HS—SPME—GC—MS聯(lián)用技術(shù)分析南高叢藍(lán)莓濁汁酶解前后揮發(fā)性成分

關(guān)小鶯 溫靖 徐玉娟 肖更生 吳繼軍 余元善 鄒波

摘 要 采用頂空固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME/GC-MS）分析藍(lán)莓濁汁酶解前后的各種香氣成分及相對百分含量。結(jié)果表明：共鑒定出57種香氣成分，藍(lán)莓原濁汁中檢出36種，酶解汁中檢出52種。經(jīng)酶解處理后，香氣成分總量增加了28.34%，23種成分的相對含量有所增加，其含量較高的有正己醛、壬醛和松油醇，并釋放出16種新的潛在香氣物質(zhì)，其含量較高的有正己醇、苯甲酸甲酯和苯甲酸乙酯；而酯類物質(zhì)相對含量有所減少。

關(guān)鍵詞 藍(lán)莓；酶解；頂空固相微萃取；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；香氣成分

中圖分類號 S571.1 文獻標(biāo)識碼 A

Analysis of Aroma Components of Southern High-Bush Blueberry

Juice Before and After Enzymatic Hydrolysis

Using HS-SPME-GC-MS

GUAN Xiaoying1，2， WEN Jing2， XU Yujuan2， XIAO Gengsheng2 *，

WU Jijun2， YU Yuanshan2， ZOU Bo2

1 College of Food Science， South China Agricultural University， Guangzhou， Guangdong 510462， China

2 Sericultural & Agri-Food Research Institute， GAAS/ Key Laboratory of Functional Foods， Ministry of Agriculture /

Guangdong Key Laboratory of Agricultural Products Processing， Guangzhou， Guangdong 510610， China

Abstract The aroma components and relative percentages of blueberry juice and enzymatic juice were analyzed by headspace-solid-phase microextraction combined with gas chromatography-mass spectrometry（HS-SPME / GC-MS）. The results showed that 57 aroma components were identified， 36 were found in blueberry juice， and 52 were detected in enzymatic juice. After the enzymatic treatment， the total aroma components increased by 28.34%， the relative content of 23 components increased and the most abundant three were n-hexanal， nonylaldehyde， and terpineol. Sixteen new potential aroma substances were released and the most abundant three were n-hexanol， methyl benzoate and ethyl benzoate. The relative content of esters decreased. It would provide an experimental basis for the enzymatic hydrolysis of blueberry juice and have a certain reference value for the processing and development of blueberry food.

Key words Blueberry； enzymatic hydrolysis； headspace-solid-phase microextraction； gas chromatography-mass spectrometry； aroma components

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.09.028

藍(lán)莓（Vaccinium spp.）原產(chǎn)于北美和歐洲，其果酸甜可口，風(fēng)味濃郁，可加工成果汁飲料、果醋、果酒、果醬等產(chǎn)品，已被廣泛用于食品工業(yè)。藍(lán)莓營養(yǎng)豐富，藥用價值高，富含VA、VE、SOD、花青素、熊果甙、礦物元素及膳食纖維等，已被國際糧農(nóng)組織列為人類五大健康食品之一[1]。藍(lán)莓具有較強抗氧化性，可以防止腦神經(jīng)老化、增強記憶力、增強心血管功能、提高機體免疫力、促進視紅素再合成和改善肥胖癥等[2-5]，其主要功能成分為花青素、黃酮醇、酚類和多糖物質(zhì)[6-7]，是一種具有極高經(jīng)濟價值的新興世界性小漿果。

目前關(guān)于藍(lán)莓汁的研究主要集中在果汁的脫澀、護色、澄清、濃縮和功能作用等[8]方面，但對于藍(lán)莓汁酶解前后香氣成分的研究較少。藍(lán)莓富含果膠，直接破碎取汁較為困難，本實驗通過加入果膠酶和纖維素酶對果汁進行酶解處理，其中果膠酶可催化果膠中的甲酯水解，并將多聚半乳糖醛酸分解成較小分子多聚物；纖維素酶可將纖維素中的β-1，4-葡萄糖苷鍵水解，生成可溶性的聚合物、β糊精、寡糖、二糖和D-葡萄糖等[9-10]。果膠酶和纖維素酶同時作用，不僅能夠降解植物細(xì)胞壁，提高出汁率，而且能提高風(fēng)味和香氣強度[11-12]。

