Myceliophthora thermophila 漆酶與木質(zhì)素模型物的對接研究

劉浩 孫見良 Puneet K. SINGH 楊文萍 付時(shí)雨

(1.華南理工大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院， 廣東 廣州 510640； 2.華南理工大學(xué) 數(shù)學(xué)學(xué)院， 廣東 廣州 510640)

漆酶(EC 1.10.3.2)是一類直接催化氧化酚類化合物成為游離基、同時(shí)還原O2成H2O的含銅多酚氧化酶．漆酶具有合成與降解雙重作用，一方面，漆酶氧化生成的游離基通過非催化偶聯(lián)作用生成聚合物，這是植物合成木質(zhì)素和昆蟲合成色素的重要途徑[1]；另一方面，真菌和少數(shù)細(xì)菌的漆酶利用小分子酚類底物作為天然介體，在體外降解木質(zhì)素，這是生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)[2]．漆酶的催化依賴其4個(gè)Cu離子組成的活性中心，其中T1Cu離子是還原性底物的氧化位點(diǎn)，有藍(lán)光(600 nm)吸收，呈電子順磁性；T2Cu離子沒有可見光吸收，也是電子順磁特征；T3Cu離子有2個(gè)，皆呈電子反磁性，它們與T2Cu離子組成三核銅簇，這是O2捆綁與還原的位點(diǎn)[3]．4個(gè)Cu離子與高度保守的氨基酸殘基結(jié)合，底物在T1Cu離子附近失去電子成為游離基，電子經(jīng)T1Cu離子和三核銅簇傳遞給O2，后者最終還原成H2O[3- 4]．

近年來，借助于分子模擬技術(shù)，人們對漆酶催化機(jī)理的研究不斷深入．在酶與配體相互作用方面，Chen等[5]將木質(zhì)素單體與Trametesversicolor(Tve)漆酶對接，計(jì)算得到的結(jié)合能因底物結(jié)構(gòu)不同而變化很大，推測是疏水作用而非氫鍵在特異性結(jié)合中起主要作用．Zhang等[6]的研究表明，苯酚通過氫鍵和疏水作用結(jié)合到Tve漆酶活性口袋中，而Triton X- 100與漆酶僅存在疏水作用，這種作用促進(jìn)了漆酶對水體中苯酚的催化降解．在空間位阻效應(yīng)方面，Prasad等[7]發(fā)現(xiàn)有些染料具有平面芳環(huán)結(jié)構(gòu)且分子尺寸大，因空間位阻而不能接近T1活性口袋，因而無法有效捆綁．Awasthi等[8]比較了Tve漆酶、植物漆酶與木質(zhì)素模型物對接的差異，發(fā)現(xiàn)配體與Tve漆酶結(jié)合較穩(wěn)定，四聚體仍能粘連在Tve漆酶活性口袋區(qū)，在植物漆酶上則隨時(shí)間變化逐漸從活性口袋區(qū)向外移出．通常配體的疏水(如—OCH3)和親水性官能團(tuán)(如—COOH)決定其進(jìn)入活性口袋的方向及捆綁的位點(diǎn)，但至今在漆酶分子模擬中關(guān)于官能團(tuán)因素還未得到研究．

分子模擬還常用于預(yù)測未知酶的結(jié)構(gòu)與功能、輔助分析酶的底物譜寬、篩選穩(wěn)定劑和抑制劑、指導(dǎo)定向進(jìn)化[9]．現(xiàn)有報(bào)道集中于細(xì)菌和擔(dān)子菌的漆酶，僅Melanocarpusalbomyces(Mal)、Thielaviaterrestris等少數(shù)幾種子囊菌的漆酶得到了研究，其二級結(jié)構(gòu)(特別是在底物捆綁口袋附近)與擔(dān)子菌漆酶存在顯著差異[10- 11]，因此有必要對子囊菌漆酶進(jìn)行更廣泛的結(jié)構(gòu)研究．Myceliophthorathermophila(Mth)也是一種重要的產(chǎn)漆酶子囊菌，由Aspergillussp.表達(dá)的Mth漆酶已在Novozyme A/S公司商品化生產(chǎn)，該酶耐熱性好，pH適宜范圍寬，在紙漿漂白、廢紙脫墨和纖維改性等方面的應(yīng)用已趨成熟[12- 13]，但Mth漆酶的結(jié)構(gòu)及與木質(zhì)素模型物的相互作用尚未見報(bào)道．文中運(yùn)用同源模建技術(shù)構(gòu)建Mth漆酶的3D模型，然后與木質(zhì)素模型物進(jìn)行分子對接，探討甲氧基、羧基和單體同鍵型(β-O- 4)聚合度對底物在T1活性口袋區(qū)捆綁的影響．

