六堡茶中金花菌的分離與鑒定

歐惠算　鄧旭銘　張靈枝　張均偉　馬士成　邱瑞瑾

摘要：【目的】研究鑒定六堡茶中的金花菌，為推動(dòng)六堡茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)?！痉椒ā坎捎闷桨逋坎挤叭c(diǎn)接種法從梧州中茶茶廠2015年11月生產(chǎn)的六堡茶中分離純化金花菌，以傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)觀察法觀察菌落特征，利用光學(xué)顯微鏡觀察菌絲、分生孢子等結(jié)構(gòu)特征，再結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)分離獲得的菌株進(jìn)行DNA序列分析，并通過(guò)ITS序列進(jìn)行同源性搜索比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析?！窘Y(jié)果】分離獲得一株金花菌，命名為L(zhǎng)B-1。LB-1菌株的形態(tài)特征與散囊菌屬很相似，主要表現(xiàn)為：菌落呈金黃色、有同心環(huán)、有放射性脊等，其ITS序列與阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami）的同源性達(dá)99%，進(jìn)一步確定LB-1菌株為阿姆斯特丹散囊菌。【結(jié)論】從六堡茶中分離獲得的金花菌LB-1為散囊菌屬中的阿姆斯特丹散囊菌。在六堡茶加工中，可為L(zhǎng)B-1菌提供適宜的環(huán)境，促進(jìn)其大量繁殖，以增強(qiáng)六堡茶的保健功效。

關(guān)鍵詞： 六堡茶；金花菌；阿姆斯特丹散囊菌；分離；鑒定

中圖分類號(hào)： S571.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：2095-1191（2017）04-0658-05

Abstract：【Objective】Jinhua fungus in Liupao tea was identified in order to provide theoretical basis for Liupao tea industry development. 【Method】Spread-plate method and three-point inoculation method were adopted to isolate and purify Jinhua fungus from Liupao tea produced by China Tea（Wuzhou） Factory in November， 2015. The colony characteristics were observed by traditional morphology observation method， and the structures like hypha and conidium were observed via optical microscope. Then DNA sequence analysis for strain isolated was conducted combining molecular biology method， and homology searching and comparison via ITS sequence and phylogenetic tree analysis were carried out. 【Result】One strain of Jinhua fungus was isolated and named LB-1. The morphological characteristics of LB-1were similar to those of Eurotium： golden colony， concentric rings， radioactive ridge， etc. The homology of its ITS sequence to Eurotium amstelodamiwas 99%. Therefore， LB-1 was identified as E. amstelodami. 【Conclusion】Jinhua fungus LB-1 is isolated from Liupao tea， and identified as E. amstelodami in Eurotium. During processing of Liupao tea， the producers can create suitable environment for LB-1 and promote the mass reproduction of LB-1， so as to enhance the health care effects of Liupao tea.

Key words： Liupao tea； Jinhua fungus； Eurotium amstelodami； isolation； identification

