多重位點(diǎn)特異性PCR鑒別人參、三七、西洋參摻雜

蔣超　羅宇琴　袁媛　黃璐琦　金艷　趙玉洋

[摘要] 為建立一種能同時(shí)鑒別人參、三七、西洋參及其摻雜品的方法。通過(guò)分析人參屬ITS，18S和matK序列，尋找特異性SNP位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，建立多重位點(diǎn)特異性PCR法，并對(duì)不同來(lái)源的人參、三七、西洋參樣品進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)特異性條帶大小進(jìn)行鑒別。在退火溫度為60 ℃，循環(huán)數(shù)為35時(shí)，人參、三七和西洋參分別出現(xiàn)約250，500，1000 bp的特異性條帶。該方法對(duì)于人參、三七、西洋參相互摻雜的混合樣品，人參中摻雜三七或西洋參以及三七中摻雜西洋參或人參的檢出限均為0.5%，對(duì)西洋參中摻雜人參的檢出限為0.5%，摻雜三七的檢出限為1%。表明建立的多重位點(diǎn)特異性PCR可用于人參、西洋參、三七的摻雜鑒定。

[關(guān)鍵詞] 人參； 西洋參； 三七； 多重位點(diǎn)特異性PCR； 摻偽； 分子鑒定

Identification of Panax ginseng， P. notoginseng and P. quinquefolius

admixture by multiplex allelespecific polymerase chain reaction

JIANG Chao， LUO Yuqing， YUAN Yuan*， HUANG Luqi， JIN Yan， ZHAO Yuyang

（State Key Laboratory of Daodi Herbs Breeding Base， National Resource Center for Chinese

Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China）

[Abstract] To achieve a molecular method to identify Panax ginseng， P. notoginseng，P. quinquefolius and their admixture. The ITS，18S and matK sequences of Panax genus were analyzed to develop speciesspecific SNP marker. Three pairs of speciesspecific primers were designed to establish a multiplex allelespecific polymerase chain reaction （MASPCR） and the samples from different regionwere tested. The results showed that when the annealing temperature was 60 ℃ and the cycle number was 35， approximately 250， 500，1 000 bp specific band were obtained from P. ginseng， P. notoginseng and P. quinquefolius obtain， respectively. This method could also be used to authentificate admixture samples and could detect 0.5% percent of P. notoginseng or P. quinquefolius adulterated in P. ginseng， or 0.5% percent of P. ginseng or P. quinquefolius adulterated in P. notoginseng. The detect limit of P. ginseng in P. quinquefolius was 0.5% and P. notoginseng in P. quinquefolius was 1%. This results showed that the present method could be used as a promise method to identify Panax ginseng， P. notoginseng， P. quinquefoliusand their admixture.

[Key words] Panax ginseng； Panax notoginseng； Panax quinquefolius； multiplex allelespecific polymerase chain reaction； admixture； molecular identification

人參、西洋參、三七是我國(guó)常用名貴中藥，其根、根莖、葉、花、果實(shí)等均做藥用，價(jià)值很高。在中醫(yī)臨床用藥上，人參性溫，功效大補(bǔ)元?dú)?、固脫生津、安神；三七性溫，功效散瘀止血、消腫定痛；西洋參性涼，功效補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津，三者藥效具有很大區(qū)別，不能混用。然而，由于人參、三七、西洋參為人參屬近緣物種，形態(tài)和化學(xué)成分相似，市場(chǎng)時(shí)有摻雜混用現(xiàn)象發(fā)生，人參、西洋參飲片或人參花、西洋參花、三七花相互摻雜尤為常見(jiàn)，對(duì)用藥安全造成損害，需要建立準(zhǔn)確、可靠、特別是能同時(shí)檢測(cè)是否存在相互摻雜的鑒定方法。

