運(yùn)輸脅迫對四指馬鲅幼魚肝臟、鰓和脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響

劉奇奇　溫久?！^(qū)又君　李加兒　周慧

摘要：[目的]探究運(yùn)輸脅迫對四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）幼魚肝臟、鰓、脾臟組織結(jié)構(gòu)的影響，提高種苗運(yùn)輸存活率，為其規(guī)?；B(yǎng)殖提供技術(shù)支持。[方法]以四指馬鲅幼魚為研究對象，分別設(shè)對照組（未運(yùn)輸）、混合組（運(yùn)輸，同時(shí)添加抗應(yīng)激混合物）和空白組（運(yùn)輸，不添加任何抗應(yīng)激劑），抗應(yīng)激劑為維生素c：谷氨酰胺=1：1?；旌辖M和空白組幼魚經(jīng)6 h運(yùn)輸后分別取樣（肝臟、鰓和脾臟），經(jīng)石蠟切片和HE染色，顯微鏡下觀察測定肝臟、鰓和脾臟的細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)、生活及生理狀態(tài)。[結(jié)果]對照組幼魚表現(xiàn)正常，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，混合組幼魚的累計(jì)死亡率為12.5%，空白組的累計(jì)死亡達(dá)27.5%。對照組幼魚的各組織均呈正常形態(tài)；混合組幼魚的肝臟部分區(qū)域細(xì)胞排列疏松，肝小板結(jié)構(gòu)不清晰；空白組幼魚的肝臟組織整體失去固有形態(tài)，肝小板結(jié)構(gòu)消失不見，大部分細(xì)胞核變性呈橢圓形或紡錘形?；旌辖M幼魚的鰓絲排列混亂，少數(shù)鰓小片末端或整體腫脹，血竇內(nèi)紅細(xì)胞出現(xiàn)部分堆積現(xiàn)象，線粒體豐富細(xì)胞體積變大；空白組的鰓小片整體腫脹，血竇加粗，部分鰓小片因紅細(xì)胞過多而脹破，線粒體豐富細(xì)胞體積變大且數(shù)量增多?；旌辖M幼魚的脾臟白髓區(qū)域相對增大，黑色素-巨噬細(xì)胞中心數(shù)量及大小均有所增加；空白組幼魚的脾臟組織紅髓區(qū)域占據(jù)大部分，白髓區(qū)域相對較少，呈零散分布，巨噬細(xì)胞中心減小。[結(jié)論]運(yùn)輸脅迫導(dǎo)致四指馬鲅幼魚肝臟、鰓及脾臟組織損傷，抗應(yīng)激劑混合物雖然在一定程度上起到緩解作用，但并不能完全消除。

