IL-6、NF-κB、CD40和Id4在前列腺癌中的表達(dá)及意義

姜良真 崔 喆 崔小健 姚慶祥

(天津泰達(dá)醫(yī)院泌尿外科，天津 300457)

IL-6、NF-κB、CD40和Id4在前列腺癌中的表達(dá)及意義

姜良真 崔 喆1崔小健 姚慶祥

(天津泰達(dá)醫(yī)院泌尿外科，天津 300457)

目的 探討白細(xì)胞介素(IL)-6、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB、CD40和分化抑制因子(Id)4在前列腺癌(PCa)中的表達(dá)及意義。方法 采用免疫組化技術(shù)選取60例PCa(PCa組)和38例前列腺增生癥(BPH組)，檢測(cè)兩組IL-6、NF-κB、CD40和Id4的表達(dá)差異。結(jié)果 IL-6、NF-κB、Id4和CD40在PCa組織表達(dá)水平均較BPH組織高(P<0.05)；IL-6在PCa組織中表達(dá)與前列腺特異抗原(PSA)水平、Gleason評(píng)分和臨床分期密切相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；NF-κB、CD40和Id4在PCa組織中表達(dá)與PSA水平和臨床分期密切相關(guān)(P<0.05)，與Gleason評(píng)分和年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；IL-6、NF-κB、CD40和Id4在PCa組織中的表達(dá)水平與其病理分級(jí)相關(guān)，即分化程度越低，其陽(yáng)性表達(dá)越高，同其在BPH組織中的表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 PCa組織中IL-6、NF-κB、CD40和Id4水平的異常表達(dá)，可能起重要的BPH生物學(xué)行為作用，可為治療PCa的療效和預(yù)后的判斷提供生化指標(biāo)，并為將來(lái)PCa的生物免疫治療和基因治療提供新的研究選擇。

白細(xì)胞介素-6；核轉(zhuǎn)錄因子；CD40；分化抑制因子4；前列腺癌

前列腺癌(PCa)的發(fā)病機(jī)制尚不明確，可能與環(huán)境、年齡、種族和遺傳因素相關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道〔1〕，慢性前列腺炎與PCa密切相關(guān)，在PCa發(fā)生發(fā)展中起重要的作用。白細(xì)胞介素(IL)-6、核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB和環(huán)氧合酶(COX)等可能是慢性前列腺炎在誘導(dǎo)PCa發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的一些關(guān)鍵調(diào)控因子。本研究旨在通過(guò)免疫化學(xué)方法檢測(cè)IL-6、NF-κB、CD40和分化抑制因子(Id)4在PCa和前列腺增生(BPH)組織中表達(dá)水平，分析其與BPH病情進(jìn)展的相關(guān)性及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年6月至2016年6月天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院泌尿外科收治的前列腺疾病患者，采用免疫組化技術(shù)選取60例PCa(PCa組)和38例BPH(BPH組)患者。PCa患者按美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)2002版TNM分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行臨床分期、Gleason評(píng)分。高分化：Gleason 2～4分；中分化：Gleason 5～7分；低分化：Gleason 8～10分。60例PCa患者中有6例高分化；21例中分化；33例低分化。臨床分期：T1～T2期40例；T3～T4期20例。PCa組和BPH組年齡分別為(73.57±3.47)歲、(72.36±3.04)歲。收集上述病例PCa和BPH同期手術(shù)切除的鮮活組織標(biāo)本，取PCa和BPH切除鮮活組織80 g，置于凍存管中加入凍存液放入液氮中保存。

