忍冬葉活性成分周期變化及其代謝關(guān)系研究

劉偉　楊帆　劉峰　周冰謙　耿巖玲　李圣波　郭蘭萍　王曉

[摘要] 該文通過對忍冬葉初生及次生代謝過程進(jìn)行研究，探討不同發(fā)育階段忍冬葉代謝規(guī)律。在每月下旬采收金銀花上部5～8片完全展開葉，采用HPLC測定相關(guān)代謝指標(biāo)。結(jié)果表明，忍冬葉含水量在3月份最高，達(dá)到78.59%，12月份最低，為60.83%；總糖量在冬季最高，1月份達(dá)到最高275.8 mg·g-1，其他時(shí)間明顯降低；忍冬葉中的綠原酸、新綠原酸、木犀草苷和咖啡酸的含量變化基本一致，四者的含量均在3月達(dá)到最高，分別為42.79，2.01，7.13，0.16 mg·g-1。忍冬葉的初生代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物含量在3—5月達(dá)到較高水平，與有效成分含量相關(guān)的因素主要有鉀、鎂、磷、門冬氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、胱氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸。

[關(guān)鍵詞] 忍冬葉； 活性成分； 代謝關(guān)系

Research on periodical changes and metabolism relations of

active components in Lonicera japonica leaves

LIU Wei1， YANG Fan1， LIU Feng1， ZHOU Bingqian1， GENG Yanling1，

LI Shengbo3， GUO Lanping2， WANG Xiao1*

（1. Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Quality Control Technology， Shandong Analysis and

Test Center， Jinan 250014， China；

2.National Resource Center for Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences，

Beijing 100700， China；

3. Shandong Yate Ecological Technology Co.， Ltd.， Linyi 276017， China）

[Abstract] The study is aimed to explore the metabolism rule of Lonicera japonica by investigating the primary and secondary metabolism process in different growth periods. HPLC and other methods were used to measure metabolism indexes of leaves collected in last ten days of every month. The results suggested that the maximum （78.59%） and minimum （60.83%） of water content were found in March and December. The content of total sugar reached a high level from December to February and the maximum （275.8 mg·g-1） appeared in October， while it reduced significantly at other time. The change of chlorogenic acid， neochlorogenic acid， galuteolin， caffeic acid were basically consistent and the highest content of them synchronously appeared （42.79， 2.01， 7.13， 0.16 mg·g-1） in March. The content of primary and secondary metabolite in L. japonica leaves reached a high level from March to May， and the main related elements with effective components were K， Mg， P， aspartate， threonine， proline， valine， cysteine， isoleucine and phenylalanine.

[Key words] Lonicera japonica leaves； active components； metabolism relations

金銀花Lonicera japonica為忍冬科忍冬屬常綠或半常綠纏繞藤本植物，是臨床常用的中藥材之一[1]。主產(chǎn)山東、河南等省，具有清熱解毒、涼風(fēng)散熱、抗病毒、保肝利膽等功能[25]?！侗静菥V目》曰：“莖、葉及花，功用皆同”[67]。臨床研究表明，用忍冬葉鮮品泡茶，對于急性腸炎有很好的治療效果，可在3 d治療期限內(nèi)獲得臨床治愈[8]。忍冬葉片因產(chǎn)量較高，綠原酸、黃酮等多酚類物質(zhì)含量豐富，抑菌、抗氧化等藥理活性較好，在許多中藥、中成藥及飲料中廣泛使用[912]。張寧的研究結(jié)果顯示，忍冬葉的粗提物具有良好的抗菌、抗氧化等活性[1315]。但在不同的生長階段，忍冬葉具有不同的生理作用，其中的活性成分也存在季節(jié)性的變化，本文通過研究忍冬葉不同生育期的初生及次生代謝產(chǎn)物的變化情況，為忍冬葉的充分合理利用提供有利的資料。

1 材料

1.1 試藥

忍冬葉取自山東省分析測試中心植物園，取樣時(shí)間為每月的27日，選擇生長正常的金銀花植株與粗細(xì)長短基本一致的枝條，從其上部第5片葉開始，取完全展開的4～6片葉，約100 g。其中，4月至10月所取樣品是生長期同一部位葉片，11月至次年3月所取樣品為越冬期葉片。實(shí)驗(yàn)樣本均為5株忍冬的葉混合樣本。

1.2 對照品

綠原酸（本實(shí)驗(yàn)室自制，純度≥98%）；新綠原酸、隱綠原酸、3，5二咖啡?？鼘幩?、3，4二咖啡?？鼘幩?、4，5二咖啡?？鼘幩帷⒖Х人?、槲皮素、木犀草苷（批號分別為MUST11112202，MUST11112203，MUST11061601，MUST11083102，MUST11081803，MUST12042403，MUST12020101，MUST10122401，純度≥98%，購自成都曼思特生物科技有限公司）。