0 引言

【研究意義】六堡茶因原產(chǎn)于廣西梧州市蒼梧縣六堡鄉(xiāng)而得名，屬于黑茶類，為后發(fā)酵茶。六堡茶特殊的加工工藝：殺青—初揉—堆悶—復(fù)揉—干燥—篩選—拼配—渥堆—初蒸焗堆—復(fù)蒸—涼置—陳化（DB45/T 479-2014），使其具有獨(dú)特的品質(zhì)特征：干茶色澤黑褐光潤(rùn)，湯色紅濃似琥珀，滋味醇和甘爽，潤(rùn)滑可口，有檳榔味，葉底紅褐色，耐沖泡，以“紅、濃、陳、醇”四絕著稱，耐于久藏，越陳越好（何志強(qiáng)，2007）。近年來(lái)，以普洱茶為代表的黑茶類在市場(chǎng)上掀起了熱潮，黑茶中微生物鑒定也成為海內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，出現(xiàn)了大量關(guān)于茯磚茶中金花菌的研究報(bào)道，如陳椽（1984）提出，金花菌能夠分泌淀粉酶催化茶葉中的淀粉轉(zhuǎn)化為單糖，還可分泌氧化酶催化多酚類化合物氧化，從而消除茶葉枝梗的粗老氣味，使茶湯呈紅棕色，滋味也更加醇厚并帶有甜味；楊撫林（2005）在體外模擬胃液的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)金花菌發(fā)酵液對(duì)胃蛋白酶活性有促進(jìn)作用，但對(duì)脂肪酶活性有抑制作用；鄧放明等（2007）研究發(fā)現(xiàn)黑茶中的金花菌具有降脂、減肥、促進(jìn)消化、改善人體腸道的功效，其發(fā)酵產(chǎn)物胞外多糖還具有抑制腫瘤的功效。人們通常根據(jù)金花菌的質(zhì)量和數(shù)量來(lái)判斷茯磚茶品質(zhì)的好壞，因此，研究六堡茶金花菌，對(duì)改善六堡茶的加工工藝、促進(jìn)六堡茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】黑茶中的微生物種類繁多且對(duì)茶葉的影響較大。近年來(lái)，關(guān)于金花菌的鑒定研究較多并已取得較大進(jìn)展。黃浩等（2010）從湖南益陽(yáng)茶廠2008年生產(chǎn)的金湘益磚茶中分離純化得到一株金花菌，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌株形態(tài)、在掃描電鏡下觀察菌株的子囊孢子（有性階段）和分子孢子（無(wú)性階段），同時(shí)結(jié)合DNA測(cè)序，在分子水平上對(duì)分離菌株進(jìn)行鑒定，確定該菌株為冠突散囊菌。彭曉赟等（2011）對(duì)湖南地區(qū)茯磚茶上金花菌的菌落特征和形態(tài)特征進(jìn)行了研究，并運(yùn)用掃描電鏡觀察了其子囊孢子和分生孢子的發(fā)育過(guò)程，鑒定其為冠突散囊菌（Eurotium cristatum）。宋偉（2011）從黑磚茶中分離純化獲得5種真菌，經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)觀察及分子鑒定確定5種真菌分別為：塔賓曲霉、阿姆斯特丹散囊菌、斑點(diǎn)青霉、冠突散囊菌和泡盛曲霉，其中的阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）和冠突散囊菌屬于金花菌。徐書澤（2014）利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)梧州茶廠4個(gè)成品六堡茶中的真菌多樣性和菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，通過(guò)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)合真菌分子鑒定技術(shù)從中分離鑒定得到5個(gè)屬18個(gè)種的微生物，其中的散囊菌屬為阿姆斯特丹散囊菌。胡謝馨等（2016）從茯磚茶中分離出一株優(yōu)勢(shì)菌株LS1，經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察及ITS-5.8S rDNA序列分析，鑒定為冠突散囊菌。【本研究切入點(diǎn)】前人對(duì)黑茶類金花菌的研究主要集中在普洱茶和茯磚茶上，對(duì)廣西六堡茶金花菌的研究報(bào)道較少。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用平板涂布法從梧州中茶茶廠2015年產(chǎn)的六堡茶中分離金花菌，采用三點(diǎn)接種法對(duì)分離獲得的金花菌進(jìn)行培養(yǎng)，探索適宜其生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，通過(guò)運(yùn)用光學(xué)顯微鏡觀察菌落形態(tài)、參照真菌鑒定手冊(cè)及結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)進(jìn)行DNA測(cè)序，從分子水平上對(duì)六堡茶金花菌進(jìn)行鑒定，為揭示六堡茶的安全性、提高六堡茶的品質(zhì)及促進(jìn)六堡茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試茶樣：2015年11月剛壓好的六堡茶（梧州中茶茶廠提供）。培養(yǎng)基：分離純化培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）、鑒定培養(yǎng)基（察氏瓊脂培養(yǎng)基、20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基）。