分子鑒定尤其是基于SNP的方法，因其具有準(zhǔn)確性高、特異性好、不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，在人參屬物種鑒定中已有應(yīng)用，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCRSSCP）[1]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)限制性內(nèi)切酶酶切圖譜多態(tài)性（PCRRFLP）[2]、位點(diǎn)特異性PCR或多重PCR[36]以及序列測(cè)定技術(shù)[6]等。但這些技術(shù)只關(guān)注人參屬真?zhèn)纹返蔫b定，無(wú)法鑒定是否存在摻雜品，對(duì)市場(chǎng)實(shí)際存在的花、葉、飲片類摻雜樣品需要進(jìn)行多次PCR反應(yīng)才能判定。本研究通過(guò)建立多重位點(diǎn)特異性PCR方法鑒別人參、三七和西洋參，只通過(guò)1次PCR反應(yīng)即可準(zhǔn)確地對(duì)三者及其相互摻偽進(jìn)行鑒別，并對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，力求建立準(zhǔn)確穩(wěn)定的人參屬摻雜樣品檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 植物

人參原植物（包括根和葉）采自東北不同產(chǎn)區(qū)以及北京市懷柔區(qū)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)所許世權(quán)研究員鑒定，三七原植物采自云南文山州不同產(chǎn)區(qū)，由昆明理工大學(xué)崔秀明教授鑒定，西洋參原植物采自河北、吉林和北京，竹節(jié)參、珠子參和羽葉三七原植物采自安徽、湖北和云南，由湖北輕工大學(xué)陳平教授鑒定。人參、西洋參、三七、竹節(jié)參、珠子參花、種子及藥材樣品采自亳州藥材市場(chǎng)，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)周建理教授和中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷助理研究員鑒定。所有樣品經(jīng)減壓干燥后保存于中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

1.2 鑒別標(biāo)記獲得與引物設(shè)計(jì)

此前的研究已發(fā)現(xiàn)人參和西洋參的特異性SNP位點(diǎn)[4]，本研究參考此位點(diǎn)使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)出人參、西洋參的特異性鑒別引物。為尋找三七鑒別位點(diǎn)，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載人參屬物種ITS，rbcL，matK，18S rRNA序列，利用BioEdit軟件進(jìn)行同源對(duì)齊，校對(duì)后分析其特異性SNP位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)三七花ITS序列（以JQ764993.1為參照）第57，68，70，522位均存在特異性SNP位點(diǎn)，分別為T，T，G，T，而其他人參屬所有物種包括人參均為C，C，A，A，以此為基礎(chǔ)利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)三七花特異性鑒別引物，使正反向引物3′端位均于SNP位點(diǎn)上，調(diào)整退火溫度在50～55 ℃，并分析所設(shè)計(jì)的人參、西洋參、三七引物間發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物二聚體或錯(cuò)誤引發(fā)情況。設(shè)計(jì)的特異性鑒別引物序列見(jiàn)表2，由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 DNA提取

取1 g植物材料，使用球磨粉碎機(jī)粉碎至能過(guò)5號(hào)篩。取粉末20 mg，使用堿裂解法[7]提取總DNA，使用Nanodrop 2000測(cè)定DNA濃度，調(diào)整濃度至30 mg·L-1，用于PCR擴(kuò)增或于-20 ℃下保存。

1.4 PCR擴(kuò)增及電泳

多重位點(diǎn)特異性PCR鑒別反應(yīng)在200 μL的PCR管中進(jìn)行，25 μL PCR反應(yīng)體系包括 10× PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs混合液（10 mmol·L-1）1.5 μL，人參上下游引物（10 μmol·L-1）各0.3 μL，三七上下游引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，西洋參上下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，rTaq DNA聚合酶（5 U·μL-1）0.4 μL，DNA模板（10～50 ng） 1 μL，雙蒸滅菌水 19.1 μL，反應(yīng)液振蕩混勻，瞬時(shí)離心后置PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸20 s，共35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃再延伸3 min。PCR產(chǎn)物加入Loading buffer后經(jīng)EB預(yù)染的1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像儀觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 多重位點(diǎn)特異性PCR條件的確定