關(guān)鍵詞：四指馬鲅；運(yùn)輸脅迫；肝臟；鰓；脾臟；組織損傷；抗應(yīng)激劑

0引言

[研究意義]四指馬鲅（Eleutheronema tetradactylum）俗稱午魚、馬友等，隸屬于鯔形目（Mugiliformes）馬鲅科（Polynemidae）四指馬鲅屬（Eleutheronema）（孫典榮和陳錚，2013），因具有肉質(zhì)鮮美、抗病力強(qiáng)、生長迅速等優(yōu)點(diǎn)而深受廣大養(yǎng)殖戶青睞，現(xiàn)已發(fā)展成為新興水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一。隨著四指馬鲅人工繁育技術(shù)的攻克，目前在我國臺灣、廣東、海南、浙江等地已有人工養(yǎng)殖（謝木嬌等，2016a），且養(yǎng)殖規(guī)模和市場占有率逐年擴(kuò)大，但四指馬鲅抗應(yīng)激能力較弱，尤其種苗極易受運(yùn)輸?shù)热藶榛顒?dòng)的影響，是制約四指馬鲅規(guī)?；B(yǎng)殖的重要因素。因此，加強(qiáng)四指馬鲅種苗抗應(yīng)激能力研究，解決長途運(yùn)輸種苗存活率的問題，對促進(jìn)其養(yǎng)殖業(yè)的健康快速發(fā)展具有重要意義。[前人研究進(jìn)展]至今，有關(guān)四指馬鲅的研究已有較多報(bào)道，包括不同發(fā)育階段消化道組織學(xué)比較（謝木嬌等，2016b）、受精卵和仔魚對不同鹽度的耐受性（謝木嬌等，2016c）及消化道黏液細(xì)胞的發(fā)育規(guī)律（謝木嬌等，2015；謝木嬌等，2016a）等。此外，Zischke等（2009）、Moore等（2011）以寄生蟲的種群結(jié)構(gòu)推測寄主遺傳結(jié)構(gòu)，系統(tǒng)分析了澳大利亞東部及北部四指馬鲅的遺傳結(jié)構(gòu)；Newman等（2011）、Ballagh等（2012）分別以同位素標(biāo)記及生活史特征研究澳大利亞北部四指馬鲅的種群結(jié)構(gòu)；林少珍等（2012）利用COI基因序列對我國東南沿海四指馬鲅種群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；羅海忠等（2015）采用鹽度漸變法研究5種鹽度對四指馬鲅幼魚生長及其鰓絲Na+/K+-ATP酶的影響。上述研究結(jié)果為四指馬鲅的養(yǎng)殖生產(chǎn)提供了科學(xué)依據(jù)。[本研究切入點(diǎn)]應(yīng)激是機(jī)體對外界或內(nèi)部各種異常刺激所產(chǎn)生的非特異性全身反應(yīng)，是生物體在長期進(jìn)化中形成的一種適應(yīng)性和防御性功能。魚類極易受水環(huán)境及其他外界環(huán)境的影響從而產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，對其健康造成不利影響，尤其是長期應(yīng)激脅迫會(huì)降低機(jī)體的抵抗力和生長速率等（孫鵬等，2014），但目前有關(guān)環(huán)境脅迫影響四指馬鲅的研究鮮見報(bào)道。[擬解決的關(guān)鍵問題]通過對比運(yùn)輸脅迫前后四指馬鲅幼魚肝臟、鰓及脾臟的顯微結(jié)構(gòu)變化，探究四指馬鲅應(yīng)對運(yùn)輸脅迫的應(yīng)答規(guī)律，旨在提高種苗運(yùn)輸存活率，為其規(guī)?；B(yǎng)殖提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試四指馬鲅幼魚于2016年6-9月在南海水產(chǎn)研究所珠海試驗(yàn)基地培育獲得，體長11.0±0.5 cm，體質(zhì)量24.0±1.5 g。試驗(yàn)開始前進(jìn)行馴養(yǎng)，使其適應(yīng)環(huán)境，期間每天換水1次，每次換水量1/2左右，連續(xù)充氣增氧。馴養(yǎng)1周后隨機(jī)挑選90尾體色正常、健康的幼魚用于試驗(yàn)。

1.2試驗(yàn)方法

在水溫25℃、pH 8.0±0.2、溶解氧6.0±0.5 mg/L的條件下，將四指馬鲅幼魚隨機(jī)平均分為3組，即對照組（未運(yùn)輸）、混合組（運(yùn)輸，同時(shí)添加抗應(yīng)激混合物）和空白組（運(yùn)輸，不添加任何抗應(yīng)激劑）。對照組幼魚（30尾）用MS-222麻醉2-3 min，取其肝臟、鰓和脾臟樣品固定于4%多聚甲醛溶液中。同時(shí)取6個(gè)相同規(guī)格的暫養(yǎng)桶（直徑1.3 m、高1.5 m，加水量約占總體積的80%），其中3個(gè)暫養(yǎng)桶（混合組）參考周傳朋等（2014）的方法在養(yǎng)殖水中添加維生素C：谷氨酰胺=1：1的抗應(yīng)激劑混合物，使其濃度為20 mg/m3；另外3個(gè)暫養(yǎng)桶（空白組）的養(yǎng)殖水不添加抗應(yīng)激劑。每個(gè)桶暫養(yǎng)10尾四指馬鲅幼魚，以中型卡車在公路上正常行駛6 h。運(yùn)輸結(jié)束時(shí)，以同樣方法取肝臟、鰓和脾臟樣品，固定于4%多聚甲醛溶液中。

1.3測定項(xiàng)目及方法

參照陳世喜等（2017）的方法，取出4%多聚甲醛固定的四指馬鲅幼魚肝臟、鰓和脾臟樣品，經(jīng)流水沖洗、70%-100%乙醇脫水和二甲苯透明，以石蠟包埋處理后用Leica切片機(jī)進(jìn)行連續(xù)切片，切片厚度5-6pm，采用HE染色和中性樹脂封片，于Zeiss顯微鏡下觀察拍照。觀察測定項(xiàng)目包括幼魚肝臟、鰓和脾臟的細(xì)胞形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)及其生活生理狀態(tài)。