2 方法

2.1 生物量的統(tǒng)計(jì)

采樣后立即測定金銀花葉的百葉鮮重，之后殺青烘干，稱重，計(jì)算含水量。

2.2 初生代謝產(chǎn)物含量的測定

金銀花葉中總糖和蛋白質(zhì)含量均用分光光度法測定。稱取0.3 g葉片于比色瓶中，加入20 mL 90 ℃蒸餾水，在90 ℃水浴中加熱30 min，稍冷后過濾到50 mL量瓶中，濾渣重復(fù)提取1次，過濾到原量瓶中，反復(fù)漂洗，定容至50 mL，轉(zhuǎn)移到大離心管中，冷卻后放入4 ℃保存。

2.2.1 總糖含量的測定 將樣品提取液稀釋50倍后取2 mL于試管中，加入0.5 mL的蒽酮乙酸乙酯，再加入5 mL的濃硫酸，振蕩，沸水浴10 min，冷卻后在620 nm處測量吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：分別量取100 mg·L-1的葡萄糖母液0，0.4，0.6，0.8，1，1.5，2.0 mL，加水至2 mL，再加入相應(yīng)的蒽酮乙酸乙酯和濃硫酸，振蕩，沸水浴10 min，于620 nm處測量吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.2 蛋白質(zhì)含量的測定 取0.5 mL的樣品提取液，加入0.95 mL的蒸餾水，再加入4 mL的考馬斯亮藍(lán)，反應(yīng)5 min，測量595 nm處的吸光度。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定：分別取0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 100 mg·L-1的牛血清蛋白BSA至試管中，加入蒸餾水至1 mL，再加入4 mL的考馬斯亮藍(lán)，反應(yīng)5 min，于595 nm處測量吸光度，制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2.3 葉綠素、葉綠素a、葉綠素b含量的測定 稱取0.5 g新鮮葉片放入研缽中，加純丙酮5 mL，少許CaCO3和石英砂，研磨成勻漿，再加80%丙酮5 mL，將勻漿轉(zhuǎn)入離心管，并用適量80%丙酮洗滌研缽，一并轉(zhuǎn)入離心管，離心后棄沉淀，上清液用80%丙酮定容至20 mL。取上述提取液1 mL，加80%丙酮4 mL稀釋后轉(zhuǎn)入比色杯中，以80%丙酮為對照，分別測定663，645 nm處的吸光度A，既可計(jì)算出葉綠素a的含量（ρa(bǔ)）、葉綠素b的含量（ρb）和總?cè)~綠素的含量（ρT）：ρa(bǔ) （mg·L-1）=12.7A663-2.69A645，ρb （mg·L-1）=22.9A645-4.68A663，ρT （mg·L-1）=8.02A663+20.21A645。

2.2.4 氨基酸含量的測定 準(zhǔn)確稱取200 mg粉碎后樣品，放入水解管，加入6 mol·L-1的HCl 15 mL，真空封管后置于110 ℃恒溫干燥箱水解22 h，過濾后定容至50 mL，取1 mL濾液在40 ℃條件下減壓蒸干，用1 mL pH 2.2的緩沖液溶解，使用氨基酸分析儀測定所得溶液的氨基酸含量。

2.2.5 營養(yǎng)元素含量的測定 將采集的金銀花葉烘干粉碎，準(zhǔn)確稱取樣品0.2 g于聚四氟乙烯消解罐中，加入消解劑硝酸5 mL，密封過夜；次日補(bǔ)加1 mL 30%的H2O2，于微波消解爐中應(yīng)用壓力控制程序（壓力0.4，0.8，1.2，1.5，1.8 MPa，每一個(gè)壓力梯度消解4 min），進(jìn)行消解。樣品消解完畢，放置通風(fēng)櫥中冷卻，消解液呈無色透明。將消解液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，用去離子水稀釋至刻度待測。按相同處理方法，同時(shí)做平行空白實(shí)驗(yàn)。采用火焰原子吸收法對消解樣品進(jìn)行測定分析。樣品重復(fù)測定3份，取平均值。

2.3 有效成分含量的測定

2.3.1 供試品溶液的制備 稱取忍冬葉0.5 g，加50 mL 70%乙醇，超聲提取1 h，過濾后為供試樣品。

2.3.2 對照品溶液的制備 參考藥典2015年版綠原酸的測定方法。稱取綠原酸3.5 mg，甲醇溶解后定容至25 mL；稱取3，5二咖啡?？鼘幩?.4 mg，甲醇溶解定容至10 mL；稱取咖啡酸1.1 mg、3，4二咖啡酰奎寧酸1.1 mg、4，5二咖啡?？鼘幩?.1 mg、隱綠原酸1.4 mg、新綠原酸1.2 mg、槲皮素1.6 mg、木犀草苷2.2 mg分別甲醇溶解定容至10 mL，分別取以上溶液0.5，2，2，1，1，0.5，1 mL混合后定容至10 mL。金銀花活性成分對照品的HPLC圖，見圖1。