2.1.1 退火溫度與循環(huán)數(shù) 前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用對(duì)應(yīng)的特異性鑒別引物進(jìn)行擴(kuò)增，人參、三七、西洋參在58～62 ℃時(shí)分別能擴(kuò)出約250，500，1 000 bp大小的條帶，以此為基礎(chǔ)進(jìn)行多重位點(diǎn)特異性PCR鑒別，并對(duì)影響多重PCR特異性、準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素退火溫度和循環(huán)數(shù)進(jìn)行考察。結(jié)果表明退火溫度為60～62 ℃時(shí)人參、三七、西洋西洋參分別出現(xiàn)約250，500，1 000 bp大小的特異性條帶，無(wú)非特異性擴(kuò)增及假陽(yáng)性條帶出現(xiàn)，但61 ℃以上時(shí)人參、三七特異性條帶亮度明顯降低，確定多重PCR退火溫度為60 ℃，見(jiàn)圖1A。對(duì)循環(huán)數(shù)進(jìn)行考察，31～37個(gè)循環(huán)時(shí)時(shí)人參、西洋參、三七均能獲得正確的鑒別結(jié)果，35個(gè)循環(huán)及37個(gè)循環(huán)PCR條帶亮度大于31，33個(gè)循環(huán)，見(jiàn)圖1B?？紤]到根、葉、花、種子DNA提取質(zhì)量與濃度可能存在區(qū)別，藥材經(jīng)加工后DNA存在降解出現(xiàn)假陰性結(jié)果的風(fēng)險(xiǎn)，選擇PCR循環(huán)數(shù)為35個(gè)循環(huán)，對(duì)新鮮植物材料的鑒別，可減少循環(huán)數(shù)至31個(gè)。

2.1.2 最適引物量的確定 PCR引物用量及引物間的相互比例對(duì)多重特異性PCR結(jié)果有重要影響。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以西洋參、三七引物量均為0.2 μL為基礎(chǔ)，分別考察人參上下游引物用量為0.1，0.2，0.3，0.4 μL時(shí)對(duì)多重特異性鑒別結(jié)果的影響，結(jié)果0.1 μL時(shí)人參無(wú)條帶，0.3，0.4 μL時(shí)人參條帶明顯，且無(wú)假陽(yáng)性條帶出現(xiàn)，確定人參上下游引物量為0.3 μL；在此基礎(chǔ)上考察三七用量分別為 0.1，0.2，0.3，0.4 μL的影響，結(jié)果 0.1 μL 時(shí)三七條帶暗淡，0.2 μL引物時(shí)三七電泳條帶亮度大且無(wú)假陽(yáng)性條帶出現(xiàn)。在此基礎(chǔ)上同法西洋參用量為0.15，0.2，0.25，0.3 μL，結(jié)果0.25 μL引物時(shí)條帶亮度大，最終確定引物配比為人參引物量三七引物量西洋參引物量0.3 μL∶0.2 μL∶0.25 μL。

2.1.3 Taq酶與PCR儀 使用建好的方法在不同的Taq酶和不同PCR儀上進(jìn)行多重位點(diǎn)特異性PCR以考察方法的適用性。結(jié)果表明，使用低保真的rTaq（Takara公司）、Fast Taq聚合酶（TransGen公司）、中度保真的Ex Taq（Takara公司）酶均獲得正確的鑒別結(jié)果，而高保真性的的PrimeSTAR HS Taq進(jìn)行鑒定時(shí)人參、三七、西洋參樣品均出現(xiàn)假陽(yáng)性條帶，見(jiàn)圖1C。這可能是由于高保真Taq DNA聚合酶具有3′5′外切酶活性，導(dǎo)致位于3′端的鑒別位點(diǎn)被酶切，剩下序列完全匹配獲得擴(kuò)增導(dǎo)致的，表現(xiàn)出與常規(guī)位點(diǎn)特異性PCR一致的特性[8]。使用不同的PCR儀，除老式的PCT100型PCR儀外，其他PCR儀均獲得正確的鑒別結(jié)果，見(jiàn)圖1D，由于多重PCR對(duì)退火溫度敏感，不同PCR儀溫控水平有差異，在進(jìn)行鑒定時(shí)應(yīng)進(jìn)行溫度調(diào)校。