2結(jié)果與分析

2.1運(yùn)輸脅迫前后四指馬鲅幼魚的生活狀態(tài)及死亡率

對照組幼魚表現(xiàn)正常，沿暫養(yǎng)池壁集體朝同一方向不停游動(dòng)，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；混合組幼魚在運(yùn)輸期間向不同方向快速、混亂游動(dòng)，并撞擊桶壁，有少數(shù)幼魚死亡，累計(jì)死亡率為12.5%；空白組幼魚在運(yùn)輸初期與混合組無明顯區(qū)別，但隨著運(yùn)輸時(shí)間的延長，幼魚游動(dòng)速度明顯減慢，且動(dòng)作不協(xié)調(diào)，有的甚至呈側(cè)游或翻身游動(dòng)，運(yùn)輸結(jié)束后的累計(jì)死亡率達(dá)27.5%。

2.2運(yùn)輸脅迫對四指馬鲅幼魚肝臟組織的影響

對照組幼魚的肝細(xì)胞呈多面體緊密排列，細(xì)胞核大而圓，多為單核，居細(xì)胞中央，且著色較深，部分細(xì)胞出現(xiàn)因糖原溶解形成的空泡；肝小板和肝血竇沿中央靜脈呈放射狀相間排列，結(jié)構(gòu)清晰；中央靜脈位于肝小葉中部，周圍有許多肝血竇開口，其橫切面呈圓形，均表現(xiàn)為正常形態(tài)（圖1-1、圖1-2和圖1-3）?；旌辖M幼魚的肝臟受到較輕微損傷，主要表現(xiàn)為肝細(xì)胞空泡消失，形狀不規(guī)則，部分區(qū)域細(xì)胞排列散亂，部分細(xì)胞核著色較深；肝小葉及肝小板結(jié)構(gòu)不清晰，肝血竇間隙增大；中央靜脈橫切面呈不規(guī)則形狀（圖1-4、圖1-5和圖1-6）?？瞻捉M幼魚的肝組織受到嚴(yán)重?fù)p傷，主要表現(xiàn)為整體肝細(xì)胞核失去固有形態(tài)，細(xì)胞排列松散且不規(guī)則，大部分細(xì)胞核變性呈橢圓形或紡錘形，著色較淺，空泡消失；肝小板及肝小葉結(jié)構(gòu)消失不見；中央靜脈周圍肝血竇開口較大，其橫切面呈不規(guī)則形狀且內(nèi)部充滿血細(xì)胞（圖1-7、圖1-8和圖1-9）。

2.3運(yùn)輸脅迫對四指馬鲅幼魚鰓組織的影響

對照組幼魚鰓組織中線粒體豐富細(xì)胞呈橢圓形，分布在鰓小片基部，上皮細(xì)胞呈扁平狀規(guī)則排列；血竇內(nèi)均勻分布有紅細(xì)胞，兩側(cè)的鰓小片對稱且完整，鰓絲密集且排列整齊，其結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為正常的生理形態(tài)（圖2-1、圖2-2和圖2-3）。與對照組相比，混合組幼魚鰓組織中線粒體豐富細(xì)胞體積變大；血竇收縮，其紅細(xì)胞分布不均勻，出現(xiàn)部分堆積現(xiàn)象；鰓小片呈S形扭曲且排列不規(guī)則，大部分鰓小片彎曲，少數(shù)鰓小片末端或整體腫脹；鰓絲排列不整齊，部分鰓絲中間開裂，且著色力減弱（圖2-4、圖2-5和圖2-6），表明運(yùn)輸脅迫對鰓組織已造成一定損傷，但并不嚴(yán)重。空白組幼魚鰓組織中線粒體豐富細(xì)胞體積變大且數(shù)量增多，大部分上皮細(xì)胞水腫變性，部分表皮出現(xiàn)脫落現(xiàn)象；鰓小片整體腫脹，血竇增寬，紅細(xì)胞分布不均勻，部分鰓小片因紅細(xì)胞過多而脹破；鰓絲整體水腫，部分鰓絲中間開裂，其整體偏離正常形態(tài)（圖2-7、圖2-8和圖2-9），表明運(yùn)輸脅迫對鰓組織造成嚴(yán)重?fù)p傷。

