馬齒莧發(fā)酵液中活性成分含量及化妝品功效研究

許丹妮++劉平平++蘇寧++安全++趙丹++李萌++王昌濤

摘要：采用紫外分光光度法測定馬齒莧（Portulaca oleracea L.）發(fā)酵液中總糖、黃酮、蛋白質的含量，分析了發(fā)酵液對DPPH自由基的清除效果，通過測定發(fā)酵液對B16細胞中酪氨酸酶活性的抑制效果評價發(fā)酵液的美白功效。結果表明，馬齒莧發(fā)酵液中總糖、黃酮含量分別為3.90、0.59 mg/mL；蛋白質含量為55.72±0.83 μg/mL。發(fā)酵液對DPPH自由基的清除效果良好，對B16細胞中酪氨酸酶的活性有抑制作用。

關鍵詞：馬齒莧（Portulaca oleracea L.）；發(fā)酵液；活性成分；功效評價

中圖分類號：Q949.745.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2017）05-0924-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.05.033

Study on the Contents of Active Ingredients and Cosmetic Efficacy of Portulaca oleracea L. Fermentation Liquor

XU Dan-ni1，LIU Ping-ping1，SU Ning2，AN Quan3，ZHAO Dan1，LI Meng1，WANG Chang-tao1

（1.School of Science， Beijing Technology and Business University， Beijing 100048， China；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Cosmetic Center， Beijing 100176， China；3.Yunnan Baiyao Group Co.， Ltd.， Kunming 650500， China）

Abstract： Contents of main active ingredients and cosmetic efficacy of Portulaca oleracea L. fermentation liquor were studied. Measuring the contents of total sugars，flavonoids，and protein in the fermentation liquor of Portulaca oleracea L. by UV spectrophotometry. Experiments were operated on scavenging DPPH radicals in terms of measuring the antioxidant activity of fermentation liquor. Evaluating the whitening efficacy of fermentation liquor by determining the inhibition effect on tyrosinase activity in B16 cells. Results shows that the contents of total sugar，flavonoids and protein in the fermentation liquor of Portulaca oleracea L. were 3.90 mg/mL，0.59 mg/mL and 55.72±0.83 μg/mL. The fermentation liquor has good scavenging effects on DPPH radicals and can inhibit the activity of tyrosinase in B16 cells.

Key words： Portulaca oleracea L.； fermentation liquor； active ingredients； cosmetic efficacy evaluation

馬齒莧（Portulaca oleracea L.）是馬齒莧科馬齒莧屬一年生肉質草本植物，是菜藥兼用植物，在中國大部分地區(qū)均有分布，又名長命菜、五行草、瓜子菜、麻繩菜、五色莧、馬食菜等[1]。馬齒莧具有清熱解毒、涼血止血的功能，用于治療熱毒血痢、癰腫療瘡、濕疹、丹毒、痔血和崩漏下血等病癥[2]。馬齒莧中含有多種微量元素、黃酮、多糖、氨基酸、多酚、維生素、不飽和脂肪酸等生物活性成分，具有防治心臟病、冠心病、心絞痛、糖尿病、白癜風、白發(fā)病，抗癌、抗衰老、降血壓、降低中風率等作用[3]。馬齒莧還可起到保濕、美白、舒緩肌膚的作用[4]。微生物發(fā)酵可將有效成分分離、提取，使其更具生物活性，在發(fā)酵過程中還可能會伴隨某些成分的分解轉化而生成新的有效成分[5]。發(fā)酵法不失為一種更加高效環(huán)保的提取方法。本研究采用黃酒酵母發(fā)酵馬齒莧，測定上清液中的活性成分含量并評價發(fā)酵液在化妝品方面的功效[6]，以期對馬齒莧的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 儀器 高壓滅菌鍋，上海申安醫(yī)療機械廠；全溫度振蕩培養(yǎng)箱，太倉華美生化儀器廠；UVmini-1240型紫外可見分光光度計，日本島津有限公司；低速大容量臺式離心機，無錫市瑞江分析儀器有限公司；pH計，美國優(yōu)特公司；GSY-G1型固含物測量儀，深圳芬析儀器制造有限公司。

