雞骨草中生物堿的提取與測定

陳冉　彭冰　李德慧

[摘要] 目的 優(yōu)化雞骨草中生物堿的提取工藝，建立相思子堿、下箴刺桐堿的超高效液相色譜（UHPLC）測定方法。 方法 以相思子堿、下箴刺桐堿的提取量為指標，采用正交試驗設計考察乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)對提取工藝的影響；色譜條件：Shim-pack XR-ODS Ⅱ色譜柱（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水-乙酸-三乙胺（6∶2∶92∶0.2∶0.3）；檢測波長280 nm；流速0.4 mL/min；進樣量2 μL；柱溫30℃。結果 最佳提取條件為加10倍量45%乙醇，提取時間40 min，超聲提取2次；相思子堿和下箴刺桐堿分別在1.49～148.80 μg/mL（r=0.9998），0.84～84.20 μg/mL（r=0.9998）范圍內有良好的線性關系，加樣回收率為98.9%、98.2%，RSD均<2%。 結論 本提取方法簡單、快速、效率高；測定方法準確、高效；不同產(chǎn)地雞骨草中相思子堿、下箴刺桐堿含量差異明顯，以根部含量最多，其次為莖部，最少的部位是葉子。為雞骨草藥材的有效開發(fā)利用和質量控制提供了參考依據(jù)。

[關鍵詞] 雞骨草；超聲提取法；相思子堿；下箴刺桐堿；超高效液相色譜；正交試驗

[中圖分類號] R284.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）12（c）-0145-04

[Abstract] Objective To optimize extraction technology of alkaloids in Abrus cantoniensis Hance. Establish UHPLC for the determination of abrine and hypaphorine. Methods With abrine and hypaphorine as index ingredients， orthogonal test was used to investigate the effects of ethanol concentration， solid-liquid ratio， extraction time， extraction times on extraction technology. The analysis was performed on Shim-pack XR-ODS Ⅱ column （2.0 mm×75 mm， 2.2 μm） with the mobile phase of methanol and acetonitrile - water - acetic acid - triethylamine （6∶2∶92∶0.2∶0.3） at a flow rate of 0.4 mL/min. The injection volume was 2 μL. The detection wavelength was 280 nm and the column temperature was 30 ℃. Results The optimal conditions for the extraction technology were as follows： ultrasonic extraction for two times， each time for 40 min with 10 times the amount of 45% ethanol. Abrine and hypaphorine had good linear relationship within 1.49-148.80 μg/mL （r = 0.9998）， 0.84-84.20 μg/mL （r = 0.9998）， respectively. The sample recoveries were 98.9% and 98.2% ， and RSD was less than 2%. Conclusion This extraction method was simple， rapid and high efficiency. Quantitative determination method was accurate and efficient. It had a obvious difference for contents of abrine and hypaphorine in Abrus cantoniensis Hance from different areas and different parts with root ﹥stem﹥leaf. The result provided a reference for effective development and quality control of Abrus cantoniensis Hance.

[Key words] Abrus cantoniensis Hance； Ultrasonic extraction； Abrine； Hypaphorine； UHPLC； Orthogonal test

雞骨草（Abrus cantoniens Hance）為豆科植物廣州相思子，主要分布于廣東、廣西等南方區(qū)域，具有清熱解毒、疏肝止痛之功效，對治療急慢性肝炎、胃痛、風濕骨病、肝硬化腹水等有顯著效果，是臨床常用中藥，許多以雞骨草為主的制劑已作為成藥上市[1-3]。研究表明[4-7]，雞骨草含有大量的生物堿類物質，在保肝護肝、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等方面有較強的生物活性，然而目前關于雞骨草中生物堿的提取方法有待進一步研究。相思子堿、下箴刺桐堿作為生物堿類代表性成分，具有較好的抗炎、免疫增強和抗肝損傷等作用[8-10]。超聲波法利用空化效應、熱效應和機械振動等作用，大大提高目標組分的提取效率、縮短提取時間，在中草藥的研究中得到廣泛應用[11-13]。本實驗擬建立雞骨草中相思子堿、下箴刺桐堿的超高效液相快速定量分析方法，以兩者的提取量為考察指標，采用正交試驗結合超聲波法考察各因素對生物堿提取率的影響，優(yōu)選最佳提取工藝，并分析比較不同產(chǎn)地和不同部位雞骨草中相思子堿、下箴刺桐堿的含量，以期為雞骨草的開發(fā)利用和完善雞骨草及其產(chǎn)品的質量控制提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