采用HPLC分別測定綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、木犀草苷、咖啡酸、3，4二咖啡?？鼘幩?、4，5二咖啡?？鼘幩?、3，5二咖啡?？鼘幩嵋约伴纹に氐暮?。色譜條件：安捷倫1120高效液相色譜儀系統(tǒng)（紫外檢測器）；色譜柱為InertsilODSRP（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）0.1%乙酸緩沖液（B），梯度洗脫，0～15 min，10%～20% A；15～30 min，20% A；30～40 min，20%～0% A；流速1.0 mL·min-1；檢測波長327 nm，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量10 μL。

3 結(jié)果

3.1 忍冬葉生物量及初生代謝產(chǎn)物含量的變化

3.1.1 忍冬葉生物量、總糖及蛋白質(zhì)含量的變化 百葉鮮重在5月分達(dá)到最高，為33.78 g，以后到7月逐漸降低，10月又達(dá)到1個(gè)峰值，為18.90 g。葉片含水量在3月達(dá)到最高，為78.59%，12月最低，為60.83%。蛋白質(zhì)含量在1年中波動不明顯?？偺呛吭诙镜?2，1，2月最高，1月達(dá)到最高275.8 mg·g-1，8月達(dá)到最低的108.24 mg·g-1，見表1。

3.1.2 忍冬葉光合生理指標(biāo)的變化 忍冬葉的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素三者的含量在1年中的變化趨勢一致，4月至7月含量較高，8月降至最低，到11月達(dá)到全年最高，其余月份之間整體差異不大；葉綠素、葉綠素a和葉綠素b最高分別為3.41，2.41，1.00 g·hm-2，都出現(xiàn)在11月；最低分別為0.98，0.79，0.19 g·hm-2，都出現(xiàn)在8月，見表2。

3.1.3 忍冬葉中氨基酸含量 忍冬葉的氨基酸在不同月份的含量存在差異，其中在3，4月和8，9月氨基酸含量較高，12，1，2月含量較低。蘇氨酸最高含量與其他月份相差較大，是其他月份的2～5倍；蛋氨酸含量較其他氨基酸偏少，且含量高的月份為1，12月；胱氨酸含量較少的月份為5，6月，而門冬氨酸和賴氨酸在3月含量最少，見表3。

3.1.4 忍冬葉中營養(yǎng)元素含量 忍冬葉在不同生育期的營養(yǎng)元素含量不同，其中，主要營養(yǎng)元素磷和鉀在3月份含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6 297，24 760 mg·kg-1，1月含量最低；微量元素鐵和錳變化規(guī)律基本一致，在1月達(dá)到最高的733.5，153.3 mg·kg-1，7月含量最低；鈣、鎂和鋅的變化趨勢基本一致，均在2月含量較高，鈣和鋅在7月含量最低，鎂在4月達(dá)到最低；銅的量在各月之間差異不大，9月達(dá)到最高的12.79 mg·kg-1，5月含量最低，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.883 mg·kg-1；鐵、鉀、鎂、錳、磷和鋅的含量從10月到來年1月之間差異不明顯，見表4。

3.2 忍冬葉次生代謝產(chǎn)物含量的變化

忍冬葉中的綠原酸、新綠原酸、木犀草苷和咖啡酸的含量變化基本一致，四者的含量均在3月達(dá)到最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為42.79，2.01，7.13，0.16 mg·g-1；咖啡酸含量整體較低，除3月含量最高外，其余月份間基本無差異；綠原酸、新綠原酸和木犀草苷含量均在10月至來年2月左右差異不明顯，新綠原酸與木犀草苷在5—7月無明顯差異，其余月份間有明顯差異，綠原酸一年中各月間差異較大。3，4二咖啡?？鼘幩嵩谝荒曛械暮孔兓?guī)律不明顯，3月含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.6 mg·g-1；3，5二咖啡?？鼘幩岷吭谇?個(gè)月變化較大，5月達(dá)到最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.03 mg·g-1，6—9月及12月至來年1月差異不大。槲皮素5月的含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.22 mg·g-1，4，5二咖啡酰奎寧酸在10月達(dá)到最高，隱綠原酸在12月達(dá)到最高，二者質(zhì)量分?jǐn)?shù)為別為8.44，0.70 mg·g-1，見表5。忍冬葉有效成分隨時(shí)間變化的回歸方程，X表示時(shí)間，Y表示某種有效成分的含量，見表6。