1 材料與方法

1.1 蛋白質(zhì)序列比對

從專利US7622287B2[14]中獲得Mth漆酶序列，編號MthNov．根據(jù)資料，含Mth漆酶基因的質(zhì)粒被克隆到Aspergillusoryzae中，再經(jīng)誘變育種得到高產(chǎn)菌株[15]，用于商品酶生產(chǎn)．另從NCBI Protein Database獲得2份Mth漆酶序列，Accession ID分別是AEO58496(含616個(gè)氨基酸殘基，文中編號為Mth616)和 AEO54598(595個(gè)殘基，文中編號為Mth595)．將MthNov、Mth616、Mth595與13種真菌漆酶的序列上傳至Clustal Omega在線工具做多序列比對，使用MEGA 6 軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹．

1.2 同源模建

將目標(biāo)蛋白質(zhì)的FASTA序列文件提交到Swiss-Model在線服務(wù)器，系統(tǒng)自動(dòng)生成模板列表后，選擇一致性較好的模板構(gòu)建3D模型結(jié)構(gòu)．分別用Swiss-Model提供的模型質(zhì)量復(fù)合評分函數(shù)(QMEAN4)、全球性模型質(zhì)量估測函數(shù)(GMQE)以及Ramachandran Plot在線軟件對模型的可靠性進(jìn)行評估．

1.3 分子對接

從PubChem數(shù)據(jù)庫下載木質(zhì)素單體模型物的3D構(gòu)象文件，并使用Chimera轉(zhuǎn)換為PDB格式．參考美國農(nóng)業(yè)部林產(chǎn)品實(shí)驗(yàn)室提供的木質(zhì)素模型物數(shù)據(jù)庫[16]，用ChemBio3D Ultra 14.0按最穩(wěn)定構(gòu)象繪制木質(zhì)素二聚體和寡聚體的3D模型．在Autodock v.1.5.6軟件中進(jìn)行分子對接，將中心設(shè)置在漆酶的T1Cu格點(diǎn)附近(0.728，5.862，13.760)，x、y、z值分別為70、126和70，保持Spacing值為0.375．最終對接的結(jié)果保存為DLG文件．在Autodock軟件中分析可能的對接位點(diǎn)，選擇能量最低的結(jié)合方式，保存為PDBQT文件，在Chimera和Ligplot v.1.4.5軟件中分別顯示底物在活性口袋的捆綁及與氨基酸殘基的相互作用．

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸序列比對

“*”表示完全一致，“：”表示相似度高，“.”表示相似度較低

分析Mth漆酶與其他真菌漆酶的同源性，得到系統(tǒng)發(fā)育樹(如圖2所示)．M.thermophila與M.albomyces、Thielaviaarenaria親緣關(guān)系最近，在發(fā)育樹中處于同一分枝，在分類學(xué)上同屬子囊菌綱糞殼菌目毛殼科．與毛殼科許多種屬相似，M.thermophila也是一類嗜熱營腐生菌，在細(xì)胞外分泌漆酶、纖維素酶、木聚糖酶，分解木質(zhì)纖維素能力強(qiáng)[21]．另外，子囊菌綱柔膜菌目核盤菌科的BotrytisAclada與M.thermophila的親緣關(guān)系也很近，它們都能通過產(chǎn)生木質(zhì)纖維素降解酶破壞植物組織，進(jìn)而引起嚴(yán)重的植物病害[22]．

圖2 M. thermophila漆酶的系統(tǒng)發(fā)育樹

對3個(gè)Mth漆酶序列進(jìn)行比較可以看出，MthNov和Mth616最接近，完全一致的氨基酸殘基占MthNov殘基總數(shù)的97.9%，二者最顯著的差異是Mth616的N端比MthNov多了47個(gè)氨基酸，因此，專利US7622287B2[14]公開的MthNov序列是可靠的．但Mth595與MthNov相差甚遠(yuǎn)，它們完全一致的氨基酸僅占MthNov殘基數(shù)的30.9%，由此推測，Mth595序列可能不是M.thermophila漆酶的序列．