雞骨草藥材分別購于廣西貴港、柳州、桂林、玉林、賀州、梧州等地，由右江民族醫(yī)學院藥學院黃鎖義教授鑒定為豆科植物廣州相思子，將根、莖、葉分開，干燥后粉碎，過40目篩，保存?zhèn)溆谩?/p>

LC-30A超高效液相色譜儀（島津），KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），F(xiàn)A2004N型電子分析天平（上海民析精密科學儀器公司），101-3型電熱鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器公司），F(xiàn)Wl77型中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司），XH-100A微波催化萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）。

相思子堿對照品（百靈威，批號：LI50P81）、下箴刺桐堿對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：P26 N6F6550）；乙腈、甲醇為色譜純，乙醇、磷酸、三乙胺為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 方法學考察

2.1.1 色譜條件 Shim-pack XR-ODS Ⅱ色譜柱（2.0 mm×75 mm，2.2 μm）；流動相：甲醇-乙腈-水-乙酸-三乙胺（6∶2∶92∶0.2∶0.3）；檢測波長280 nm；流速0.4 mL/min；進樣量2 μL；柱溫30℃。對照品和供試品溶液的色譜圖，見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品相思子堿7.44 mg、下箴刺桐堿4.21 mg分別置于10 mL的容量瓶中，用甲醇溶解、定容，配制成0.744、0.421 mg/mL的儲備液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取貴港雞骨草莖的粉末，精密稱取1.00 g，加10 mL 45%乙醇超聲提取40 min，提取功率250 W，重復提取2次，合并提取液，用45%乙醇定容，過0.22 μm微孔濾膜，作為供試品溶液，待測。

2.1.4 線性關系考察 分別吸取0.02、0.05、0.2、0.6、1.0、2.0 mL已配好的2種對照品儲備液，置10 mL量瓶中，用甲醇定容，得系列不同質量濃度的混合對照品溶液，按“2.1.1”項下條件測定，以峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，得回歸方程分別為Y=4127.4X-5368.9（r=0.9998），Y=4003.5X-4999.5（r=0.9997），線性范圍依次為1.49～148.80，0.84～84.20 μg/mL。

2.1.5 精密度試驗 取同一對照品溶液，連續(xù)進樣6次，測定峰面積，相思子堿和下箴刺桐堿峰面積的RSD為0.88%、0.95%。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣測定，結果相思子堿、下箴刺桐堿的峰面積的RSD為1.26%、1.31%，表明樣品溶液在24 h內穩(wěn)定。

2.1.7 重復性試驗 精密稱取6份雞骨草，按“2.1.3”項下供試品溶液的制備方法制備，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算峰面積的RSD。結果相思子堿和下箴刺桐堿的RSD為1.69%、1.89%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.1.8 回收率試驗 精密稱取6份已知相思子堿、下箴刺桐堿含量的樣品，每份1.00 g，分別加入一定量相思子堿、下箴刺桐堿對照品溶液，按“2.1.3”項下供試品溶液的制備方法制備，按“2.1.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結果相思子堿平均回收率為98.9%、RSD為1.76%，下箴刺桐堿平均回收率為98.2%、RSD為1.94%，表明該方法回收率較好。

2.1.9 進樣量考察 取同一對照品溶液，分別按1.0、2.0、4.0、8.0 μL體積進樣，觀察相思子堿、下箴刺桐堿的色譜峰型，結果當進樣體積超過2.0 μL時，峰型展寬較為嚴重，最終選擇進樣量為2.0 μL。

