五指毛桃抗炎活性成分的分離及鑒定

呂鎮(zhèn)城　陳康　彭永宏

摘 要 以對5-LOX的抑制活性為抗炎活性評價(jià)指標(biāo)，在活性跟蹤下從五指毛桃中分離到6個(gè)化合物，經(jīng)波譜數(shù)據(jù)分析后被鑒定為：羽扇豆醇棕櫚酸酯（1）、β-香樹脂醇乙酸酯（2）、補(bǔ)骨脂素（3）、芹菜素（4）、壬二酸（5）和胡蘿卜苷（6），其中，化合物5、1對5-LOX表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制活性，半數(shù)抑制濃度（IC50）分別為13.74 μg/mL和13.96 μg/mL；化合物1為首次從五指毛桃中分離得到。本研究結(jié)果可為五指毛桃的抗炎作用研究及其臨床應(yīng)用提供理論參考。

關(guān)鍵詞 五指毛桃；抗炎活性；5-LOX 抑制活性；化學(xué)成分；結(jié)構(gòu)鑒定

中圖分類號(hào) R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract To investigate the anti-inflammatory activity of the roots of Ficus hirta Vahl. 5-lipoxygenase（5-LOX）inhibitory activity was selected as the evaluation index. Six compounds were separated from this material by 5-lipoxygenase inhibitory activity-guided isolation. Their structures were identified as lupeol palmitate（1）， β-amyrin acetate（2）， psoralen（3）， apigenin（4）， azelaic acid（5）， daucosterol（6）on the basis of NMR spectroscopic analyses. Compound 5 and 1 exhibited strong in vitro inhibitory activity on 5-LOX with IC50 values 13.74 μg/mL and 13.96 μg/mL， respectively. Compound 1 was reported for the first time from F. hirta roots. The results may provide theoretical supports for the anti-inflammatory effect and clinical application of F. hirta roots.

Key words Ficus hirta Vahl. roots； anti-inflammatory activity； 5-LOX inhibitory activity； chemical constituents； structure identification

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.06.024

五指毛桃（Ficus hirta Vahl.）別名五爪龍，是?？疲∕oraceae）植物粗葉榕的干燥根，為嶺南習(xí)用草藥。據(jù)中醫(yī)典籍記載，五指毛桃性平，味甘、辛，有健脾補(bǔ)肺、利濕舒筋之功[1]。作為中醫(yī)常用中藥，五指毛桃臨床上被用于脾虛浮腫、肺癆咳嗽、盜汗、慢性盆腔炎等癥，在民間特別是嶺南地區(qū)也被廣泛用于保健養(yǎng)生，其藥食兩用歷史悠久[2-3]。

目前，人們已經(jīng)從五指毛桃中分離鑒定出多種化合物，如香豆素、黃酮、烯萜、甾醇和皂苷等[4-6]。筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，五指毛桃具有良好的抗腫瘤作用[7]。此外，筆者還發(fā)現(xiàn)五指毛桃具有良好的5-脂氧合酶（5-lipoxygenase，5-LOX）抑制活性。5-LOX是生物體內(nèi)一種重要的雙加氧酶，是催化花生四烯酸生成白三烯類（leukotrienes，LTs）的關(guān)鍵酶，LTs是重要的炎癥介質(zhì)，在許多疾病中扮演著重要的角色[8]。近年來，許多學(xué)者致力于以5-LOX為靶標(biāo)來開發(fā)5-LOX抑制劑，從而為抗炎藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。但是，五指毛桃的抗炎活性成分至今尚未明確。因此，本研究以5-LOX抑制活性為指標(biāo)，在活性跟蹤下對五指毛桃抗炎活性物質(zhì)的化學(xué)成分進(jìn)行分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定，以明確其抗炎活性成分，為深入研究五指毛桃的抗炎作用機(jī)理及其在臨床上的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 五指毛桃由廣東省河源五指毛桃GAP生產(chǎn)基地提供，經(jīng)華南師范大學(xué)彭永宏教授鑒定后可知其為?？浦参锎秩~榕的干燥根，憑證標(biāo)本（編號(hào)15023）保存于華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院。

薄層色譜硅膠及柱色譜硅膠（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（GE Healthcar公司）；5-LOX和去甲二氫愈創(chuàng)木酸（NDGA）（Cayman 公司）；其它試劑為分析純。