前人利用GC-MS技術(shù)來探討酶解增香理論，孫愛東等[13]利用不同來源的增香酶酶解橙汁，研究表明橙汁經(jīng)過酶解工藝后能產(chǎn)生一些鍵合態(tài)組分，如己醇、橙花醛等物質(zhì)，證實該酶可以釋放橙汁潛在香味物質(zhì)。張振華等[14]研究發(fā)現(xiàn)采用糖苷酶酶解葡萄汁具有明顯的增香效果，表明酶解能夠促進鍵合態(tài)芳香物質(zhì)的水解，增加葡萄汁芳香程度。張瑤等[15]研究了檸檬汁酶解前后的香氣變化，發(fā)現(xiàn)酶解后香氣成分總量及種類均有所增加，酶解處理可保留原汁香氣，并能釋放新的潛在香氣。Gueguen等[16]研究發(fā)現(xiàn)β-葡萄糖苷酶酶解可以提高桃、櫻桃、草莓、蘋果和木瓜果汁中的芳樟醇、芐醇和2-苯乙醇的含量。

本實驗通過頂空固相微萃取-氣相質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（HS-SPME/GC-MS）分析中國廣東河源南高叢品種的藍(lán)莓濁汁酶解前后的揮發(fā)性成分，旨在評價酶解對藍(lán)莓果汁品質(zhì)的改善，為藍(lán)莓汁加工技術(shù)的改進和新技術(shù)的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，同時為進一步有效利用藍(lán)莓資源、開發(fā)藍(lán)莓的相關(guān)產(chǎn)品提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料與試劑 藍(lán)莓產(chǎn)自廣東省河源市船塘鎮(zhèn)河源茂青農(nóng)業(yè)公司藍(lán)莓基地，采后產(chǎn)品儲存于-18 ℃。果膠酶購自上海源葉生物科技有限公司，酶活力1 000 U/mg。纖維素酶購自上海源葉生物科技有限公司，酶活力50 U/mg。

1.1.2 儀器與設(shè)備 Philips榨汁機，Philips公司；水果榨汁機WF-A2000，浙江天歌電器有限公司；手動SPME進樣器，美國Supelco公司；氣質(zhì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent 6890N/5975B），美國Agilent公司；DVB/CAR/PDMS（Gray/plain Hub）固相微萃取纖維頭，美國Supelco公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理 藍(lán)莓原濁汁：藍(lán)莓經(jīng)破碎后用濾布進行擠壓過濾，獲得原濁汁，待用。

藍(lán)莓酶解汁：藍(lán)莓經(jīng)破碎后，按照本實驗室優(yōu)化的藍(lán)莓濁汁工藝進行，即果膠酶添加量0.12%，纖維素酶添加量1.54%，攪拌均勻，在43 ℃下酶解83 min，酶解結(jié)束后在100 ℃下滅酶2 min，然后用濾布進行擠壓過濾，獲得酶解汁，待用。

1.2.2 頂空固相微萃取揮發(fā)性成分提取條件 將100 μm聚二甲基硅氧烷（PDMS）萃取頭插入GC/MS進樣口中，于280 ℃老化1 h。在萃取前取5 mL藍(lán)莓汁放置在15 mL密封頂空樣品瓶中，密封，在磁力攪拌器以20 r/min、50 ℃的條件下平衡20 min；插入萃取頭，于50 ℃下頂空萃取 30 min。將萃取頭迅速插入GC/MS進樣口，于270 ℃解析5 min，啟動儀器采集數(shù)據(jù)。試驗設(shè)3個重復(fù)。

1.2.3 氣相色譜-質(zhì)譜檢測條件 氣相色譜條件：色譜柱為DB-5MS彈性毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；升溫程序為初始溫度35 ℃，保持6 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持2 min；以10 ℃/min 升至250，保持3 min；汽化溫度280 ℃；載氣（He）流量1 mL/min。

質(zhì)譜條件：電離方式為電子轟擊（EI）離子源，電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；接口溫度280 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z 30～450。