2.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，以相思子堿、下箴刺桐堿的提取量為評價指標，選取乙醇體積分數(shù)、料液比、提取時間、提取次數(shù)為考察因素。分別精密稱取雞骨草莖粉末1.00 g，每組試驗平行3份，按正交實驗L9（34）設計因素水平，見表1，試驗結果和方差分析見表2～表3。

由直觀分析可知，相思子堿和下箴刺桐堿的最優(yōu)提取工藝分別為A3B2C3D3、A3B1C3D2。方差分析結果表明，A和D因素對相思子堿和下箴刺桐堿的提取率有顯著影響，B和C因素對相思子堿影響很小，而對下箴刺桐堿的影響明顯。在單因素預試驗中，當D因素超過2次時，提取率變化較小，綜合考慮最終確定最佳工藝組合為A3B1C3D2，即加10倍量45%的乙醇，提取時間40 min，超聲提取2次。

2.3 驗證試驗

精密稱取雞骨草莖粉末1.00 g，按優(yōu)選的工藝條件提取，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果相思子堿、下箴刺桐堿提取量的RSD為0.76%、0.83%。說明該工藝穩(wěn)定性和重復性較好，操作簡單。

2.4 不同提取方法效果比較

采用文獻中的索氏回流法（加50倍量100%甲醇回流2 h）[14]、浸提法（加20倍量95%乙醇于20℃浸提24 h）[15]和微波輔助法（加10倍量25%甲醇于50℃，1000 r/min，300 W提取10 min）[16]，提取雞骨草中的相思子堿、下箴刺桐堿，結果本實驗方法提取效果遠高于索氏回流法和浸提法，稍高于微波輔助法。雖然微波輔助法的提取時間短，但加料處理時間較長。超聲法具有提取效率高、提取速度快的特點。

2.5 不同產(chǎn)地和不同藥用部位雞骨草中相思子堿、下箴刺桐堿含量的比較

取不同產(chǎn)地不同部位雞骨草粉末，分別精密稱取1.00 g，每組平行做3份，按優(yōu)選的工藝條件提取，按“2.1.1”項下色譜條件測定，結果見表4。

由表4中數(shù)據(jù)可知，不同產(chǎn)地雞骨草中相思子堿、下箴刺桐堿的含量有明顯差異；相同產(chǎn)地不同批次也不相同，這可能是由于藥材的種植方法和干燥方法不同，但總的來說，以貴港產(chǎn)地的含量最高。相思子堿、下箴刺桐堿的含量以根部最多，其次為莖部，葉子部分最少；且莖和葉中相思子堿的含量均遠高于下箴刺桐堿的含量；而對于根部，少部分產(chǎn)地下箴刺桐堿的含量高于相思子堿的含量。

3 討論

3.1 色譜方法

構建超高效液相色譜方法測定雞骨草中相思子堿和下箴刺桐堿，目標物在6 min內出峰，以280 nm作測定波長，不僅吸光度高，而且干擾峰少，與文獻報道方法相比，建立了一種更加快速、高效、經(jīng)濟的分析方法[14]。

3.2 提取條件優(yōu)化

乙醇因價格低廉、毒性小，被選作提取溶劑。乙醇的濃度和提取次數(shù)是影響相思子堿和下箴刺桐堿提取效率的關鍵因素，料液比對提取效率的影響較小，但提取液太少，不能保證藥材被充分浸透，會降低提取效率。相思子堿和下箴刺桐堿分子結構中均含有叔胺基，理論上可通過向提取液中加酸，使分子中的叔胺基得質子而帶電荷，增加水溶性，從而改善提取效果[17-19]。但本實驗發(fā)現(xiàn)加各種酸均不能改善提取效果。這可能是由于分子中的叔胺基和羧基距離較近，在酸性條件下會形成分子內氫鍵，降低水溶性[20]。因此提取液不添加酸，最佳超聲提取工藝為加10倍量45%乙醇超聲提取40 min、提取2次。為雞骨草中相思子堿和下箴刺桐堿等生物堿類成分的提取提供一種簡單、節(jié)能、高效的方法。

3.3 樣品含量的測定

研究結果表明，不同產(chǎn)地的雞骨草中相思子堿和下箴刺桐堿的含量差別較大，并且以根部最多，其次為莖部，最少的部分是葉子。相思子堿和下箴刺桐堿作為雞骨草極具代表性的活性成分，可通過檢測其含量為雞骨草藥材的質量控制和有效開發(fā)利用提供一定參考依據(jù)。

[參考文獻]

[1] 白隆華，董青松，蒲瑞翎.中藥雞骨草研究概況[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2005，36（5）：476-478.