2.2 同源模建

將氨基酸序列提交到Swiss-Model在線程序后，服務(wù)器篩選出模板并按Identity值排列．模板1gw0和3dkh得分最高，與MthNov的一致性超過74%，高于專利US7622287B2[14]用的Coprinuscinereus漆酶模板得到的分?jǐn)?shù)(56.5%)．1gw0和3dkh都是Mal漆酶，與Mth漆酶親緣關(guān)系近，1gw0是原株產(chǎn)生的單體蛋白[10]，3dkh是變異株基因表達(dá)在Saccharomycescerevisiae中產(chǎn)生的同源二聚體[18]．文中以1gw0作為模板來生成Mth漆酶(MthNov)的3D結(jié)構(gòu)(見圖3(a))，其中α螺旋和β折疊的氨基酸數(shù)分別為62和173．由于序列相似度高，MthNov Cu離子結(jié)合區(qū)和模板1gw0也高度一致，T1Cu離子結(jié)合位點(diǎn)也是His431、Cys503和His508，T1Cu活性口袋(見圖3(b))呈“回旋鏢”或“》”形，長約2 nm，寬約0.6 nm，長側(cè)拐點(diǎn)到兩個(gè)側(cè)端為強(qiáng)疏水區(qū)(橙紅色)，短側(cè)拐點(diǎn)附近為弱疏水區(qū)(燕麥棕色)．口袋內(nèi)部有3個(gè)槽，位于拐點(diǎn)附近的是疏水槽，離T1Cu離子最近，另外兩個(gè)是親水槽，其中一個(gè)沿著“回旋鏢”上側(cè)端深入蛋白質(zhì)分子內(nèi)部(稱為“內(nèi)槽”)，另一個(gè)在下側(cè)端且離蛋白表面很近(稱為“外槽”)．顯然，底物分子的大小受限于T1口袋的尺寸．從親、疏水角度看，T1口袋外緣是由5個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)圍成的，分別包含SGAP、E235、LLCG、LF和PFT等殘基或片段．其中Leu(L)和Phe(F)的疏水值>1[23]，組成口袋外緣強(qiáng)疏水區(qū)；Glu(E)、Gly(G)和Ala(A)的疏水值為0.4～0.9[23]，它們和親水殘基Ser(S)、Pro(P)組成口袋外緣的弱疏水區(qū)．口袋內(nèi)槽則處于兩個(gè)α螺旋之間，指向蛋白質(zhì)C末端的一段親水性無規(guī)則區(qū)．內(nèi)槽的Lys188和Trp507連同口袋邊緣的幾個(gè)殘基(Ala191、Pro192、Glu235、Phe371和Phe427)對酚類底物的有效捆綁十分重要[18]．

圖3 M. thermophila漆酶的3D結(jié)構(gòu)模型及Ramachandran Plot分析結(jié)果

Swiss-Model 在線程序提供GMQE和QMEAN4評分函數(shù)用于評價(jià)模型質(zhì)量．GMQE是相較于目標(biāo)模板的質(zhì)量估計(jì)，Mth漆酶模型的GMQE值為0.92，接近1，表明此模型十分接近實(shí)驗(yàn)值．QMEAN4提供Z分?jǐn)?shù)在PDB數(shù)據(jù)庫所有蛋白質(zhì)中的分布，數(shù)值越接近0質(zhì)量越高，Mth漆酶模型的QMEAN4值為0.27，接近于0．Meshram等[24]提出的P.cinnabarinus漆酶模型中，QMEAN4分?jǐn)?shù)只有0.83，Tamboli等[25]在對5種真菌漆酶和5種細(xì)菌漆酶做同源模建的基礎(chǔ)上，得到QMEAN4值在0.60～0.81之間．

文中還使用Ramachandran Plot法對Mth漆酶3D模型中每個(gè)氨基酸構(gòu)象的正確性進(jìn)行評估(見圖3(c)，圖中φ和ψ分別表示一個(gè)肽單元α碳左邊C—N鍵和右邊C—C鍵的旋轉(zhuǎn)角度).圖3(c)中，深藍(lán)色區(qū)域和深黃色區(qū)域分別表示脯氨酸(Pro)最適區(qū)和甘氨酸(Gly)最適區(qū)，落在這兩個(gè)最適區(qū)域內(nèi)的氨基酸數(shù)目越多，3D模型中氨基酸的構(gòu)象越可靠．淺藍(lán)色和淺黃色分別表示Pro允許區(qū)和Gly允許區(qū)，這些區(qū)域的氨基酸構(gòu)象是可信的．白色區(qū)域的點(diǎn)通常表示氨基酸的構(gòu)象不合理．對于Mth-Nov的模型，96.9%的氨基酸位于深藍(lán)和深黃區(qū)，剩余3.1%落在淺藍(lán)和淺黃區(qū)，沒有構(gòu)象錯(cuò)誤的氨基酸．

