進(jìn)行初步篩選后，在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，粗提產(chǎn)物測其得率，以此篩選出1株性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株，并對發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，為可得然膠的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株。

華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物與食品安全實(shí)驗(yàn)室保藏的土壤桿菌HS615 （Agrobacterium sp.HS615）。

1.1.2主要試劑。

葡萄糖、苯胺藍(lán)、酵母粉、瓊脂粉、聚蛋白胨、酵母粉、 NaCl、（NH4）2HPO4、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCO3、酵母膏液。

1.1.3主要儀器。

隔水恒溫培養(yǎng)箱（GNP-9160），上海精宏；全溫恒溫培養(yǎng)搖床（QZQY-BF），知楚儀器；冷凍離心機(jī)（RC6PLUS），Thermo；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9246A），上海精宏。

1.1.4培養(yǎng)基。

苯胺藍(lán)篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基：葡萄糖7.00%、苯胺藍(lán) 0.05%、酵母粉0.20%、瓊脂粉 2.00%，pH 7.0。

PY培養(yǎng)基：多聚蛋白胨1.0%、酵母粉 0.5%、 NaCl 0.5%，pH 7.2。

發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：蔗糖9.0%、（NH4）2HPO40.2%、 KH2PO4 0.2%、 MgSO4·7H2O 0.1%、CaCO30.2%、酵母膏液0.4%，pH 7.0。

1.2方法

1.2.1誘變。

1.2.1.1制備菌懸液。

將出發(fā)菌株在PY培養(yǎng)基中30 ℃ 200 r/min 搖床培養(yǎng)20 h，菌液離心后用生理鹽水重懸后備用。

1.2.1.2菌株誘變。

用pH 8.5的0.2 mmol/L Tris-馬蘭酸緩沖液溶解 NTG，并制備不同濃度NTG加入到備用菌懸液中，用錫箔紙包裹避光，并于30 ℃ 200 r/min 搖床處理不同誘變時(shí)間。處理結(jié)束后加入500 μL硫代硫酸鈉溶液終止反應(yīng)，并用生理鹽水重懸。

1.2.2篩選。

1.2.2.1誘變菌株平板篩選。

在苯胺藍(lán)平板上加入100 μL不同稀釋度的誘變菌液涂布均勻后30 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.2.2搖瓶發(fā)酵篩選。

苯胺藍(lán)平板上挑取藍(lán)色較深、菌落較大的菌株進(jìn)行劃線分離，單菌落擴(kuò)配后接種到50 mL錐形瓶，30 ℃、250 r/min 搖床培養(yǎng)96 h，測定可得然膠得率。

1.2.3可得然膠得率測定。

稱取10 g發(fā)酵液于離心管中，9 000 r/min離心5 min。倒去上清液后加入20 mL 95%的乙醇，9 000 r/min離心5 min，倒去上清后將沉淀取出置于培養(yǎng)皿中，放置于60 ℃烘箱中過夜，干燥后稱重即為可得然膠得率。

1.2.4數(shù)據(jù)分析及處理。

采用Excel、SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以P<0.05為有顯著性。采用GraphPad prism 5.0 進(jìn)行圖表繪制。

2結(jié)果與分析

2.1NTG誘變條件的確定

2.1.1NTG誘變劑量。

該研究以108 CFU/mL的菌體濃度進(jìn)行誘變試驗(yàn)，選取了0、0.1、0.3、0.5、0.7和1.0 mg/mL 6

個(gè)劑量，誘變30 min，結(jié)果如圖1所示。NTG為0.1 mg/mL

時(shí)，致死率僅為65%；為0.5 mg/mL時(shí)，致死率為98%；NTG 0.7和1.0 mg/mL時(shí)致死率已接近100%。因此，該試驗(yàn)選取0.5 mg/mL的NTG濃度進(jìn)行誘變。

2.1.2NTG誘變時(shí)間。

以0.5 mg/mLNTG劑量，分別誘變20、30、40、50 min。由圖2可見，當(dāng)處理時(shí)間分別為20和30 min時(shí)，菌株的致死率分別為90.8%和99.0%，而處理時(shí)間為40和50 min時(shí)致死率已接近100%。

根據(jù)致死率情況最終確定NTG誘變劑量為0.5 mg/mL，誘變時(shí)間為30 min。

2.2苯胺藍(lán)篩選培養(yǎng)基的優(yōu)化

由于可得然膠含有β-1，3-糖苷鍵，可被苯胺藍(lán)特異性地染成藍(lán)色[12]，有利于平板初篩。培養(yǎng)基中氮源和碳源濃度均會影響菌落的大小和顯色的時(shí)間，因此優(yōu)化了篩選培養(yǎng)基配方中的氮源酵母粉和碳源葡萄糖。