1.1.2 儀器設(shè)備 Bruker DRX-600型超導(dǎo)核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；RY-1G熔點(diǎn)儀（天津市新天光分析儀器技術(shù)有限公司）；RV10旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國IKA公司）；UV-2450紫外可見分光光度計(jì) （日本島津公司）。

1.2 方法

1.2.1 提取與分離 取10 kg五指毛桃，用95%乙醇提取3次，每次7 d，經(jīng)減壓濃縮得提取物浸膏；用水將浸膏分散后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，分別得到石油醚部浸膏224 g，乙酸乙酯部浸膏171 g，水部浸膏445 g。由于乙酸乙酯部的5-LOX抑制活性最好，因此，選擇乙酸乙酯部進(jìn)行分離純化。乙酸乙酯部171 g經(jīng)硅膠柱以石油醚 ∶ 乙酸乙酯（V ∶ V=5 ∶ 1～1 ∶ 10）梯度洗脫，收集到20個(gè)餾分Fr1～Fr20，并選擇活性強(qiáng)的Fr4、Fr5、Fr8和Fr17 4個(gè)餾分作進(jìn)一步的分離純化。Fr4餾分先后以石油醚-氯仿（V ∶ V=7 ∶ 3）經(jīng)硅膠柱反復(fù)層析后得化合物1（0.29 g），經(jīng)Sephadex LH-20柱層析得化合物2（0.048 g），以石油醚-氯仿-乙酸乙酯（V ∶ V ∶ V=5 ∶ 3 ∶ 1）經(jīng)硅膠柱反復(fù)層析后得化合物3（4.63 g）。Fr5餾分以石油醚-氯仿-甲醇（V ∶ V ∶ V=6 ∶ 10 ∶ 1）經(jīng)硅膠柱反復(fù)層析后得化合物4（0.43 g）。Fr8餾分以氯仿-乙酸乙酯（V ∶ V ∶ =7 ∶ 5）經(jīng)硅膠柱反復(fù)層析后，上Sephadex LH-20柱層析，得化合物5（0.28 g）。Fr17餾分以石油醚-氯仿-甲醇（V ∶ V ∶ V=3 ∶ 10 ∶ 1）經(jīng)硅膠柱反復(fù)層析后得化合物6（0.27 g）。

1.2.2 5-LOX抑制活性測定 5-LOX抑制活性測定參考Gaffney[9]的方法，NDGA為陽性對照，抑制率按下列公式計(jì)算：

抑制率/%=[（A0-A1）/A0]×100，其中A0和A1分別表示空白組和處理組。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

在活性跟蹤下，對五指毛桃活性成分進(jìn)行分離純化，從中得到6個(gè)化合物，并結(jié)合光譜分析法鑒定其結(jié)構(gòu)（圖1）。

化合物1：白色粉末， m.p. 54～56 ℃， 分子式為C46H80O2。1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 0.77 （3H， s， H-24）， 0.83（3H， s， H-28）， 0.86 （3H， s， H-25）， 0.92（3H， s， H-27）， 1.01（3H， s， H-26）， 1.24（3H， s）， 1.67（3H， s， H-30）， 2.27 （lH， d， H-19）， 4.46 （lH， dd， H-3）， 4.56（lH， br d， J=6 Hz， H-29a）， 4.67（lH， br d， J=6 Hz， H-29b）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC： 80.6（C-1）， 23.7（C-2）， 38.3（C-3）， 37.8（C-4）23.7（C-5）， 23.7（C-6）， 55.4（C-7）， 16.7（C-8）， 34.8（C-9）， 40.8（C-10）， 18.2（C-11）， 42.8（C-12）， 14.5（C-13）， 27.4（C-14）， 35.5（C-15）， 43.0（C-16）， 18.0（C-17）， 40.0（C-18）， 29.8（C-19）， 48.0（C-20）， 150.9（C-21）， 109.3（C-22）， 20.9（C-23）， 48.3（C-24）， 37.8（C-25）， 25.2（C-26）， 22.6（C-27）， 50.3（C-28）， 37.1（C-29）， 16.2（C-30）， 22.7（C-31）， 31.9（C-32）， 29.3（C-33）， 29.6（C-34）， 29.6（C-35）， 29.6（C-36）， 29.7（C-37）， 29.7（C-38）， 29.7（C-39）， 29.8（C-40）， 29.2（C-41）， 29.2（C-42）， 25.1（C-43）， 34.2（C-44）， 173.7（C-45）， 14.1（C-46）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1為羽扇豆醇棕櫚酸酯，該化合物為首次從五指毛桃中分離得到。