1.3 數(shù)據(jù)分析

通過MSD Chem Station D.03.00.611化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，檢索Nist2005譜圖庫及進行資料分析，選取匹配度大于80%的予以保留，確認(rèn)其化學(xué)成分，并按面積歸一化法進行定量分析，計算出各成分的相對百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)莓汁揮發(fā)性成分總離子流圖

藍(lán)莓原濁汁總離子流圖和藍(lán)莓酶解汁總離子流圖分別見圖1、2。總離子流圖中藍(lán)莓原濁汁總峰面積為1.221×109，藍(lán)莓酶解汁總峰面積為8.748×108。由表1可以看出，酶解前后的藍(lán)莓汁香氣成分有很大的相似性，但新增種類和含量變化較大，而酯類化合物有所減少，含量較高的香氣成分有：正己醛、壬醛和異戊酸甲酯等。通過研究藍(lán)莓汁酶解前后揮發(fā)性成分的變化，本實驗可作為今后工藝改進和工藝控制的基礎(chǔ)依據(jù)。

2.2 GC-MS檢測藍(lán)莓汁酶解前后的揮發(fā)性成分

在萃取條件和進樣量各條件相同的情況下，每個樣品經(jīng)GC-MS檢測所得的數(shù)據(jù)結(jié)果和各種揮發(fā)性物質(zhì)含量占總揮發(fā)性物質(zhì)峰面積的百分比見表1。表1中物質(zhì)含量（%）為樣品中各種香氣物質(zhì)占總出峰面積的百分?jǐn)?shù)，本實驗以藍(lán)莓酶解汁的總出峰面積為100%，藍(lán)莓原濁汁的總出峰面積為71.66%。由表1可見，藍(lán)莓原濁汁和酶解汁中共鑒定出57種揮發(fā)性成分，共同含有的揮發(fā)性成分有31種。

藍(lán)莓原濁汁初步定性化合物有36種，其中4種物質(zhì)經(jīng)酶解后完全消失，相對含量從大到小排在前10位的是正己醛（11.40%）、甲酸己酯（10.01%）、乙醇（7.65%）、壬醛（5.73%）、異戊酸甲酯（4.42%）、桉葉油醇（4.07%）、正辛醇（3.68%）、（+）-檸檬烯（2.81%）、松油醇（2.04%）和二氯甲烷（1.44%）。

藍(lán)莓酶解汁初步定性化合物有52種，對比酶解前增加了21種新的揮發(fā)性物質(zhì)，相對含量從大到小排在前10位的是正己醛（15.31%）、壬醛（9.05%）、正己醇（8.64%）、乙醇（6.72%）、二氯甲烷（4.17%）、（+）-檸檬烯（3.93%）、2-己烯醛（3.86%）、松油醇（3.75%）和異戊酸甲酯（3.67%）。

在藍(lán)莓原濁汁和酶解汁的前10位物質(zhì)中，正己醇和2-己烯醛為新釋放的化合物，而正辛醇和甲酸己酯經(jīng)酶解后消失。Palomo等[17]的研究中認(rèn)為酶解處理是提升葡萄酒風(fēng)味的重要方法之一。Essa等[18]采用果膠酶和纖維素酶酶解刺梨汁，發(fā)現(xiàn)風(fēng)味品質(zhì)明顯提高，刺梨汁經(jīng)過果膠酶和纖維素酶處理后，降解了植物細(xì)胞壁并釋放出內(nèi)源酶，使之與風(fēng)味前體物反應(yīng)，從而提高乙酸乙酯和內(nèi)酯等特征香氣成分的含量。

2.3 藍(lán)莓汁酶解前后各類香氣成分種類和相對含量的差異

將藍(lán)莓濁汁酶解前后揮發(fā)性成分的種類進行對比，可分為8類，結(jié)果見圖3。在原濁汁中，這幾類化合物的相對含量從高到低為：酯類、醛類、醇類、烯類、酮類、碳?xì)漕悺⒑惡头宇?。酯類是藍(lán)莓原濁汁中揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)，鑒定出8種，占總峰面積的20.51%，甲酸己酯在樣品中含量較高，可作為原濁汁香氣的特殊成分；醛類揮發(fā)性成分有6種，占總峰面積的20.02%，其中正己醛的含量最高，該成分是醛類的代表，次之為壬醛；醇類6種，占18.97%，其中乙醇含量較高；烯類4種，占3.88%；碳?xì)漕?種，占3.1%；含氮類1種，占1.43%；酚類未鑒定出。