2.4運(yùn)輸脅迫對四指馬鲅幼魚脾臟組織的影響

對照組幼魚脾臟組織網(wǎng)狀支架上分布極密集的淋巴細(xì)胞，最外層可觀察到被膜，局部可見由被膜結(jié)締組織形成的小梁結(jié)構(gòu)；被膜以下由紅髓和白髓交替分布形成密集網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的脾臟實(shí)質(zhì)，分布有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；在紅髓周圍稀散分布的為白髓結(jié)構(gòu)，區(qū)域面積相對紅髓區(qū)域要小很多，內(nèi)部分布有密集的淋巴細(xì)胞（圖3-1、圖3-2和圖3-3）。與對照組相比，混合組幼魚的脾臟組織受到一定損傷，但并不嚴(yán)重，表現(xiàn)為白髓區(qū)域增大，黑色素一巨噬細(xì)胞中心數(shù)量及大小均有所增加；邊緣區(qū)面積增加（圖3-4、圖3-5和圖3-6）?？瞻捉M幼魚脾臟嚴(yán)重?fù)p傷，表現(xiàn)為組織中充滿紅細(xì)胞，紅髓與白髓相對較少，呈零散分布，巨噬細(xì)胞中心數(shù)量和邊緣區(qū)域面積均減小（圖3-7、圖3-8和圖3-9）。

3討論

與自然條件下相比，魚類在集約化養(yǎng)殖過程中需經(jīng)受更多人為因素的干擾，但在長期進(jìn)化過程中魚類已形成了相應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)制。劉小玲（2007）研究表明，輕度刺激可促進(jìn)魚類生長，改善魚類體質(zhì)，但劇烈或長期刺激會(huì)干擾魚類的正常生理功能，導(dǎo)致機(jī)體功能紊亂，甚至死亡。肝臟是魚類最大的消化腺，可分泌膽汁促進(jìn)脂肪的分解與吸收，又參與多種物質(zhì)的合成、儲存、代謝和轉(zhuǎn)化。肝細(xì)胞內(nèi)含有多種內(nèi)含物，主要有糖原、脂滴及色素等，且其含量與機(jī)體的生理狀態(tài)密切相關(guān)。彭士明等（2011）研究表明，運(yùn)輸脅迫下銀鯧（Pampus argenteus）的機(jī)體能量供給主要來自肝臟糖元分解。本研究中，由于分組過程中幼魚受到驚嚇，導(dǎo)致其肝糖元的代謝與合成平衡被打亂，可能是對照組四指馬鲅幼魚肝臟組織出現(xiàn)空泡的原因。Johnston等（1989）對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的研究表明，維生素C可通過神經(jīng)調(diào)節(jié)因子調(diào)節(jié)腦部激素水平，調(diào)控魚類行為以增強(qiáng)其抗應(yīng)激能力。黃玉萍等（2010）研究表明，抗應(yīng)激復(fù)合物可有效提高團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala）的抗應(yīng)激能力，降低應(yīng)激對肝臟等組織的損傷。此外，徐洋等（2011）研究證實(shí)谷氨酰胺可促進(jìn)腸道黏膜修復(fù)、淋巴細(xì)胞增殖、巨噬細(xì)胞分裂和分化，在免疫調(diào)節(jié)方面具有重要意義。本研究中，混合組幼魚肝細(xì)胞空泡消失可能是抗應(yīng)激劑對魚類能量代謝起調(diào)解作用。運(yùn)輸過程中幼魚因受到驚嚇而劇烈掙扎游動(dòng)，其能量代謝及耗氧量隨之增加，為滿足機(jī)體對氧的需求，故肝血竇間隙增大、血流加快；部分肝細(xì)胞排列散亂及不規(guī)則的中央靜脈橫切面，其原因可能是運(yùn)輸過程中幼魚不斷撞擊桶壁導(dǎo)致肝臟組織發(fā)生機(jī)械性損傷。四指馬鲅幼魚的肝臟組織在運(yùn)輸脅迫后失去固有形態(tài)，其生理狀態(tài)趨于崩潰，累計(jì)死亡率高達(dá)27.5%，與Zhang等（2004）的研究結(jié)果相似?？傊\(yùn)輸脅迫會(huì)對四指馬鲅幼魚的肝臟造成損傷，添加抗應(yīng)激劑混合物可起到一定的緩解作用，但無法從根本上消除。