化合物2：白色粉末，m.p. 238～240 ℃，分子式C32H52O2。 1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 0.79（3H， s）， 0.87（3H×2， d）， 0.92（3H， s）， 0.97（3H， d）， 1.00（3H， s）， 1.06（3H， s）， 2.05（3H， s， -OCOCH3）， 4.50（1H， m， H-3）， 5.18（1H， t， H-12）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC： 38.4（C-1）， 23.2（C-2）， 80.9（C-3）， 37.7（C-4）， 55.2（C-5）， 18.2（C-6）， 32.8（C-7）， 40.0（C-8）， 46.7（C-9）， 36.7（C-10）， 23.6（C-11）， 124.3（C-12）， 139.6（C-13）， 42.0（C-14）， 28.7（C-15）， 26.1（C-16）， 33.7（C-17）， 59.0（C-18）， 39.6（C-19）， 39.6（C-20）， 31.2（C-21）， 41.5（C-22）， 28.0（C-23）， 16.8（C-24）， 15.5（C-25）， 16.8（C-26）， 23.3（C-27）， 28.7（C-28）， 17.5（C-29）， 21.4（C-30）， 21.3（C-31）， 171.0（C-32）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物2為β-香樹脂醇乙酸酯。

化合物3：白色固體，m.p. 161～163 ℃，分子式C11H6O3。1H-NMR（400MHz， CDCl3）δH： 6.31（1H，d， J=10.1Hz， H-4）， 6.79（1H， d， J=2.2Hz， H-9）， 7.39（1H， s， H-13）， 7.63（1H， s， H-10）， 7.70（1H， d， J=2.2Hz， H-7）， 7.77（1H， d， J=9.6Hz， H-5）. 13C-NMR（100MHz， CDCl3）δC：161.0（C-1）， 114.5（C-2）， 144.1（C-3）， 119.8（C-45）， 124.8（C-5）， 156.3（C-6）， 99.7（C-7）， 151.9（C-8）， 115.3（C-9）， 106.4（C-10）， 146.9（C-11）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報(bào)道基本一致， 故鑒定化合物3為補(bǔ)骨脂素。

化合物4：黃色粉末，m.p. > 300 ℃，分子式C15H10O5。1H-NMR（400MHz， DMSO-d6）δH： 12.97（1H，s， 5-OH）， 10.82（1H， brs， OH）， 10.37（1H， brs， OH）， 6.80（1H， s， H-3）， 6.19（1H， J=2.1Hz， H-6）， 6.48（1H， d， J=2.1Hz， H-8）， 7.93（2H， d， J=8.7Hz， H-2， 6）， 6.93（2H， d， J=8.7Hz， H-3， 5）. 13C-NMR（100MHz， DMSO-d6）δC： 164.1（C-1）， 103.2 （C-2）， 182.2（C-3）， 161.8（C-4）， 99.2（C-5）， 164.5（C-6）， 94.4（C-7）， 157.7（C-8）， 104.1（C-9）， 121.6（C-1′）， 128.9（C-2′）， 116.4（C-3′）， 161.6（C-4′）， 116.4（C-5′）， 128.9（C-6′）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物4為芹菜素。

化合物5：白色粉末，m.p. 101～102 ℃，分子式C9H16O4。1H-NMR（400MHz， CD3OD）δH： 2.24-2.27（4H， t， J=7.2Hz， H-2， 8）， 1.54-1.59（4H， M， H-3， 7）， 1.37-1.53（6H， m， H-4， 5， 6）. 13C-NMR（100MHz， CD3OD）δC： 176.3（C-1， 9）， 33.6（C-2， 8）， 24.6（C-3， 7）， 28.6（C-4， 5， 6）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物5為壬二酸。