1.1.2 試劑 馬齒莧干品，北京同仁堂集團公司；黃酒酵母，北京市食品釀造研究所；DPPH，分析純，Sigma公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硫酸、苯酚、氫氧化鈉、硝酸鋁、水楊酸、福林酚、FeSO4、H2O2、過硫酸鉀等試劑均為國產分析純；小鼠黑素瘤細胞（B16），中國科學院細胞庫；DMEM，美國Gibco公司。

1.2 方法

1.2.1 馬齒莧發(fā)酵液制備 稱取一定量馬齒莧粉末，按照1∶20的料液比（m∶V）加入去離子水，于121 ℃高壓滅菌25 min，冷卻后接入5%的黃酒酵母菌液，于28 ℃、180 r/min的空氣搖床中培養(yǎng)48 h，然后4 800 r/min離心20 min，上清液即為馬齒莧發(fā)酵液。

1.2.2 馬齒莧發(fā)酵液理化指標測定 分別用pH計和固含物測量儀對馬齒莧發(fā)酵液的pH以及可溶性固形物含量進行測定。

1.2.3 馬齒莧發(fā)酵液中主要活性成分含量的測定 發(fā)酵液中總糖含量的測定參考文獻[7]，總黃酮含量的測定采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH顯色法[8]，蛋白質含量的測定參考文獻[9]。

1.2.4 馬齒莧發(fā)酵液對DPPH自由基的清除作用 取等體積的樣品液與2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻（A樣品），取等體積的去離子水與2×10-4 mol/L的DPPH溶液混勻（A空白），取等體積的去離子水與樣品液混勻（A對照），反應30 min后，在517 nm下測 A樣品、A空白、A對照吸光度。發(fā)酵液對DPPH清除率計算公式為清除率=[A空白-（A樣品-A對照）]/A空白×100%。

1.2.5 馬齒莧發(fā)酵液對B16細胞中酪氨酸酶活性抑制試驗 選擇對數(shù)生長期狀態(tài)良好的B16細胞，胰酶消化后計數(shù)，接種于6孔培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；更換培養(yǎng)基，加入供試品及對照品，以未處理的細胞作為陰性對照組，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h；將培養(yǎng)板置于冰上，培養(yǎng)基棄掉，加入PBS洗滌1次；加入裂解液，細胞刮刀刮取細胞，收集至離心管中；4 ℃離心20 min，吸取上清液；取50 μL細胞上清液至96孔板，再加入50 μL 1%左旋多巴，37 ℃孵育1 h；于M3讀板儀上475 nm處讀取吸光度。酪氨酸酶活性變化=[（A測定-A空白）/（A對照-A空白）]×100[10]。

2 結果與分析

2.1 馬齒莧發(fā)酵液理化指標

馬齒莧發(fā)酵液為淡黃色液體，測得發(fā)酵液的pH為5.61，偏酸性，與人類皮膚的酸堿度相近，適宜作為化妝品原料。發(fā)酵液中可溶性固形物含量為5.11%，可進一步測定發(fā)酵液中可溶性化合物的含量。

2.2 馬齒莧發(fā)酵液中主要活性成分的含量

以葡萄糖的濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度為縱坐標作標準曲線，得到回歸方程為y=0.015 1x+0.004 2，R2=0.999 6，將發(fā)酵液測得的吸光度代入標準曲線得到總糖濃度為3.90 mg/mL。從蘆丁標準曲線得到回歸方程y=1.971 5x+0.001 06，R2=0.999 4，由此計算得出發(fā)酵液中黃酮含量為0.59 mg/mL。對吸光度和牛血清蛋白濃度進行線性回歸處理，回歸方程為y=0.001 4x+0.031 3，R2=0.999 1，將樣品吸光度代入方程計算出蛋白質濃度為55.72 μg/mL。馬齒莧發(fā)酵液中總糖含量最高，其次為黃酮和蛋白質。在化妝品中，多糖可起到抗皺保濕的效果；黃酮類物質可清除多余的自由基，發(fā)揮抗氧化活性；蛋白質是組成人體細胞、組織的重要成分，可保持皮膚彈性潤澤。

