白玉龍火龍果不同外植體的離體培養(yǎng)

謝志亮　曾光輝　余宏傲　吳振旺

摘要：[目的]研究白玉龍火龍果子葉、下胚軸及子葉節(jié)的不定芽誘導及莖段增殖技術，為白玉龍火龍果的品種改良及快繁育苗提供技術支持。[方法]以白玉龍火龍果種子培育的無菌苗為材料，采用正交試驗設計分析不同培養(yǎng)基、不同植物生長調節(jié)劑與濃度及其組合對白玉龍火龍果子葉、下胚軸及子葉節(jié)不定芽誘導及莖段增殖與生根的影響。[結果]白玉龍火龍果子葉、下胚軸及子葉節(jié)均能直接誘導不定芽發(fā)生。其中，16個正交處理均能誘導子葉節(jié)不定芽發(fā)生，其最優(yōu)誘導培養(yǎng)基為WPM+0.50 mg/L TDZ+0.50 mg/L CPPU+0.05 mg/L 6-BA+I.0 mg/L NAA，誘導率為87.1%-100.0%；子葉僅1個處理未能誘導出不定芽，最高誘導率為36.0%，其最優(yōu)誘導培養(yǎng)基為1/2MS+0.50 mg/L TDZ+0.05mg/L CPPU+2.00 mg/L 6-BA+0 mg/L NAA；下胚軸僅5個處理能誘導出不定芽，最高誘導率僅3.0%，其最優(yōu)誘導培養(yǎng)基為1/2MS+0.05 mg/L TDZ+2.00 mg/L CPPU+I.00 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA。莖段去頂處理有利于腋芽的誘導萌發(fā)，去頂處理的最大增殖系數(shù)為4.2，不去頂處理的最大增殖系數(shù)為3.1，其最優(yōu)增殖培養(yǎng)基為WPM+0.50 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA。NAA處理能促進莖段生根，適宜的生根培養(yǎng)基為1/2MS+0.1-0.5 mg/L NAA，生根率達100.0%。[結論]不同基本培養(yǎng)基、植物生長調節(jié)劑與濃度及其組合均能誘導白玉龍火龍果子葉、下胚軸和子葉節(jié)不定芽發(fā)生及莖段芽增殖和不定根產生。其中，不定芽誘導以子葉節(jié)最易誘導發(fā)生，其次為子葉，下胚軸較難；莖段芽增殖和不定根誘導均較容易。

關鍵詞：火龍果；離體培養(yǎng)；子葉；下胚軸；子葉節(jié)；不定芽誘導

0引言

[研究意義]火龍果是仙人掌科（Cactaceae）量天尺屬（Hylocereus undatus）和蛇鞭柱屬（Seleniere us mejalantous）多年生攀援性肉質植物，主要有紅皮白肉、黃皮白肉和紅皮紅肉三大類。白玉龍屬于紅皮白肉類火龍果，白花結實，個大，產量高，抗病性強，耐儲運，是目前我國種植面積最大、產量最高的火龍果主栽品種，而較受市場歡迎的紅皮紅肉類火龍果，因其白花不結實或結實率低，種植面積相對較小。因此，為滿足消費者需求及促進火龍果產業(yè)健康發(fā)展，亟待利用現(xiàn)代生物技術進行火龍果品種遺傳改良。[前人研究進展]通過不同6-BA濃度與NAA組合誘導火龍果帶刺座莖段腋芽萌發(fā)與增殖，再經生根培養(yǎng)獲得大量火龍果組培再生植株已有研究報道（黃青峰，2002；周傳明等，2002；陳廣超等，2003；余慧琳等，2009；黃春華等，2013）。黃紅梅等（2012）采用一定濃度2，4-D與6-BA組合成功獲得火龍果莖段和子葉愈傷組織，并通過6-BA與NAA組合成功誘導愈傷組織再分化。黃文靜等（2013）采用1/2MS+0.5-2.5 mg/L 6-BA成功誘導了火龍果子葉節(jié)不定芽萌發(fā)。彭思維等（2015）采用適宜濃度的TDZ（苯基噻二唑基脲）、2，4-D和NAA組合，成功誘導獲得了火龍果莖段愈傷組織及莖段叢生芽。[本研究切入點]目前，有關火龍果子葉及下胚軸不定芽誘導再生的研究鮮見報道。[擬解決的關鍵問題]以白玉龍火龍果無菌實生苗的子葉、胚軸和子葉節(jié)為試材，采用正交試驗設計分析不同培養(yǎng)基、不同激素與濃度及其組合對其不定芽誘導及莖段增殖再生的影響，為利用現(xiàn)代生物技術進行火龍果品種改良及其種苗快繁提供技術支持。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試白玉龍火龍果（7年生）種植于浙江溫州科技職業(yè)學院（溫州市農業(yè)科學研究院）梧田基地設施大棚內，于2014年10-11月采摘自然成熟開裂的自花授粉果實為基本材料。