化合物6：白色粉末，m.p. 289～290 ℃，分子式C35H60O6。1H-NMR（400MHz， DMSO-d6）δH： 0.88-0.94（9H， m， 3×CH3）， 0.96（3H， s， 26-H）， 0.99（3H， d， 21-H）， 1.12（s， CH3-19）， 1.45（s， CH3-20）， 1.77（s， CH3-18）， 2.48（m， H-4）， 2.88（m， H-4）， 3.11（m， glc-2）， 3.33（m， glc-5）， 3.36-3.38（m， glc-3， glc-4）， 3.40（m， H-3）， 3.45（dd， J=11， 4.4Hz， glc-6a）， 3.62（dd， J=11， 3.3Hz， glc-6b）， 4.43（d， J=7.3Hz， glc-1）， 5.31（brd， J=4.5Hz， H-6）. 13C-NMR（100MHz， DMSO-d6）δC： 36.64（C-1）， 29.69（C-2）， 77.28（C-3）， 39.50（C-4）， 140.84（C-5）， 121.89（C-6）， 31.84（C-7）， 31.80（C-8）， 50.01（C-9）， 39.2（C-10）， 20.16（C-11）， 39.29 （C-12）， 42.27（C-13）， 56.59（C-14）， 24.49（C-15）， 29.69（C-16）， 55.83（C-17）， 11.95（C-18）， 19.54（C-19）， 39.92（C-20）， 19.19（C-21）， 34.20 （C-22）， 26.39（C-23）， 45.54（C-24）， 29.09（C-25）， 18.99（C-26）， 19.95（C-27）， 20.16（C-28）， 12.14（C-29）， 101.75（C-1′）， 77.28（C-2′）， 77.18 （C-3′）， 70.49（C-4′）， 73.88（C-5′）， 61.83（C-6′）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]報(bào)道基本一致，故鑒定化合物6為胡蘿卜苷。

2.2 對5-LOX的抑制活性測定結(jié)果

不同極性浸膏對5-LOX的抑制活性（圖2）顯示，乙酸乙酯部的活性最好，IC50值為34.28 μg/mL。以NDGA為陽性對照，測定6個(gè)化合物對5-LOX的IC50值（表1），結(jié)果顯示化合物1和5表現(xiàn)出良好的抑制活性，IC50值分別為13.96和13.74 μg/mL?；衔?次之，IC50值為28.11 μg/mL?；衔?、4、6的活性相對較弱，IC50值分別為49.97、44.41和35.56 μg/mL。

3 討論

在5-LOX抑制活性的跟蹤下，對五指毛桃抗炎活性成分進(jìn)行分離純化，從中得到6個(gè)化合物，并運(yùn)用光譜法鑒定其結(jié)構(gòu)?；衔?（羽扇豆醇棕櫚酸酯）和化合物5（壬二酸）表現(xiàn)出良好的活性，其中化合物1為首次從五指毛桃中分離得到。壬二酸在臨床上常用于治療痤瘡，其作用機(jī)制是通過清除皮孔上的細(xì)菌而實(shí)現(xiàn)[16-17]。此外，壬二酸還能降低被認(rèn)為是促進(jìn)痤瘡細(xì)菌生長的角質(zhì)蛋白的累積[17]。羽扇豆醇棕櫚酸酯是羽扇豆醇的衍生物，后者是被認(rèn)為具有抗炎及抗癌作用的烯萜類化合物[18]。研究指出，羽扇豆醇棕櫚酸酯對胰蛋白酶具有抑制活性，是胰蛋白酶的非競爭性抑制劑[19-20]。此外，羽扇豆醇棕櫚酸酯還能夠通過顯著降低乳酸脫氫酶的釋放來改善關(guān)節(jié)炎癥狀[21]。

綜上，以對5-LOX的抑制活性為指標(biāo)，考察五指毛桃的抗炎活性成分，從中分離得到6個(gè)化合物，其中壬二酸和羽扇豆醇棕櫚酸酯對5-LOX表現(xiàn)出強(qiáng)的抑制活性，羽扇豆醇棕櫚酸酯為首次從該植物中分離得到，并首次報(bào)道這2個(gè)化合物對5-LOX具有抑制活性，可為深入研究五指毛桃的抗炎作用機(jī)理及其臨床應(yīng)用提供理論參考。

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