2.3 馬齒莧發(fā)酵液對DPPH自由基的清除作用

圖1為馬齒莧發(fā)酵液和水提液對DPPH自由基的清除效果。從圖1可以看出，當濃度在5%以內時發(fā)酵液和水提液對DPPH自由基的清除率均呈現(xiàn)出良好的量效關系；當濃度大于5%時，兩種提取液對DPPH自由基的清除率趨于平緩。清除50%的DPPH自由基需要1.89%的發(fā)酵液或2.46%的水提液，20%的發(fā)酵液和水提液對DPPH自由基的清除率分別為90.12%和80.68%，馬齒莧發(fā)酵液對DPPH自由基的清除活性大于水提液。

2.4 馬齒莧發(fā)酵液對B16細胞中酪氨酸酶活性的影響

皮膚中黑色素的合成是一個多步驟的酶促生化反應，受到復雜而精細的調控，其中酪氨酸酶是黑色素合成的關鍵酶，該酶催化黑素合成的早期限速反應[11]。圖2為不添加馬齒莧發(fā)酵液和添加了1%的馬齒莧發(fā)酵液對B16細胞中酪氨酸酶活性的影響，可以看出，使用馬齒莧發(fā)酵液的B16細胞中酪氨酸酶活性明顯降低。因此，馬齒莧發(fā)酵液可以通過抑制黑色素合成過程中所需要的酪氨酸酶的活性來抑制黑色素的合成，從而起到美白作用。

3 小結

馬齒莧中含有多種對人類有益的活性成分，經過黃酒酵母發(fā)酵，得到的上清液中總糖、黃酮含量分別為3.90、0.59 mg/mL，多糖含量為55.72 μg/mL，經過進一步提取分離純化可得到這些成分，發(fā)酵液提取與有機溶劑提取法相比更加環(huán)保和方便。微生物發(fā)酵法近年來很受歡迎，有益菌不僅可以提取出活性成分，還可以將這些成分變成小分子更有利于人體吸收[12]，具有廣闊的市場前景。

同時，發(fā)酵液對DPPH自由基有良好的清除效果，當發(fā)酵液添加量大于5%時對DPPH自由基的清除率在90%以上，明顯優(yōu)于水提液，表明馬齒莧發(fā)酵液具有良好的體外抗氧化活性。通過細胞試驗證明了馬齒莧發(fā)酵液可以通過抑制酪氨酸酶活性的途徑來抑制細胞中黑色素的合成，進而發(fā)揮皮膚美白作用。

參考文獻：

[1] 朱 麗，徐為公，趙廣榮.馬齒莧的研究現(xiàn)狀與綜合開發(fā)利用[J].河北林果研究，2006，21（2）：198-201.

[2] 中華人民共和國藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：33.

[3] 周亞麗.馬齒莧的藥理作用與營養(yǎng)保健價值[J].承德醫(yī)學院學報，2011，28（1）：88-89.

[4] 周 鈞.天然抗過敏劑馬齒莧萃取液[J].香料香精化妝品，2007， 6（3）：58.

[5] 趙雯瑋，陳祥貴，李 鑫.微生物發(fā)酵在中藥研究中的應用[J].生命科學儀器，2008，6（10）：3-5.

[6] 王冬冬，陳雪紅，曹冬梅，等.微生物法提取馬齒莧和銀杏葉黃酮及其抗氧化活性研究[J].湖北農業(yè)科學，2015，54（6）：1455-1457.

[7] 劉志明，唐彥君，吳海舟，等.苯酚-硫酸法測定葡萄酒中總糖含量的樣品處理[J].中國釀造，2011（2）：158-161.

[8] 鄭媛媛，李 辰，封士蘭，等.油橄欖葉中總黃酮含量測定方法探討[J].光譜學與光譜分析，2011，31（2）：547-550.

[9] 賈維寶，劉良忠，黃 婷，等.幾種用于肽粉中蛋白質含量測定方法的比較[J].武漢輕工業(yè)大學學報，2016，35（1）：17-20.

[10] 趙 丹，許丹妮，王冬冬，等.靈芝發(fā)酵液的成分檢測及美白與抗衰老功效評價[J].日用化學工業(yè)，2016，46（4）：226-230.

[11] MICHAELA BRENNER，HEARING V J. Modifying skin pigmentation-approaches through intrinsic biochemistry and exogenous agents[J].Drug Discovery Today：Disease Mechanisms，2008，5（2）：189-199.

[12] 楊 艷.腸道益生菌生物轉化桑葚花青素與應用研究[D].南昌：江西農業(yè)大學，2014.