1. 2 六堡茶金花菌分離與純化

分離：稱量10 g茶樣于250 mL三角瓶中（含玻璃珠），加入90 mL無(wú)菌蒸餾水，于振蕩器中振蕩15 min，即制成10-1倍的稀釋菌懸液；在超凈工作臺(tái)上吸取1 mL的10-1菌懸液加入到裝有9 mL無(wú)菌蒸餾水的試管中，得到10-2的稀釋菌懸液，以此類推，依次稀釋至10-7。分別取1 mL各稀釋濃度的菌懸液在PDA培養(yǎng)基上，用無(wú)菌三角玻璃棒劃“十”和“（）”的手法均勻涂布，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)，于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28 ℃倒置培養(yǎng)7 d。

純化：用針挑取少許金黃色菌絲，用劃線法在PDA和察氏培養(yǎng)基上進(jìn)行多次分離培養(yǎng)，直至菌落的形態(tài)相同，將得到的金花用試管斜面培養(yǎng)基培養(yǎng)后保存于4 ℃冰箱中。

1. 3 金花菌形態(tài)學(xué)觀察

將4 ℃保存的菌種取出，于28 ℃下活化培養(yǎng)24 h，用三點(diǎn)接種法分別將菌株接種于察氏瓊脂培養(yǎng)基和20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，每天觀察、記錄菌落的生長(zhǎng)情況。

采用插片法，將滅菌的蓋玻片呈45～50°角插入20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基，待菌絲擴(kuò)展至蓋玻片，取出將其放在載玻片上（粘有菌絲的一面朝上），在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1. 4 金花菌分子鑒定

菌株DNA提?。河脛澗€法培養(yǎng)菌株6 d后，用已滅菌小鐵鏟將菌絲刮下置于已滅菌的研缽中，加入液氮迅速將菌絲研磨成粉末，按照真菌基因組DNA快速抽提試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。

PCR擴(kuò)增引物：ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAG

GAAGTAA-3'）；ITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATG

C-3'）。PCR反應(yīng)體系25.0 μL：DNA模板1.5 μL，ExTaq酶（TaKaRa公司）12.5 μL，IFS1F引物0.5 μL，IFS4引物0.5 μL，加無(wú)菌水至25.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，成像系統(tǒng)拍照。將PCR純化產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將得到的序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中使用BLASTn進(jìn)行同源序列比對(duì)，通過(guò)MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。選用鄰位相連法（Neighbor-joining）構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，用自展檢驗(yàn)（Bootstrap）方法進(jìn)行驗(yàn)證，隨機(jī)搜索設(shè)置為1000。

2 結(jié)果與分析

2. 1 金花菌的形態(tài)學(xué)特征

從六堡茶中分離純化得到一株金花菌，命名為L(zhǎng)B-1。采用三點(diǎn)法分別將LB-1菌株接種到察氏瓊脂培養(yǎng)基和20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示，菌落在察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，但在20%蔗糖察氏瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，其生長(zhǎng)速度為75 mm/14 d。菌落為絨狀，中間微隆起，整體呈金黃色，有同心環(huán)紋路，中間部位較邊沿更黃，黃色閉囊殼豐富，成熟后為黃褐色，菌落中心部位有長(zhǎng)放射性脊，菌絲有隔，呈不對(duì)稱分枝，培養(yǎng)5 d左右其上分布暗灰綠色的分生孢子頭，分生孢子梗莖較長(zhǎng)，分生孢子串生，為球形或近球形，大小為4.5～4.9 μm，表面粗糙，培養(yǎng)7 d左右，有大量成熟的分生孢子脫落在菌絲周圍（圖1、圖2）；菌落背面呈棕褐色，老后顏色變深，無(wú)脊光滑（圖1-b）。根據(jù)對(duì)金花菌菌落及光鏡的觀察結(jié)果，結(jié)合中國(guó)真菌志（齊祖同，1997），初步將LB-1菌株鑒定為散囊菌屬。

2. 2 金花菌的分子生物學(xué)鑒定

將PCR擴(kuò)增測(cè)序得到的ITS序列（圖3）在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中使用BLASTn進(jìn)行同源性搜索比對(duì)，結(jié)果（表1）發(fā)現(xiàn)，在比對(duì)列表中居前十幾位相似度在97%以上的可培養(yǎng)菌株均為阿姆斯特丹散囊菌（Eurotium amstelodami），比對(duì)相似性均達(dá)99%，如將序列相似性在97%以上的基因克隆子定義為同一種物質(zhì)，則分離的金花菌為阿姆斯特丹散囊菌。再進(jìn)一步應(yīng)用MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果（圖4）顯示，分離出的LB-1菌株與阿姆斯特丹散囊菌連在同一分支上，因此進(jìn)一步確定LB-1菌株為阿姆斯特丹散囊菌。