2.3 漆酶與木質(zhì)素模型物的分子對接

2.3.1 單體的捆綁位點(diǎn)及與氨基酸的相互作用

木質(zhì)素是對香豆醇(PA)、松柏醇(CA)和芥子醇(SA)經(jīng)酶催化聚合而成的天然高分子，這3種單體的疏水性和尺寸隨甲氧基數(shù)目依次增加．木質(zhì)素降解后會(huì)衍生出多種酚酸，包括對香豆酸、阿魏酸和芥子酸，其親水性好，可用作漆酶的介體[26]．研究中用這6種單體與Mth漆酶對接，結(jié)果(見表1)表明，這些單體均能進(jìn)入T1Cu活性口袋，側(cè)鏈端進(jìn)入親水的內(nèi)槽，芳環(huán)端靠近疏水槽和T1Cu離子．與單體捆綁的氨基酸殘基主要有Thr187、Lys188、Ser190、Gly191、Ala192、Phe371、Trp373、Trp507、His508和Gly511，其中單體Ⅰ-Ⅵ的酚羥基與Ala192的氨基以氫鍵結(jié)合，單體Ⅰ-Ⅲ的醇羥基與Lys188的伯氨基、Trp507的羧基形成氫鍵，單體Ⅳ-Ⅵ的羧基與Lys188氨基形成氫鍵．若脂肪鏈端的羥基轉(zhuǎn)變?yōu)轸然瑒tTrp507與單體的相互作用由原來的氫鍵變成疏水作用，結(jié)合能(絕對值)略有降低．

從甲氧基的角度來看，松柏基型與對香豆基型單體的結(jié)合能相近，但芥子基型的結(jié)合能明顯低于前兩者，其主要原因可能是芥子基的雙甲氧基形成空間位阻，影響了苯環(huán)與疏水氨基酸的相互作用．結(jié)合能反映酶與底物復(fù)合體的穩(wěn)定性，結(jié)合能趨于零，則底物不能有效捆綁、催化．但底物在活性口袋的捆綁是催化反應(yīng)的必要不充分條件，也就是說，捆綁不一定發(fā)生催化(如酶的抑制劑)，但催化必須首先捆綁底物．除結(jié)合能外，酚羥基鄰位基團(tuán)的供電子效應(yīng)也是影響漆酶催化木質(zhì)素模型物氧化效率的重要因素．根據(jù)D’Annibale等[27]的研究結(jié)果，擔(dān)子菌漆酶催化與芥子酸的最大反應(yīng)速率為2.98 μkat/mg，略高于阿魏酸(2.47 μkat/mg)，約是對香豆酸(0.526 μkat/mg)的6倍，其原因是甲氧基同時(shí)具有供電子共軛效應(yīng)和吸電子誘導(dǎo)效應(yīng)，供電子效應(yīng)居于主導(dǎo)，底物在T1Cu口袋區(qū)捆綁后失去電子，甲氧基的供電子效應(yīng)能促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，對漆酶起到活化的作用[27]．另外，Chen等[5]研究愈創(chuàng)木酚、2，6- 二甲氧基苯酚、香草醇、阿魏酸和芥子酸與Tve漆酶的分子對接時(shí)采用了盲對接的計(jì)算方式，這種做法更適合描述底物大量存在時(shí)酶與之結(jié)合的所有活性區(qū)域，但由于沒有集中在T1Cu活性口袋區(qū)，對接實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)合能很難與催化建立關(guān)系．

表1 M. thermophila漆酶與木質(zhì)素模型物的分子對接結(jié)果

2.3.2 二聚體和寡聚體的捆綁

木質(zhì)素單體通過多種C—C鍵和/或C—O—C鍵連接在一起，其中β-O- 4連接占比最高，如在樺木磨木木質(zhì)素中，β-O- 4結(jié)構(gòu)占60%，其次是β-β′連接(占8%)[28]，單體的聚合度和連接方式共同決定了木質(zhì)素的3D結(jié)構(gòu)．研究中使用了CA(β-O- 4)SA二聚體(Ⅶ)、CA(β-O- 4)SA(β-β)SA三聚體(Ⅷ)和CA(β-O- 4)SA(β-β)SA(4- O-β)CA四聚體(Ⅳ)．二聚體Ⅶ能進(jìn)入T1Cu活性口袋，其方向與單體相似，若用M1和M2分別表示含酚羥基和脂肪鏈的兩個(gè)苯丙烷單元，則M2的脂肪鏈羥基端伸向內(nèi)槽親水區(qū)，與Trp373氫鍵結(jié)合，M2的甲氧基、芳環(huán)和側(cè)鏈分別與Ala192、Glu235和Phe371存在疏水作用力，M1的醇羥基與口袋內(nèi)疏水槽中的Leu296形成氫鍵，M2的酚羥基端則與口袋邊緣的兩個(gè)氨基酸Ala452和Asn454結(jié)合．