2.2.1氮源的優(yōu)化。

在培養(yǎng)基中添加0.1%、0.2%、0.3%和0.4%的酵母粉，其他成分同苯胺藍(lán)篩選基礎(chǔ)培養(yǎng)基，涂布誘變后的菌株培養(yǎng) 96 h后進(jìn)行觀察。如圖3所示，平板中部分區(qū)域顯示藍(lán)色，隨著酵母粉濃度的增加，菌落顯色面積減小。這是由于土壤桿菌培養(yǎng)基中氮源耗盡后才開始產(chǎn)膠，氮源濃度越低，產(chǎn)膠越早，顯色越早。但隨著酵母粉濃度的減小，菌落也隨之減小，因此該試驗(yàn)選擇0.2%的酵母粉濃度。

2.2.2碳源的優(yōu)化。

在苯胺藍(lán)篩選培養(yǎng)基中，酵母粉固定為0.2%，葡萄糖濃度分別為1.0%和7.0%時(shí)，培養(yǎng)96 h結(jié)果見圖4。菌落的大小差異不大，但1.0%濃度的葡萄糖可以有效減緩平板底板變藍(lán)的效應(yīng)，因此選擇1.0%的葡萄糖濃度。最終確定苯胺藍(lán)篩選平板的酵母粉濃度為0.2%，葡萄糖濃度為1.0%。

2.3NTG對土壤桿菌的誘變

2.3.1NTG誘變菌株的初篩。

出發(fā)菌株HS615經(jīng)NTG誘變后，稀釋涂布平板，共涂布約10 000株菌，挑選菌落藍(lán)色且偏大的突變菌株287株，接種于斜面培養(yǎng)24 h，之后刮取一環(huán)接種于搖瓶發(fā)酵初篩，結(jié)果如圖5所示。出發(fā)菌株得率為437%，其中可得然膠得率超過出發(fā)菌株5%的菌株有15個(gè)，超過出發(fā)菌株10%的菌株有7個(gè)，超過出發(fā)菌株15%的菌株有1個(gè)，其中170221-16#菌株得率最高，為5.03%。

2.3.2NTG誘變菌株的復(fù)篩。

對初篩得率高于出發(fā)菌株5%的菌株進(jìn)行再次搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，可得然膠得率如圖6所示，出發(fā)菌株得率為4.43%，其中3株得率較出發(fā)菌株漲幅超過10%，其中170221-16#得率為504%，161125-47得率為501%，161021-13得率為4.98%。

將3株高產(chǎn)菌株甘油管保種于-80 ℃，再對其進(jìn)行搖瓶發(fā)酵驗(yàn)證。

將菌液接入種子培養(yǎng)基進(jìn)行活化，再用二級種子液進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。出發(fā)菌株可得然膠得率為4.75%，誘變菌株170221-16#得率最高為5.31%，比出發(fā)菌株得率提高1179%。以16#菌株為試驗(yàn)材料，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)。

誘變所得高產(chǎn)菌株16#在篩選平板中表現(xiàn)為顯色較早、顏色較深、形態(tài)較大的菌落。其菌落邊緣呈褶皺狀、不光滑，中間光滑突起，如圖7所示。

2.4誘變菌株16#發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

2.4.1碳源種類對發(fā)酵的影響。

設(shè)定碳源分別為蔗糖、乳糖、葡萄糖、麥芽糖，濃度皆為9%，其他成分為發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵96 h，發(fā)酵結(jié)果如圖8所示。蔗糖作為碳源時(shí)產(chǎn)膠量最高，達(dá)5.35%；其次為麥芽糖，發(fā)酵可得然膠得率為4.74%；葡萄糖和乳糖作為碳源時(shí)的產(chǎn)膠量最低。因此該試驗(yàn)選擇蔗糖作為發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源成分。

2.4.2有機(jī)氮源種類對發(fā)酵的影響。

設(shè)定有機(jī)氮源為玉米漿、酵母粉902、酵母粉802、蛋白胨350、蛋白胨321、蛋白胨326、蛋白胨410，濃度皆為0.4%，其他同基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基，搖瓶發(fā)酵96 h，發(fā)酵結(jié)果如圖9所示。玉米漿作為有機(jī)氮源可得然膠得率最高，達(dá)5.49%，且明顯高于其他有機(jī)氮源。因此該試驗(yàn)選擇玉米漿作為發(fā)酵培養(yǎng)基的有機(jī)氮源成分。