3 討論

金花菌是茯磚茶的代表，人們常以金花菌的多少來(lái)衡量茯磚茶品質(zhì)的好壞。黃浩等（2010）根據(jù)茯磚茶中金花菌株的表觀形態(tài)、光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡特征和DNA序列分析，確認(rèn)茯磚茶中的金花菌為冠突散囊菌（E. cristatum）。而胡治遠(yuǎn)等（2011）通過(guò)分離比較不同茯磚茶中的優(yōu)勢(shì)菌，得到15株散囊菌屬、8株冠突散囊菌、2株肋狀散囊菌、3株謝瓦散囊菌、1株蠟葉散囊菌和1株阿姆斯特丹散囊菌，說(shuō)明茯磚茶中的金花菌具有多樣性。六堡茶經(jīng)過(guò)渥堆和陳化，形成了獨(dú)特的品質(zhì)特征，具有檳榔香味，并以金花普遍茂盛品質(zhì)為佳。本研究在六堡茶中分離得到的金花菌經(jīng)鑒定為阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）。毛彥等（2013）在梧州六堡茶中也分離得到一株金花菌，通過(guò)群體形態(tài)和個(gè)體形態(tài)研究，參照真菌分類鑒定手冊(cè)和序列同源性搜索比對(duì)，鑒定出六堡茶的金花菌為雪黃散囊菌；而陳然等（2016）選取多家梧州六堡茶龍頭企業(yè)生產(chǎn)的六堡茶產(chǎn)品進(jìn)行真菌分析，結(jié)果得出不同廠家六堡茶產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)菌種包括冠突散囊菌和謝瓦氏散囊菌等散囊菌屬真菌。以上兩個(gè)研究與本研究鑒定結(jié)果不一致，可能是由于試驗(yàn)茶樣來(lái)自不同茶廠，在加工時(shí)漚堆的時(shí)間和溫度不同，導(dǎo)致成品茶中的金花菌種不同?？梢?jiàn)，六堡茶中的金花菌也具有多樣性。

散囊菌屬是黑茶中的一類重要真菌，其對(duì)黑茶的品質(zhì)口感、保健功效均有舉足輕重的作用。劉作易和秦京（1991）的研究結(jié)果表明，冠突散囊菌絲體富含15種氨基酸，其中包括所有的必需氨基酸。此外，有多篇文獻(xiàn)報(bào)道冠突散囊菌的抗氧化活性、抑菌效果及其對(duì)消化酶活性的影響等研究（楊撫林，2005；黃群等，2007a，2007b；李瑩，2014；葛永怡等，2015）。本課題組下一步將對(duì)分離鑒定出的阿姆斯特丹散囊菌進(jìn)行更深入研究，探究其對(duì)六堡茶品質(zhì)的影響，以及六堡茶抗氧化、促消化和降血脂等效果的作用機(jī)理，以期為六堡茶的生產(chǎn)加工、利用和發(fā)展打下一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本研究在新生產(chǎn)的六堡茶中分離純化得到一株金花菌（LB-1菌株），運(yùn)用光學(xué)顯微鏡觀察菌落的形態(tài)、參照真菌鑒定手冊(cè)并結(jié)合現(xiàn)代分子生物學(xué)進(jìn)行DNA測(cè)序，通過(guò)ITS序列進(jìn)行同源性搜索比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)分析，確認(rèn)LB-1菌株為阿姆斯特丹散囊菌（E. amstelodami）。在六堡茶加工中，可為L(zhǎng)B-1菌提供適宜的環(huán)境，促進(jìn)其大量繁殖，以增強(qiáng)六堡茶的保健功效。

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（責(zé)任編輯 麻小燕）