1.2試驗方法

1.2.1無菌苗獲得 參照謝志亮等（2016）的方法，將火龍果果實去除果皮后置于盆中反復用力揉搓果肉，利用清水浮力去除果肉組織，然后將種子置于紗布袋中反復用力擠壓以除去種子表面粘狀物，再用潔凈自來水將種子沖洗干凈，置于干凈燒杯中，于超凈工作臺上用75%酒精消毒30 s，然后用0.1%HgCl2溶液消毒6-8 min，最后以無菌水清洗4-6次，育苗備用。

1.2.2子葉、下胚軸及子葉節(jié)不定芽誘導 采用L16（4）正交試驗設計（表1）分析基本培養(yǎng)基、TDZ、氯吡脲（CPPU）、6-BA和NAA對白玉龍火龍果子葉、下胚軸及子葉節(jié)（切除幼苗和部分下胚軸）不定芽誘導的影響。無菌苗苗齡為25-30 d，每瓶接種6-9個外植體，每處理接種36個外植體。接種45 d后統(tǒng)計不定芽誘導率。

不定芽誘導率（%）=具不定芽的外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)×100

1.2.3莖段培養(yǎng) 采用L9（3）正交試驗設計（表2），分析基本培養(yǎng)基、6-BA和IBA對無菌苗莖段增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的影響。莖段分切除頂端優(yōu)勢與不切除頂端優(yōu)勢兩個處理。接種45 d后統(tǒng)計增殖系數(shù)和生根率。

增殖系數(shù)=誘導的不定芽總數(shù)/接種外植體數(shù)

1.2.4不定根誘導 切取生長健壯的無根苗接種于添加不同NAA濃度的1/2MS+3.0%蔗糖+0.7%瓊脂培養(yǎng)基上，NAA濃度設0.1、0.5、1.0、2.0和4.0 mg/L共5組處理，每組處理10瓶，每瓶接種4個外植體。30 d后觀察不定根的生長情況，統(tǒng)計不定根的誘導率和生根數(shù)等。

生根率（%）=具不定根的外植體數(shù)/接種總外植體數(shù)×100

1.2.5培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度（25±2℃），相對濕度保持在60%-80%，光照強度1500-3000 1X，光照時間14 h/d。

1.3統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2007進行統(tǒng)計分析。

2結果與分析

2.1不同基本培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑對白玉龍火龍果外植體不定芽誘導的影響

外植體材料和激素組合不同，其不定芽誘導的難易程度和誘導率也不一樣。由表3和圖1-A-圖1-C可看出，子葉節(jié)最容易誘導發(fā)生不定芽，子葉次之，下胚軸最難誘導發(fā)生不定芽。從發(fā)生位置來看，子葉節(jié)誘導的不定芽位于與上胚軸相連的切口處，子葉誘導的不定芽發(fā)生于近軸端，下胚軸誘導的不定芽則發(fā)生于形態(tài)學上端（近子葉端）。

2.1.1對子葉節(jié)不定芽誘導的影響 由表3可知，以子葉節(jié)進行不定芽誘導，16個處理均有較高的不定芽誘導率（87.1%-100.0%），其中，處理1、2、5、6、7、10、12和14的不定芽誘導率均達100.0%；比較極差（R），發(fā)現(xiàn)影響子葉節(jié)不定芽誘導的主次因子排序為B>D>C>A>E，說明TDZ對子葉節(jié)不定芽誘導的影響最大其后依次為6-BA、CPPU、基本培養(yǎng)基和NAA。誘導白玉龍火龍果子葉節(jié)不定芽發(fā)生的最優(yōu)組合為AIB2C2DIE4，即WPM+0.50 mg/L TDZ+0.50 mg/LCPPU+0.05 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA為誘導子葉節(jié)不定芽發(fā)生的適宜培養(yǎng)基。