2.4.3磷酸鹽緩沖對配比對發(fā)酵的影響。

磷酸鹽緩沖對在調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH方面有著重要作用。土壤桿菌的最適產(chǎn)膠pH為5.5～5.6，菌體生長的適宜pH在7.0[13-14]。原基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中緩沖對為（NH4）2HPO4和KH2PO4，若是改變緩沖對濃度會同時(shí)改變培養(yǎng)基中的無機(jī)氮源濃度，故將（NH4）2HPO4替換為等濃度的NH4Cl和K2HPO4。然后改變KH2PO4和K2HPO4濃度，二者均為0.05%、0.1%、0.2%、05%、1.0%，搖瓶發(fā)酵96 h，發(fā)酵結(jié)果如圖10所示。0.2%的磷酸鹽濃度可得然膠得率最高，達(dá)到5.63%。因此該試驗(yàn)選擇0.2%為發(fā)酵培養(yǎng)基中磷酸鹽緩沖對的濃度。

2.4.4培養(yǎng)基成分正交試驗(yàn)分析。選取碳源、氮源、磷酸鹽緩沖對濃度為培養(yǎng)基的影響因素，以可得然膠得率為指標(biāo)，考察各因素對得率的影響。正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1，結(jié)果見表2。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，選取得率最高組和k值最高組再次進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，前者可得然膠得率為554%，后者得率為5.67%。因此，獲得最佳的培養(yǎng)基成分為11.0%蔗糖，0.3%玉米漿，0.2% KH2PO4，02%K2HPO4，0.2%NH4Cl，02%CaCO3，0.1% MgSO4·7H2O。和優(yōu)化前的培養(yǎng)基相比，可得然膠得率提高了6.78%。

3結(jié)論

以實(shí)驗(yàn)室保存土壤桿菌HS615為出發(fā)菌株進(jìn)行NTG誘變，根據(jù)致死率確定誘變劑量為0.5 mg/mL，誘變時(shí)間為30 min。對苯胺藍(lán)篩選培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，選擇出顯藍(lán)色最早且菌落形態(tài)較大的培養(yǎng)基酵母粉和葡萄糖濃度分別為0.2%和1.0%。以優(yōu)化后的苯胺藍(lán)培養(yǎng)基進(jìn)行NTG誘變和平板篩選，獲得產(chǎn)膠菌株，并對產(chǎn)膠菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵初篩和復(fù)篩，最終獲得1株性能穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株16#。進(jìn)一步對高產(chǎn)菌株進(jìn)行發(fā)酵的碳源、氮源種類以及磷酸緩沖對的配比進(jìn)行優(yōu)化，獲得最優(yōu)碳源為蔗糖，有機(jī)氮源為玉米漿，磷酸緩沖對最佳配比為0.2%。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn)，獲得最佳的培養(yǎng)基成分：11.0%蔗糖，0.3%玉米漿，0.2% KH2PO4，02%K2HPO4，02%NH4Cl，0.2%CaCO3，0.1% MgSO4·7H2O。

通過對正交試驗(yàn)結(jié)果分析可知，磷酸鹽緩沖對濃度對試驗(yàn)結(jié)果的影響最為顯著，是影響發(fā)酵得率的重要因素。在單因素試驗(yàn)中，磷酸鹽緩沖對濃度的優(yōu)化結(jié)果使得高產(chǎn)菌株得率提高了6.03%，相較于出發(fā)菌株得率提高18.53%。在發(fā)酵生產(chǎn)中提供一個(gè)適宜的緩沖體系來滿足可得然膠生產(chǎn)過程中菌體生長和產(chǎn)膠2個(gè)階段不同的pH要求，這為以后的放大培養(yǎng)優(yōu)化發(fā)酵過程，提高可得然膠的產(chǎn)量開辟了新的思路。

該試驗(yàn)通過對苯胺藍(lán)篩選培養(yǎng)基優(yōu)化，直接從篩選平板上挑出優(yōu)勢菌株，簡化了篩選方法。并且篩選到了1株高產(chǎn)菌株16#，比出發(fā)菌株可得然膠得率提高了11.79%，進(jìn)一步通過優(yōu)化培養(yǎng)基配方，可得然膠得率進(jìn)一步提高了6.78%，相較于最初得率提高了19.37%，達(dá)到了工業(yè)化水平。查閱文獻(xiàn)可知，近年來可得然膠搖瓶發(fā)酵得率處于4.5%左右[1，15-16]，有文獻(xiàn)表明經(jīng)過發(fā)酵優(yōu)化得率達(dá)到4.73%[17]。該試驗(yàn)所篩選出的高產(chǎn)菌株得率為5.67%，相較于文獻(xiàn)中菌株得率提高19.87%。這一試驗(yàn)結(jié)果為可得然膠的工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

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