3.3 忍冬葉中有效成分與營養(yǎng)元素、氨基酸的相關(guān)性分析

為了探究初生代謝產(chǎn)物與次生代謝產(chǎn)物之間的關(guān)系，本文對有效成分與營養(yǎng)元素、氨基酸之間的相關(guān)性進(jìn)行了分析，見表7。元素鉀和鎂的含量均與木犀草苷、隱綠原酸、咖啡酸和3，4二咖啡?？鼘幩崴恼哂袠O顯著的相關(guān)性，銅、錳和鋅的含量與隱綠原酸有著極顯著的相關(guān)性，鈣與隱綠原酸和3，4二咖啡?？鼘幩嵊袠O顯著的相關(guān)性，而磷與綠原酸、木犀草苷、隱綠原酸和咖啡酸有極顯著的相關(guān)性。有效成分與氨基酸的相關(guān)性分析表明，與有效成分含量呈現(xiàn)相關(guān)性的氨基酸主要集中在門冬氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸，其中隱綠原酸與多種氨基酸有相關(guān)性，見表8。結(jié)果表明，與有效成分含量相關(guān)的因素主要為鉀、鎂、磷、門冬氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、胱氨酸、異亮氨酸和苯丙氨酸。

4 討論

葉片是植物賴以生存的重要器官，其所含的葉綠素濃度與植物C同化速率密切相關(guān)[1618]，隨著植物的生長，光合作用所積累的養(yǎng)分逐漸增加以滿足自身生長所需要。本研究表明，在4月至7月，忍冬葉片的葉綠素含量隨著光照增強(qiáng)而逐漸提高，而在8月份過高的光強(qiáng)使光合速率降低從而導(dǎo)致了葉綠素含量的降低，至11月葉綠素積累達(dá)到全年最高。忍冬葉中的多糖含量在7月以后開始增加，銀杏葉中粗多糖的含量從7月開始逐漸增加[1920]，至來年1月達(dá)到最高，說明忍冬在上半年的光合作用主要為自身的營養(yǎng)生長以及5—6月生殖生長做準(zhǔn)備，而之后營養(yǎng)的貯存為防御低溫做準(zhǔn)備。

王玲娜等的研究結(jié)果表明，日照時(shí)數(shù)、降雨量、相對濕度對忍冬葉有效成分含量影響較大[21]，綠原酸、木犀草苷、新綠原酸和咖啡酸等主要的有效成分在影響因子變化較大的月份有明顯差異，而在氣候變化不大的月份差異不明顯。潘學(xué)標(biāo)，楊文杰，甄占萱等通過研究棉葉、大豆和桑葉的氨基酸含量變化，提出氨基酸含量在生長速率高的結(jié)籽時(shí)期前含量較高，且與土壤、氣候條件等有關(guān)[2224]，這些研究結(jié)果為本研究提供了參考。本研究中氨基酸含量在氣候

較適宜的3，4月和8，9月較高，而在進(jìn)入12月后含量較低，與前人研究結(jié)果基本一致。安貴陽的研究論文表明，多年生植物的營養(yǎng)元素可在秋冬貯藏，來年春夏季再利用[25]，本文忍冬葉中營養(yǎng)元素含量均在秋冬季含量較高，在進(jìn)入生長季節(jié)后減少，結(jié)果與操國興等的研究結(jié)論一致[26]。

有效成分與營養(yǎng)元素、氨基酸的相關(guān)性分析結(jié)果表明，主要元素鉀、磷與多種有效成分呈正相關(guān)，其他營養(yǎng)元素均與有效成分有一定的正負(fù)相關(guān)性，其中除鐵之外的營養(yǎng)元素與隱綠原酸均有極顯著的相關(guān)性；與氨基酸存在相關(guān)性的有效成分主要集中在綠原酸、木犀草苷、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸中，其中隱綠原酸與多種氨基酸有相關(guān)性，門冬氨酸、蘇氨酸、脯氨酸、纈氨酸、胱氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸是主要的與有效成分呈現(xiàn)相關(guān)性的氨基酸。這些結(jié)果說明部分有效成分的合成代謝很可能與一些營養(yǎng)元素和氨基酸的合成代謝相關(guān)，這些因素之間的平衡影響金銀花的正常生長和物質(zhì)積累，也影響著藥材的質(zhì)量和功效。同時(shí)，這也為通過改進(jìn)金銀花種植技術(shù)從而提高金銀花藥材質(zhì)量提供了新的思路，具有一定的參考價(jià)值。此外，不同月份研究材料雖然是枝條相同的節(jié)位葉片，但時(shí)間存在生長旺盛期和越冬期2個(gè)階段，其中的差異對研究結(jié)果也可能有一些影響。

忍冬葉初生及次生代謝產(chǎn)物含量的測定為忍冬葉的充分合理利用提供了依據(jù)，研究結(jié)果在藥材采摘時(shí)間的確定及藥材質(zhì)量的保持方面有重要的參考價(jià)值。

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[責(zé)任編輯 呂冬梅]