2.2 準(zhǔn)確性考察

使用建好的方法對(duì)來(lái)自全國(guó)主產(chǎn)區(qū)的140批人參、79批三七、44批西洋參及40批人參屬其他物種樣品進(jìn)行多重位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增，結(jié)果人參原植物、藥材、花、種子等均擴(kuò)增獲得250 bp的特異性條帶，三七原植物、藥材、三七花均獲得約500 bp的特異性條帶，西洋參獲得約1 000 bp的特異性條帶，人參屬其他物種包括竹節(jié)參、珠子參、羽葉三七均無(wú)條帶，無(wú)假陽(yáng)性和假陰性結(jié)果出現(xiàn)。部分結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.3 摻偽檢出限

為檢測(cè)多重位點(diǎn)特異性PCR對(duì)摻偽樣品鑒別能力。取西洋參和三七粉末各0.5g等量混勻，取不同量混合物與人參粉末充分混勻，獲得人參粉末中摻有50%，20%，10%，5%，2%，1%西洋參三七混合物的系列混合粉末，使用上述方法提取DNA并進(jìn)行多重特異性PCR鑒定，以檢測(cè)方法對(duì)人參中摻雜西洋參、三七的檢出限；以同樣的方法制作人參、西洋參混合物和三七、西洋參混合物，并制作相應(yīng)系列混合粉末，以檢測(cè)三七中摻雜西洋參、人參的檢出限和西洋參中摻雜人參、三七的檢出限。

結(jié)果表明人參中摻雜0.5%以上的三七或西洋參可檢出見(jiàn)圖3（泳道7），同理其對(duì)西洋參三七中摻雜西洋參或人參的檢出限均為0.5%（泳道15），對(duì)西洋參中摻雜人參的檢出限為0.5%（泳道23），摻雜三七的檢出限為1%（泳道22）。

4 討論

真?zhèn)螕诫s品的鑒別一直是中藥鑒別的難點(diǎn)問(wèn)題，依賴于具有同時(shí)檢測(cè)真?zhèn)纹诽禺愋詷?biāo)記的方法的開(kāi)發(fā)。多重PCR是一種在同一體系內(nèi)進(jìn)行多個(gè)PCR擴(kuò)增的技術(shù)，其突出優(yōu)勢(shì)是在一次檢測(cè)中同時(shí)表征多個(gè)位點(diǎn)或基因片段，從而具有摻雜檢測(cè)的潛力。此前的人參屬多重PCR鑒別方法往往只關(guān)注于能否同時(shí)檢測(cè)人參、西洋參、三七物種，對(duì)每種藥材均需要2對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果才能判定，無(wú)法用于鑒定是否存在摻雜樣品。如劉麗等[3]的多重PCR鑒別體系結(jié)果的判定，只存在150 bp條帶的為人參、只存在400 bp條帶為三七，同時(shí)存在150，400 bp條帶為西洋參，其結(jié)果無(wú)法區(qū)分西洋參與人參三七混合樣品，也無(wú)法區(qū)分西洋參與人參西洋參混合樣品。鑒于此，本文針對(duì)人參、西洋參、三七分別設(shè)計(jì)了位點(diǎn)特異性鑒別引物，對(duì)每種藥材使用單一引物對(duì)進(jìn)行鑒別，從而能檢測(cè)摻雜樣品，做到對(duì)中藥真?zhèn)蔚臏?zhǔn)確控制。