藍(lán)莓酶解汁中8類揮發(fā)性成分的排序從高到低為：醛類、醇類、酯類、烯類、碳?xì)漕?、酮類、酚類和含氮類。除酯類和含氮類，其他揮發(fā)性成分種類含量均高于原濁汁。醛類12種，占40.81%，比原濁汁增加了20.33%；醇類6種，占24.29%，比原濁汁增加了5.32%；酯類9種，占13.89%，比原濁汁減少了6.62%；烯類7種，占7.63%，比原濁汁增加了3.75%；碳?xì)漕?1種，占7.14%，比原濁汁增加了4.04%；酮類6種，占6.25%，比原濁汁增加了2.5%；酚類1種，占0.39%；含氮類未檢出。

從以上數(shù)據(jù)可看出，酶解對藍(lán)莓汁香氣的影響是顯著的，在相對含量上酶解汁增加了28.34%，說明酶解處理能夠增加藍(lán)莓濁汁的芳香物質(zhì)，起到增強并改善食品風(fēng)味。其中相對含量較高的3類香氣成分有醛類、醇類和酯類，從這3類香氣成分來看，酶解對醛類的影響是最大的，醛類相對含量明顯增加，次之為醇類香氣成分，酯類香氣成分相對含量反而降低。原因可能為酶解處理能夠使細(xì)胞間和細(xì)胞壁中的果膠成分在酶的作用下大量降解，從而提高出汁率并釋放出更多的芳香成分，起到増香效果。因此，酶解果汁對香氣回收具有重要意義，這與Pogorzelski等[19]綜述的酶解增香結(jié)論吻合，通過酶解果汁和葡萄酒飲料以釋放糖苷香味前體物質(zhì)，表明酶解可以增強果汁風(fēng)味。Sarry等[20]通過研究植物和果實中糖苷風(fēng)味前體的結(jié)構(gòu)和酶水解機理，結(jié)果表明糖苷酶對果實風(fēng)味釋放起促進作用，其中單萜（香茅醇，橙花醇），降冰片烯類化合物和苯衍生物（單萜芐醇，2-苯基乙醇，酪醇，姜油酮，4-乙烯基苯酚和4-乙烯基愈創(chuàng)木酚）等揮發(fā)物有所增加。

2.4 藍(lán)莓汁酶解前后揮發(fā)性成分構(gòu)成及其主體成分分析

水果香氣物質(zhì)是果汁風(fēng)味的主要構(gòu)成部分，是評價果汁內(nèi)在品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，醛、醇、酯這3類組分是藍(lán)莓汁酶解的最主要揮發(fā)性物質(zhì)。

醛類物質(zhì)是藍(lán)莓汁的主要香氣成分。本實驗中，正己醛在原濁汁和酶解汁中相對含量均最高，分別達(dá)11.40%和15.31%，可能是藍(lán)莓汁的特殊香氣組分，并且具有典型的青草香和蘋果香。此外，本實驗檢測到具有怡人香氣的壬醛（玫瑰香和柑橘香）和癸醛（酯香、花香、橙香）等成分。酶解汁新增加了2-己烯醛（3.86%）、庚醛（1.62%）和橙花醛（0.70%）等芳香物質(zhì)，而檸檬醛經(jīng)酶解處理后消失。經(jīng)酶解處理后醛類物質(zhì)的相對含量明顯增加，原因可能是糖苷鍵斷裂可以釋放出新的香氣物質(zhì)，并且酶解對藍(lán)莓汁香味具有保留作用。

醇類物質(zhì)是藍(lán)莓果汁的重要香氣成分之一。經(jīng)果膠酶和纖維素酶的酶解作用后，酶解汁的游離態(tài)香氣成分的種類與原汁的種類相近，但其相對含量有所增加。正己醇（8.64%）為酶解的新生成分，存在于柑橘類、漿果等中，具有特殊的水果清香味和甜味，在茶葉、香蕉、蘋果、草莓、樹莓和杏桃等果實[21-22]中均發(fā)現(xiàn)含有正己醇。經(jīng)酶解處理后，松油醇、橙花醇的相對含量有所增加，是天然香精香料的成分，使果汁風(fēng)味更為醇厚。部分醇類物質(zhì)雖然不是藍(lán)莓汁的香氣成分，但對藍(lán)莓汁的香氣形成起到重要作用。正辛醇經(jīng)酶解處理后則消失。醇類物質(zhì)的存在加強了藍(lán)莓果汁的香氣，表明酶解處理具有明顯的增香效果。

