炮制時間對何首烏16個成分含量變化影響的研究

趙夢杰　龔小紅　黨玨　袁岸　李燕　羅林　劉美辰　李蕓霞

[摘要] 為研究48 h的炮制時間對何首烏中成分的含量及變化影響。采用HPLC測定22個不同炮制時間的何首烏對比市售制首烏中各成分的含量，并采用指紋圖譜相似性分析和聚類分析對測定結(jié)果進行特征分析。結(jié)果顯示，相似度均在0.9～1.0，各個樣本之間有較好的相關(guān)性。聚類分析方法將22個制首烏和生首烏樣品基本按成分變化特征聚為4類。該研究發(fā)現(xiàn)4～5 h為何首烏最佳炮制時間，為何首烏的質(zhì)量控制以及深入研究提供參考依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 何首烏； 炮制時間； 相似性分析； 聚類分析

Effect of processing time of Polygoni Multiflori Radix on

content changes of 16 componens

ZHAO Mengjie， GONG Xiaohong， DANG Jue， YUAN An， LI Yan， LOU Lin， LIU Meichen， LI Yunxia*

（The Ministry of Education Key Laboratory of Standardization of Chinese Herbal Medicine， State Key Laboratory

Breeding Base of Systematic Research， Development and Utilization of Chinese Medicine Resources Cofounded by Sichuan

Province and Ministry of Science and Technology of the People′s Republic of China Pharmacy College，

Chengdu University of Traditional Chinese Medicine， Chengdu 611137， China）

[Abstract] To study 48 h processing time of Polygoni Multiflori Radix on its contents and changes of chemical components. HPLC was used to determine the contents of various components in 22 Polygoni Multiflori Radix samples with different processing time， and then the fingerprint similarity analysis and clustering analysis were used for characteristics analysis. Results showed that the similarity was between 0.91.0， with good correlation between the samples. In the clustering analysis， the 22 Polygoni Multiflori Radix and processed Polygoni Multiflori Radix samples were classified into 4 types according to the composition changes. The results demonstrated that 45 h was the best processing time， providing references for quality control and further study of Polygoni Multiflori Radix.

[Key words] Polygoni Multiflori Radix； processing time； similarity analysis； clustering analysis

何首烏為蓼科植物何首烏Polygonum multiflorum Thunb.的干燥塊根，制首烏為何首烏炮制品，性微溫，味甘、澀，歸肝、腎經(jīng)，具有補肝腎、益精血、烏須發(fā)、強筋骨、化濁降脂等功效，臨床常用于治療肝腎不足、精血虧虛、須發(fā)早白等[1]。近年來何首烏致肝損傷報道快速增長[23]，引起國內(nèi)外的高度關(guān)注。古代強調(diào)何首烏“制非九次，勿寢其毒”，作為典型的生熟異治中藥[4]，何首烏臨床效用的安全發(fā)揮很大程度上受制于其炮制工藝的規(guī)范性與可靠性[5]。何首烏古代炮制強調(diào)九蒸九曝，而現(xiàn)代工藝已化簡為僅蒸1次，這其中的差異環(huán)節(jié)是否為何首烏肝損傷事件增多的潛在原因？本文為建立和完善制何首烏質(zhì)量評價標準，全面考察了不同炮制時間的何首烏中二苯乙烯苷類、游離蒽醌、結(jié)合蒽醌、以及其他主要成分的含量及其變化規(guī)律從而為確定何首烏合適的炮制時間提供參考，并期待建立何首烏炮制減毒工藝規(guī)范提供研究依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀器（泵G1312B，DEACB07224；進樣器G1329B，DEAAC25245；柱溫箱G1316A，DEACN27098；紫外檢測器G4212BDEAA307363 美國Agilent公司）；KQ500DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius 11D型電子分析天平（德國Sartorius公司）；隔膜真空泵（天津市津騰實驗設(shè)備有限公司）。

1.2 試藥與試劑

沒食子酸（批號150226），原花青素B1（批號140628），兒茶素（批號141224），沒食子酸酯（批號140730），蘆薈大黃素8OβD葡萄糖苷（批號141225），虎杖苷（批號141228），2，3，5，4二苯乙烯苷（批號141121），土大黃苷（批號141209），白藜蘆醇（批號150122），大黃素8OβD葡萄糖苷（批號141209），大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷（批號150120），大黃酚（批號140325），純度>98%，均購置于成都克洛瑪生物有限公司。蘆薈大黃素（批號MUST10112301），大黃酸（批號MUST11032801），大黃素（批號MUST12022715），大黃素甲醚（批號MUST12022005），純度>98%，均購置于曼斯特生物科技有限公司。無水乙醇（批號20140928）購置于成都科龍化工有限公司。甲酸、乙腈均為色譜級，購于Fisher公司。其他試劑均為分析純。