人參、西洋參、三七為近緣物種，遺傳物質(zhì)相似，DNA序列一般只存在少數(shù)的SNP位點(diǎn)，專屬性標(biāo)記開(kāi)發(fā)困難。本研究通過(guò)對(duì)人參屬所有物種的18S，ITS，matK序列進(jìn)行分析，分別發(fā)現(xiàn)3組SNP位點(diǎn)，可特異性鑒別人參、西洋參、三七。由于只存在單核苷酸的變異，引物間相互作用、PCR反應(yīng)體系、循環(huán)參數(shù)等均直接影響特異性PCR鑒別的準(zhǔn)確性和特異性[910]。本研究對(duì)影響PCR特異性的關(guān)鍵因素退火溫度、循環(huán)數(shù)、Taq酶種類和引物用量進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)本研究建立的方法對(duì)條件要求較為寬松，但Taq酶種類對(duì)其特異性具有較顯著的影響，僅不具有3′5′外切酶活性的Taq酶能準(zhǔn)確鑒別人參、西洋參、三七。為考察多重位點(diǎn)特異性PCR方法的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)共計(jì)超過(guò)300 批人參、西洋參、三七及其他近緣物種進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，包含根、葉、花、種子和不同類型的藥材，結(jié)果所有人參、三七、西洋參均獲得正確的陽(yáng)性鑒別結(jié)果，其他人參屬近緣物種均為陰性，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果完全吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的可靠性和穩(wěn)定性。為檢測(cè)該方法對(duì)混偽品的鑒別能力，本研究制作了一系列不同摻偽程度的人參、西洋參、三七混合樣品并進(jìn)行多重位點(diǎn)特異性PCR擴(kuò)增，結(jié)果對(duì)人參、西洋參、三七中任意兩者相互摻偽的檢出限均達(dá)到1%，可滿足中藥產(chǎn)業(yè)鏈尤其是不同形態(tài)產(chǎn)品的生產(chǎn)檢驗(yàn)的需求。傳統(tǒng)對(duì)人參和三七通過(guò)性狀進(jìn)行鑒別，對(duì)人參粉和三七粉基于草酸鈣簇晶的顯著差異進(jìn)行顯微鑒別，對(duì)種子種苗、果實(shí)、莖葉、花等其他藥用部位則需要另外建立專用的鑒別方法，基于DNA的多重PCR鑒別方法可同時(shí)對(duì)人參、三七、西洋參的不同生長(zhǎng)部位、發(fā)育階段與加工形式的產(chǎn)品進(jìn)行摻雜鑒別，是對(duì)傳統(tǒng)鑒別方法的補(bǔ)充和創(chuàng)新。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 詹鑫婕，田程，張媛，等. 基于ITS2條形碼SNPs的人參和西洋參PCRSSCP分子鑒別研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2012，37 （24）： 3748.

[2] Diao Y， Lin X， Liao C， et al. Authentication of Panax ginseng from its adulterants by PCRRFLP and ARMS[J]. Planta Med，2009， 75 （5）： 557.

[3] 劉麗，肖炳燚，羅暉明，等. 多重PCR方法同時(shí)鑒別人參、西洋參、三七[J]. 藥物分析雜志，2016，36 （4）： 668.

[4] 崔光紅，唐曉晶，黃璐琦. 利用多重等位基因特異PCR鑒別人參、西洋參[J]. 中國(guó)中藥雜志，2006，31 （23）： 1940.

[5] Zhu S， Fushimi H， Cai S， et al. Species identification from Ginseng drugs by multiplex amplification refractory mutation system （MARMS）[J]. Planta Med，2004， 70 （2）： 189.

[6] Chen X， Liao B， Song J， et al. A fast SNP identification and analysis of intraspecific variation in the medicinal Panax species based on DNA barcoding[J]. Gene，2013， 530 （1）： 39.

[7] 蔣超，黃璐琦，袁媛，等. 使用堿裂解法快速提取藥材DNA方法的研究[J]. 藥物分析雜志，2013，31（7）： 1081.

[8] 蔣超，張雅華，陳敏，等. 基于雙向位點(diǎn)特異性PCR的金銀花真?zhèn)舞b別方法研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2012，37（24）： 3752.

[9] 蔣超，黃璐琦，袁媛，等. 金銀花中幾種分子的真?zhèn)舞b別方法比較及其研究進(jìn)展[J]. 世界科學(xué)技術(shù)——中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2014（8）： 1831.

[10] 崔占虎，黃顯章，龍平，等. 蒙成藥中 “地格達(dá)” 類原料藥材的位點(diǎn)特異性 PCR 鑒別研究[J]. 中國(guó)中藥雜志，2015，40（5）： 793.

[責(zé)任編輯 呂冬梅]