[2] 洪旭偉，陳惠蘭，李婧宜，等.雞骨草防治脂肪性肝病作用的研究進展[J].中草藥，2014，37（8）：1491-1494.

[3] 趙平，葉志文，何丹璇，等.雞骨草膠囊對大鼠肝纖維化的保護作用研究[J].中國實驗方劑學雜志，2009，15（10）：99-101.

[4] 史海明，溫晶，屠鵬飛.雞骨草的化學成分研究[J].中草藥，2006，37（11）：1610-1613.

[5] 賴紅芳，鄧秋芬.半仿生法提取雞骨草中總三萜酸的工藝優(yōu)選[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（24）：46-48.

[6] 黃勇斌，孫毅東，李耿，等.雞骨草藥材指紋圖譜研究[J].今日藥學，2011，21（5）：280-301.

[7] 黃凱文，吳菲，李常青，等.雞骨草對非酒精性脂肪肝大鼠肝組織SREBP-1c表達的影響[J].中藥材，2015，38（11）：2368-2371.

[8] Yang M，Al Zaharna M，Chen YS，et al. In vitro antioxidant activities and anti-proliferative properties of the functional herb Abrus cantoniensis and its main alkaloid abrine [J]. Food Funct，2014，5（9）：2268-2277.

[9] 鐘正賢，李燕婧，陳學芬，等.相思子堿的藥理作用研究[J].中醫(yī)藥導報，2009，15（1）：8-10.

[10] 陳學芬，鐘正賢，李燕婧，等.海帕刺桐堿藥理作用的研究[J].中國中醫(yī)藥科技，2009，16（5）：372-373.

[11] 趙偉杰.川黃柏中鹽酸小檗堿提取新工藝的研究[J].中國醫(yī)藥導報，2015，12（34）：38-42.

[12] 馬爽，趙巖，趙曉紅，等.中心組合設計-響應面分析法優(yōu)選黃芩中黃芩苷的超聲提取工藝[J].中國醫(yī)藥導報，2014，11（9）：142-145.

[13] 張平，李春陽，袁旭江.響應面法優(yōu)化毛雞骨草葉中黃酮成分提取工藝[J].中成藥，2015，37（10）：2328.

[14] 史海明，黃志勤，溫晶，等.HPLC法測定雞骨草藥材中相思子堿的含量[J].藥物分析雜志，2007，27（11）：1716-1718.

[15] 程瑛琨，陳勇，王璐，等.正交設計優(yōu)選雞骨草總黃酮和總生物堿的提取工藝[J].西北藥學雜志，2007，2（22）：61-62.

[16] 邱賀媛，肖小華，李攻科.微波輔助提取-高效液相色譜分析制備雞骨草中相思子堿和下箴刺桐堿的研究[J].分析科學學報，2011，27（3）：284-288.

[17] 呂志強，李喬，劉洪玲，等.正交試驗優(yōu)選桑籽中總生物堿、總黃酮及粗多糖的提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（14）：27-30.

[18] 陸世惠，李秀霞.超聲-酶法提取兩面針中氯化兩面針堿的研究[J].中成藥，2013，35（4）：841-844.

[19] 任玉蘭，李曉玲，游佳，等.土茯苓中總生物堿的提取工藝研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學，2015，54（12）：2994-2996.

[20] 王鋒鵬.現(xiàn)代天然產(chǎn)物化學[M].北京：科學出版社，2009： 862-891.

（收稿日期：2016-09-16 本文編輯：王紅雙）