2.1.2對子葉不定芽誘導的影響 由表3可知，以子葉進行不定芽誘導，除處理3外，其余15個處理均能誘導出不定芽，其中又以處理10的誘導率最高，達36.0%；比較極差（R），發(fā)現(xiàn)影響白玉龍火龍果子葉不定芽誘導的主次因子排序為E>B>A>C>D，說明NAA對子葉不定芽誘導的影響最大，其次為TDZ，其后依次為基本培養(yǎng)基、CPPU和6-BA。誘導白玉龍火龍果子葉不定芽發(fā)生的最優(yōu)組合為A382CID4EI，即1/2MS+0.50 mg/L TDZ+O.05 mg/L CPPU+2.00 mg/L6-BA+0 mg/L NAA為誘導子葉不定芽發(fā)生的適宜培養(yǎng)基。

2.1.3對下胚軸不定芽誘導的影響 由表3可知，以下胚軸進行不定芽誘導，僅處理4、5、9、10和13發(fā)生不定芽，且誘導率極低，最高的僅為3.0%；比較極差（R），發(fā)現(xiàn)影響下胚軸不定芽誘導的主次因子排序為C>B>D>E>A，說明CPPU對下胚軸不定芽誘導的影響最大，其后依次為TDZ、6-BA、NAA和基本培養(yǎng)基。誘導白玉龍火龍果下胚軸不定芽發(fā)生的最優(yōu)組合為A3BIC4D3～，最口1/2MS+0.05 mg/L TDZ+2.00 mg/LCPPU+1.00 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA為誘導下胚軸不定芽發(fā)生的適宜培養(yǎng)基。

2.2不同基本培養(yǎng)基及植物生長調節(jié)劑對白玉龍火龍果莖段增殖的影響

由表4可知，白玉龍火龍果莖段的增殖系數(shù)為0.8～4.2。其中，去除頂端生長點9個處理的增殖系數(shù)均比對應保留頂端生長點處理的增殖系數(shù)大（圖1-D和圖1-E）；在去除頂端生長點的處理中，以處理4的增殖系數(shù)最大，為4.2，處理7的增殖系數(shù)最小，為1.5；在保留頂端生長點的處理中，以處理1和處理5的增殖系數(shù)最大，均為3.1，處理7的增殖系數(shù)最小，為0.8。比較極差（R），發(fā)現(xiàn)無論莖段去頂與否，影響莖段芽增殖的主次因子排序均為A>C>B，即依次為培養(yǎng)基、IBA和6-BA。白玉龍火龍果莖段增殖培養(yǎng)的最優(yōu)組合為A1B1C2，即WPM+0.50 mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA為白玉龍火龍果莖段增殖的最佳培養(yǎng)基。

2.3不同NAA濃度對白玉龍火龍果莖段不定根誘導的影響

火龍果不定根有兩種，且均易發(fā)生，其中，從莖段切面?zhèn)谔幇l(fā)生的不定根生長較粗壯（圖1-F），另一種細長毛狀氣生根發(fā)生部位不確定，在芽誘導與增殖、生根誘導及壯苗等培養(yǎng)過程中均有發(fā)生。

由表5可知，5個NAA濃度處理均能誘導不定根發(fā)生，但以低濃度（0.1-0.5 mg/L）NAA誘導效果較優(yōu)，不定根誘導率達100.0%，平均根數(shù)也較多，根長目.粗壯。

2.4煉苗及移栽

選取健壯生根瓶苗至室外鍛煉15 d左右，再逐步打開瓶蓋，2-4 d后用清水清洗去除培養(yǎng)基，晾干后栽人草炭：珍珠巖：蛭石為1：1：1的基質中，澆透水，短時間遮蔭管理，移栽成活率在90.0%以上。