酯類物質(zhì)具有特殊的甜香、醚香，對藍(lán)莓汁香氣成分的形成起著關(guān)鍵作用。經(jīng)酶解處理后，酯類物質(zhì)的相對含量降低，但酯類物質(zhì)在藍(lán)莓汁整體風(fēng)味的形成中是不可缺少的。酯類物質(zhì)經(jīng)過果膠酶和纖維素酶的酶解作用后，釋放出苯甲酸甲酯（0.76%）和苯甲酸乙酯（2.12%）2種新的香氣成分，而甲酸己酯消失。苯甲酸乙酯具有桃香風(fēng)味，嚴(yán)紅光等[23]在兔眼藍(lán)莓及發(fā)酵酒中均檢測到苯甲酸乙酯。曹雪丹等[24]研究了藍(lán)莓酒主發(fā)酵前后揮發(fā)性成分變化，結(jié)果表明苯甲酸乙酯只在發(fā)酵酒中出現(xiàn)，在藍(lán)莓汁中并未檢出，說明苯甲酸乙酯的存在與藍(lán)莓品種有關(guān)，在南高叢藍(lán)莓中為其潛在香氣，酶解能夠促使該香氣釋放出來。

3 討論

由于酶解處理能夠使細(xì)胞間和細(xì)胞壁中的果膠成分降解，從而提高出汁率并釋放出更多的芳香成分，起到増香效果；結(jié)合HS-SPME/GC-MS技術(shù)的快速、高靈敏度等特點，本實驗研究了南高叢藍(lán)莓濁汁酶解前后揮發(fā)性成分的變化，發(fā)現(xiàn)酶解前后的主要成分是醛、醇和酯類物質(zhì)。原濁汁的香氣成分由醛、醇和酯類等36種化合物組成，主要的香氣成分為正己醛、甲酸己酯、壬醛、異戊酸甲酯、桉葉油醇、正辛醇、（+）-檸檬烯和松油醇；在原濁汁中，酯類被鑒定出8種，占總峰面積的20.51%；醛類揮發(fā)性成分有6種，占總峰面積的20.02%；醇類6種，占18.97%；烯類4種，占3.88%；碳?xì)漕?種，占3.1%；含氮類1種，占1.43%；酚類未鑒定出。經(jīng)過酶解工藝處理后，酶解汁中香氣成分的總量增加了28.34%，共檢測出52種揮發(fā)性物質(zhì)，主要成分為正己醛、壬醛、正己醇、（+）-檸檬烯、2-己烯醛、松油醇和異戊酸甲酯；新增23種成分，酶解后釋放出的主要新?lián)]發(fā)性成分為正己醇、苯甲酸甲酯、苯甲酸乙酯、2-己烯醛、庚醛、（E）-2-庚烯醛、苯甲醛、（E-E）-2，4-庚二烯醛、橙花醛、大馬士酮、香葉基丙酮、羅勒烯和松油烯等。藍(lán)莓酶解汁中鑒定出醛類12種，占40.81%；醇類6種，占24.29%；酯類9種，占13.89%；烯類7種，占7.63%；碳?xì)漕?1種，占7.14%；酮類6種，占6.25%；酚類1種，占0.39%；含氮類未鑒定出。

這與前人研究結(jié)果一致，證實酶解增香的理論。Will等[9]對蘋果汁和果渣進行酶處理，在果膠酶和纖維素酶的作用下釋放出大量內(nèi)容物，提高D-半乳糖醛酸、纖維二糖和酚類物質(zhì)的總量，大大增加香氣強度。Belancic等[25]將D.vanrijiβ-葡萄糖苷酶添加到馬斯喀特葡萄汁中發(fā)現(xiàn)酶解果汁的香葉醇和α-萜品醇等物質(zhì)含量增加。因此，本實驗研究對藍(lán)莓汁的增香具有一定的現(xiàn)實意義，并對藍(lán)莓食品加工與開發(fā)具有一定的參考價值。

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