隨著聚合度的增加，木質(zhì)素模型物在口袋區(qū)的結(jié)合能逐漸降低(數(shù)據(jù)見表1)，聚合度與結(jié)合能呈線性關(guān)系，反映了口袋尺寸對底物大小的限制，即空間位阻效應(yīng)．表1中三聚體和四聚體的捆綁構(gòu)象圖直觀地反映了空間位阻帶來的影響．三聚體與二聚體不同，所有單體的脂肪鏈都參與了醚鍵和C—C鍵的形成，代之以M3苯丙烷單元的芳環(huán)端與Trp373氫鍵結(jié)合，由于醚鍵和C—C鍵造成了分子鏈的彎曲，M1的芳環(huán)端無法進(jìn)入活性口袋，只能在口袋邊緣與Gly295、Leu296和Leu297形成疏水性結(jié)合．因氫鍵數(shù)目少，三聚體Ⅷ的結(jié)合能顯著低于單體或二聚體．而四聚體尺寸更大，無法進(jìn)入口袋，只能在外緣與Ser190和Gly295結(jié)合，其疏水基團(tuán)不能充分地與氨基酸捆綁，結(jié)合能接近于零，因此，酶與四聚體的復(fù)合體不穩(wěn)定，難以直接催化氧化，這就需要小分子介體，包括人工合成的化合物和天然化合物(如對香豆酸、香草醛、紫丁香酮等)[2，26]．

在相關(guān)的研究報(bào)告中，Martínez-Sotres等[29]論證了三聚體CA(β-O- 4)CA′(β-O- 4)CA′′在Tve漆酶T1Cu活性口袋區(qū)是有效捆綁的．Awasthi等[8]報(bào)道了4種聚合度的木質(zhì)素模型物在Tve漆酶的對接，分別是SA單體、G(4- O- 5)G′二聚體、S(β-O- 4)S′(β-O- 4)SA三聚體和G(β-O- 4)S(β-β)S′(β-O- 4)G′四聚體，其中G和S分別表示愈創(chuàng)木基和紫丁香基，盡管分子模擬證明了空間位阻效應(yīng)，但由于二聚體和四聚體中都沒有苯丙烷結(jié)構(gòu)，分子量低于文中使用的模型物Ⅶ-Ⅸ，其結(jié)論指出由G和S組成的四聚體能有效結(jié)合在Tve漆酶的底物口袋區(qū)，顯然，這不能用來推測或解釋木質(zhì)素苯丙烷基模型物的捆綁行為．

3 結(jié)論

文中使用分子模擬手段從分子水平層面分析了Myceliophthorathermophila漆酶與木質(zhì)素模型物的相互作用，得到以下結(jié)論：①M(fèi)th漆酶的Cu離子結(jié)合位點(diǎn)由高度保守的4個(gè)氨基酸片段組成，其與Melanocarpusalbomyces漆酶親緣關(guān)系最近，序列一致性高于74%；②以Mal漆酶為模板可構(gòu)建出高質(zhì)量的Mth漆酶模型，QMEAN4和GMQE函數(shù)評分分別為0.27和0.92，Ramachandran Plot分析證明所有氨基酸構(gòu)象位于合理區(qū)域；③木質(zhì)素苯丙烷結(jié)構(gòu)單體通過氫鍵與Mth漆酶T1Cu活性口袋區(qū)的Ala192、Lys188和Trp507結(jié)合，單體脂肪鏈深入口袋內(nèi)槽，酚羥基端指向疏水槽，脂肪鏈端羧基化會(huì)影響Trp507位點(diǎn)形成氫鍵，而酚羥基鄰位若被兩個(gè)甲氧基取代，會(huì)降低單體的結(jié)合能；④模型物的聚合度越高，結(jié)合能越接近零，二者具有線性相關(guān)性，三聚體仍能進(jìn)入活性口袋，但四聚體因空間位阻不能在口袋區(qū)有效捆綁，需要介體才能被Mth漆酶催化氧化．

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