3討論

黃文靜等（2013）以1/2MS+0.5-2.5 mg/L 6-BA為培養(yǎng)基進行火龍果子葉節(jié)不定芽誘導，可獲得較高的誘導萌發(fā)率，每個子葉節(jié)可誘導發(fā)生1～4個不定芽，且隨6-BA濃度增加，誘導率與不定芽數(shù)逐漸增加，以1.5 mg/L 6-BA的效果最佳，誘導萌發(fā)率達90.0%。本研究利用TDZ、6-BA、CPPU及NAA的16個正交處理組合也成功誘導火龍果子葉節(jié)不定芽萌發(fā)，且多個組合的誘導率達100.0%，大部分子葉節(jié)誘導出2個以上不定芽。

黃紅梅等（2012）報道利用2，4-D與6-BA、6-BA與NAA組合成功誘導獲得火龍果子葉愈傷組織且愈傷組織能再分化。本研究利用不同培養(yǎng)基與植物生長調節(jié)劑組合成功誘導火龍果子葉和下胚軸直接發(fā)生不定芽，但二者的不定芽誘導率均比子葉節(jié)低，尤其以下胚軸不定芽的誘導率更低。雖然16個子葉不定芽誘導處理中僅處理3未發(fā)生不定芽，但不定芽誘導率偏低，最高僅為36.0%；16個下胚軸不定芽誘導處理中僅5個處理發(fā)生不定芽，不定芽誘導率極低，最高僅為3.0%。從不定芽發(fā)生部位來看，子葉不定芽均發(fā)生于近軸端，下胚軸不定芽發(fā)生于下胚軸形態(tài)學上端即靠近子葉（子葉節(jié)）端，可能與子葉及下胚軸的連接處富有分生組織更有利于不定芽發(fā)生有關（范晨昕等，2008）。為提高火龍果子葉和下胚軸的不定芽誘導率及遺傳轉化效率，尚需在其外植體材料、培養(yǎng)條件、激素濃度與組合等方面進行深入探究。

目前，關于火龍果莖段增殖培養(yǎng)的研究較多，主要集中在直接誘導腋芽萌發(fā)而獲得無根苗，而經由愈傷組織階段再誘導分化形成不定芽較難（黃紅梅等，2012；彭思維等，2015）。周傳明等（2002）、陳廣超等（2003）、余慧琳等（2009）、謝志亮等（2016）采用一定濃度的6-BA與NAA組合誘導火龍果腋芽可獲得較高的誘導萌發(fā)率，且隨6-BA濃度的升高，增殖系數(shù)增大，當6-BA濃度為10.0 mg/L、誘導后60 d統(tǒng)計的增殖系數(shù)達5.99，但苗長勢較弱、分枝多，水浸狀及玻璃化現(xiàn)象嚴重；從組培苗的數(shù)量和質量來看，火龍果增殖培養(yǎng)的6-BA濃度以0.5～2.0 mg/L為宜。本研究中，火龍果莖段切除頂端生長點更有利于其增殖，可能與頂端分生組織能合成生長素等植物激素，存在頂端優(yōu)勢，從而抑制側芽的萌發(fā)有關。

黃青峰和余成章（2002）研究發(fā)現(xiàn)，利用低濃度NAA誘導火龍果生根效果最佳；而劉洪章等（2012）研究認為，IAA誘導火龍果生根效果明顯優(yōu)于NAA，且以1.0 mg/L IAA的誘導效果最佳；王云山等（2012）的研究結果也表明，IBA誘導火龍果莖段發(fā)生不定根的效果優(yōu)于NAA，且以2.0 mg/L IBA誘導效果最佳，生根率為86.96%，IBA濃度大于4.0 mg/L時會抑制根的形成。本研究結果與上述研究結果相似，低濃度NAA能較好地誘導火龍果無根苗生根，在0.1-0.5 mg/L NAA濃度下，生根率達100.0%。

4結論

不同基本培養(yǎng)基、植物生長調節(jié)與濃度及其組合均能誘導白玉龍火龍果子葉、下胚軸及子葉節(jié)不定芽發(fā)生、莖段芽增殖和不定根產生。其中，子葉節(jié)最易誘導發(fā)生不定芽，其次為子葉，下胚軸較難；莖段芽增殖和不定根誘導均較容易。