1.3 藥材

生何首烏藥材購置四川省巴中市藥材市場，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)生藥學(xué)研究室裴瑾教授鑒定為蓼科植物何首烏P. multiflorum的干燥塊根。

2 方法

2.1 供試品溶液的制備

按《中國藥典》2015年版規(guī)定，稱取黑豆1.0 kg，10倍量水浸泡30 h后，加水煮約4 h，過濾，濾渣加8倍量水煎煮3 h后過濾，合并濾液，濃縮成約2.50 kg。

何首烏黑豆汁4∶1，取一定量大小相近的何首烏塊，先用黑豆汁拌勻，隔水加熱蒸制，分別于1，2，3，4，5，6，7，8，10，12，14，16，18，20，24，28，32，34，36，40，44，48 h分別取出適量何首烏塊，晾曬至干，平行3份。各時間點炮制品以及同仁堂售制首烏分別打成粗粉備用。

精密稱取各粗粉0.25 g，置具塞三角瓶中，加20倍量50%乙醇，浸泡30 min后，40 ℃下超聲提取60 min，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液進樣。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品沒食子酸、原花青素B1，兒茶素、沒食子酸酯、蘆薈大黃素8OβD葡萄糖苷、虎杖苷、2，3，5，4二苯乙烯苷、土大黃苷、白藜蘆醇、大黃素8OβD萄糖苷、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚于10 mL量瓶中，甲醇定容至刻度，配置成質(zhì)量濃度分別為131，98，185，142，78，125，5 400，142，94，750，86，71，81，500，25，88 μg·L-1的對照品儲備液，4 ℃低溫保存。

2.3 色譜條件

ZORBAX C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），ZORBAX C18預(yù)柱（4.6 mm×12.5 mm，5 μm）；流速1.0 mL·min-1；柱溫30 ℃；進樣量5 μL； 流動相A為0.1%甲酸水，B為乙腈，梯度洗脫（0～5 min，5%～10% B；5～30 min，10%～22% B；30～38 min，22%～25% B；38～48 min，25%～32% B；48～55 min，32%～45% B；55～65 min，40%～85% B；65～70 min，85%～95% B；70～72 min，95% B）；檢測波長275 nm。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用國家藥典委員會推薦的中藥指紋圖譜計算機輔助相似度評價軟件2004年A版進行各個炮制時間樣品的相似度分析；采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行各個炮制時間樣品進行系統(tǒng)聚類分析。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

3.1.1 何首烏各成分標準曲線制備 精密吸取何首烏16個對照品儲備液適量，將對照品儲備液進行梯度稀釋，得到一系列濃度的標準溶液，按2.3項下的液相條件對各成分的峰面積進行測定，每個濃度平行進樣3次，峰面積平均值為縱坐標，濃度為橫坐標，計算得到各成分的標準曲線以及線性范圍，結(jié)果見表1。

3.1.2 精密度 精密吸取沒食子酸、原花青素B1，兒茶素、沒食子酸酯、蘆薈大黃素8OβD葡萄糖苷、虎杖苷、2，3，5，4二苯乙烯苷、土大黃苷、白藜蘆醇、大黃素8OβD萄糖苷、大黃素甲醚8OβD葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素、大黃素甲醚對照品，按照2.3項下色譜條件進行分析。考察各成分的日內(nèi)精密度以及連續(xù)3 d的日間精密度，計算各成分的RSD，結(jié)果見表2。

由表2可知，各成分的日內(nèi)以及日間精密度RSD均小于6.0%，儀器精密度良好。

3.1.3 重復(fù)性、穩(wěn)定性以及回收率 取同一批生何首烏藥材，按照2.1項下供試品溶液制備方法制備進樣，進行重復(fù)性考察，各成分的RSD結(jié)果見表3；分別在0，3，6，9，12，24 h進樣，考察樣品穩(wěn)定性，計算各成分的RSD結(jié)果見表3；取已知含量的樣品，加入已知濃度的對照品適量，采用A=（A樣+標-A樣）/ A標×100%計算公式計算各成分的回收率，結(jié)果見表3。