鰓是魚類的主要呼吸器官，同時(shí)具有排泄氨氮等代謝廢物及調(diào)解滲透壓的功能。本研究中，混合組幼魚鰓線粒體豐富細(xì)胞體積變大的現(xiàn)象與高鹽度下卵形鯧夠（Trachinotus ovatus）線粒體豐富細(xì)胞（區(qū)又君等，2013）的變化相同，表明運(yùn)輸應(yīng)激破壞了四指馬鲅幼魚的滲透壓平衡，少數(shù)鰓小片末端或整體出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象。與肝組織相同，在抗應(yīng)激劑混合物作用下四指馬鲅幼魚的鰓基礎(chǔ)代謝增加、血流加快，但由于運(yùn)輸脅迫致使血竇收縮，從而導(dǎo)致紅細(xì)胞分布不均勻，出現(xiàn)部分堆積現(xiàn)象，與陳彩芳等（2012）對泥蚶（Tegillarca granosa）的研究結(jié)果相似。本研究中，混合組幼魚鰓小片呈S形扭曲且排列不規(guī)則，可能是運(yùn)輸過程中幼魚劇烈掙扎，加上滲透壓遭到破壞，鰓小片局部吸水所造成?？瞻捉M幼魚線粒體豐富細(xì)胞體積變大且數(shù)量增多，與鹽度脅迫遮目魚（Chanos chanos）幼魚的試驗(yàn)結(jié)果（區(qū)又君等，2014）相似，表明四指馬鲅幼魚為克服運(yùn)輸脅迫，調(diào)動(dòng)相關(guān)生理反應(yīng)而消耗大量能量。四指馬鲅幼魚鰓組織上皮細(xì)胞水腫變性，部分表皮脫落，表明運(yùn)輸脅迫導(dǎo)致鰓Na+/K+-ATP酶活性下降，即在無抗應(yīng)激劑的條件下幼魚鰓功能遭到破壞?？梢?，運(yùn)輸脅迫致使四指馬鲅幼魚鰓組織出現(xiàn)不同程度的損傷，添加抗應(yīng)激劑能起到明顯的緩解作用。

脾臟主要由淋巴組成，在魚類的造血、免疫及儲血方面發(fā)揮著重要作用。低鹽脅迫下，許氏平觸（Sebastes schlegeli）脾臟組織中淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，且呈聚集現(xiàn)象（王曉杰等，2006）。本研究中，混合組幼魚脾臟組織的變化與低鹽脅迫下許氏平觸脾臟組織的變化相似，表明抗應(yīng)激劑在一定程度上能提高受運(yùn)輸脅迫幼魚的免疫反應(yīng)能力，促使免疫細(xì)胞的數(shù)量合成增加。王文博等（2004）對草魚（Ctenopharyngodon idellus）的研究表明，擁擠脅迫會(huì)對魚類脾臟器官造成極大損傷。運(yùn)輸脅迫下四指馬鲅幼魚脾臟組織的白髓及巨噬細(xì)胞中心數(shù)量均相對減少，說明其免疫系統(tǒng)已無法抵御運(yùn)輸脅迫的干擾，免疫細(xì)胞合成受阻，與王曉杰等（2006）的研究結(jié)果相似，表明長期處于應(yīng)激脅迫下魚類免疫力易受到明顯影響，因此在養(yǎng)殖生產(chǎn)過程中應(yīng)避免長期的逆境脅迫。

實(shí)際生產(chǎn)中，采取以下措施能有效提高魚類的抗應(yīng)激能力（王慶萍等，2013）：（1）運(yùn)輸過程中應(yīng)避免多重應(yīng)激；（2）盡量縮短運(yùn)輸時(shí)間；（3）避免在高溫季節(jié)運(yùn)輸；（4）長途運(yùn)輸前宜禁食2-3 d，以減少應(yīng)激時(shí)的耗氧量；（5）可在餌料中適當(dāng)添加維生素C、谷氨酰胺等抗應(yīng)激劑。此外，Verbeek等（2008）研究證實(shí)，魚類的早期應(yīng)激經(jīng)歷可增強(qiáng)其后期抗應(yīng)激的適應(yīng)能力，即通過適當(dāng)馴化可有效提高魚類的抗應(yīng)激能力；鄺哲師等（2011）、Bacarin等（2015）研究表明，餌料中添加乳酸菌、不飽和脂肪酸或魚油等也可改善魚類體質(zhì)，提高其抗應(yīng)激能力。因此，在餌料中適量添加益生菌或不飽和脂肪酸等，可能是提高四指馬鲅運(yùn)輸存活率的有效途徑之一。

4結(jié)論

運(yùn)輸脅迫導(dǎo)致四指馬鲅幼魚肝臟、鰓及脾臟組織損傷，抗應(yīng)激劑混合物雖然在一定程度上起到緩解作用，但并不能完全消除。