由表3可知，何首烏各成分，RSD均小于5%，回收率值均在93.99%～107.7%，表明在該分析方法條件下各成分的重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，同時具有較好的回收率。

3.2 何首烏炮制前后成分的變化

取2.1項下的生何首烏以及21個不同炮制時

間的制首烏樣品進行含量測定。每個樣品重復(fù)測定3次，峰面積代入標準曲線方程進行計算，得到16種成分的含量，結(jié)果見表4。

3.3 構(gòu)建對照指紋圖譜

采用中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)研究版（2004年A版）對22個不同炮制時間的何首烏樣品的指紋圖譜進行相似度計算，采用中位數(shù)法，時間窗寬度為 0.2 min，獲得對照圖譜R和22個不同時間樣本的色譜疊加圖，見圖1，計算機輔助相似度評價報告結(jié)果見表5。

通過中藥指紋圖譜的評價系統(tǒng)建立起來的對照指紋圖譜與樣品指紋圖譜整體性（保留時間和峰面積）進行相似性比較，相似度一般在≥0.9認為符合要求。各炮制時間樣本在一定的保留時間誤差范圍內(nèi)（0.2 min）的都能與生成的對照指紋圖譜有較好的重疊，各炮制時間的何首烏有較好的相似度。

3.4 聚類分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行系統(tǒng)聚類分析，以中心質(zhì)位數(shù)為組群合并準則，平方歐氏距離為度量，聚類結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示何首烏不同炮制時間的樣本共聚分為4類。

從圖2看出，通過何首烏16種成分的聚類分析，基本反映不同炮制時間的何首烏成分變化特征。炮制時間為14，16，18，20，24，28 h的樣本烏很好地聚為第一類；炮制時間為32，36，40，44，48 h的樣本聚為第二類；炮制時間為4，5 h的樣本聚為第三類；炮制1，2，3，6，7，8，10，12 h的樣本聚為4類。結(jié)合何首烏成分含量分析，隨著炮制時間的變化何首烏成分變化呈先增加后降低，隨后趨于穩(wěn)定的的變化趨勢，炮制到4～5 h何首烏成分的含量達到最高值，隨著炮制時間延長，成分含量呈現(xiàn)下降趨勢，炮制到12 h后成分變化趨于穩(wěn)定。

4 討論

炮制時間的長短與何首烏的顏色有密切關(guān)系，炮制時間越長，顏色逐漸烏黑發(fā)亮，與相關(guān)報道一致[6]，其飲片外觀和粉末顏色基本一致，表明炮制后飲片內(nèi)外質(zhì)量保持一致。

炮制時間對結(jié)合蒽醌類成分含量影響很大，結(jié)合蒽醌有很強的瀉下作用，隨著炮制時間的延長，其結(jié)合蒽醌含量明顯降低，研究發(fā)現(xiàn)炮制約4～5 h時，結(jié)合蒽醌類成分降低幅度最大，為達到增效減毒的目的，初步將炮制時間設(shè)定4～5 h。與文獻[7]取得類似結(jié)果，避免高溫高壓對何首烏藥材成分產(chǎn)生較大影響，本文所述炮制方法與高壓蒸制相比，更適用應(yīng)用于臨床。

[參考文獻]

[1] 中國藥典. 一部[S]. 2015： 175.

[2] 李春，蘇曉，馮偉紅，等.基于UPLCESIMS/MS的何首烏中12種真菌毒素污染檢測[J].中國中藥雜志，2016，41（23）：4368.

[3] 王伽伯， 肖小河， 杜曉曦， 等. 基于轉(zhuǎn)化毒理學(xué)的中藥肝損害客觀辨識與早期診斷[J]. 中國中藥雜志， 2014， 39 （1）： 5.

[4] 崔鶴榮， 柏兆芳， 宋海波， 等. 從古今炮制方法演變探討何首烏都行的潛在影響因素[J]. 中國中藥雜志， 2016， 41 （2）： 333.

[5] 馬致潔， 李曉菲， 呂旸， 等. 基于干細胞毒性檢測的何首烏炮制工藝比較研究[J]. 中國中藥雜志，2015，40（12）：2325.

[6] 金嘉文， 陳有軍， 劉梅， 等. 何首烏與制何首烏補血作用及HPLC指紋圖譜的比較[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2013， 19 （8）： 206.

[7] 劉世琪， 王磊， 越亮. 高壓炮制對何首烏中有效成分含量的影響[J]. 中國實驗方劑學(xué)雜志， 2013， 19 （21）： 37.

[責任編輯 孔晶晶]