1.2 方法 采用免疫組化SP法。所有標(biāo)本經(jīng)磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗后采用4%多聚甲醛PBS內(nèi)固定，并采用常規(guī)石蠟包埋標(biāo)本，后將石蠟包埋的標(biāo)本切成4 μm厚度連續(xù)切片，后將切片經(jīng)二甲苯進(jìn)行脫臘，后由梯度酒精進(jìn)行水化，并將水化后的切片用PBS(pH7.4)反復(fù)沖洗3次，去除切片表面酒精；隨后將切片放入0.01 mol/L，pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行微波修復(fù)抗原。每張切片滴加50 μl 3%過(guò)氧化氫溶液后放入恒溫培養(yǎng)箱37℃孵10 min，除去PBS后滴加山羊血清封閉。每張切片滴加50 μl一抗體(IL-6、NF-κB、CD40和Id4抗體濃度分別為1∶800、1∶1 000、1∶100、1∶100)后放置4℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，去除PBS，加入二抗后37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育15 min，PBS沖洗，去除PBS液后，將新鮮配置的二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液向每張切片滴加50 μl；后用蘇木素進(jìn)行復(fù)染2 min，隨后用0.1%鹽酸溶液進(jìn)行分化，之后先用蒸餾水沖洗，再用PBS沖洗；后經(jīng)梯度酒精進(jìn)行脫水干燥，將處理好的標(biāo)本采用中性樹(shù)膠封片，后在顯微鏡下對(duì)制成的切片進(jìn)行觀察。陰性對(duì)照采用PBS代替一抗。

1.3 免疫結(jié)果判定 切片在低高倍鏡下進(jìn)行觀察。NF-κB、IL-6和CD40主要在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)中表現(xiàn)出陽(yáng)性；而Id4主要在細(xì)胞核或胞質(zhì)中表達(dá)陽(yáng)性。IL-6、NF-κB、Id4和CD40染色后呈棕黃色或棕褐色顆粒則為陽(yáng)性表達(dá)。標(biāo)本分級(jí)參照文獻(xiàn)〔2〕分級(jí)方法，在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野并對(duì)其進(jìn)行結(jié)果判定，并采用陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度和所占百分比綜合計(jì)分。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：將陽(yáng)性細(xì)胞所占切片標(biāo)本的百分比在5%以?xún)?nèi)評(píng)定為陰性，超過(guò)5%定為陽(yáng)性。陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)所占百分比低于5%計(jì)0分，占比5%～25%計(jì)1分,占比26%～50%,計(jì)2分,超過(guò)50%計(jì)3分。染色強(qiáng)度：0分為無(wú)色；1分為淡黃色；2分為棕黃色；3分為棕褐色。每例標(biāo)本最后得分為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與染色強(qiáng)度乘積，0分為陰性(-)；1～3分為弱陽(yáng)性(+)；4～5分為陽(yáng)性()；超過(guò)5分為強(qiáng)陽(yáng)性()。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行Fisher精確檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)檢。

2 結(jié) 果

2.1 PCa組織中IL-6、NF-κB、CD40和Id4表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 IL-6在PCa組織中表達(dá)與PSA水平、Gleason評(píng)分和臨床分期密切相關(guān)(P<0.05)，與患者年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)；NF-κB、CD40和Id4在PCa組織中達(dá)到與PSA水平和臨床分期密切相關(guān)(P<0.05)，與Gleason評(píng)分和年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 IL-6、NF-κB、CD40和Id4在兩組織中的陽(yáng)性表達(dá)情況 PCa組和BPH組中IL-6、NF-κB、CD40和Id4陽(yáng)性表達(dá)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3 IL-6、NF-κB、CD40和Id4在不同分化的PCa組織中的表達(dá) IL-6、NF-κB、CD40和Id4在低分化PCa組織中檢出陽(yáng)性率高于中分化和高分化組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1 PCa組織中NF-κB、IL-6、Id4和CD40表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系(n)

表2 PCa組和BPH組中IL-6、NF-κB、CD40和Id4陽(yáng)性表達(dá)情況(n)

表3 IL-6、NF-κB、CD40和Id4在不同分化的PCa組織中表達(dá)(n)

3 討 論

BPH具有較長(zhǎng)的病程，且早期癥狀跟BPH相似，同時(shí)人們對(duì)BPH的早期篩查觀念意識(shí)薄弱，大部分患者尋醫(yī)就診時(shí)已處于晚期，錯(cuò)過(guò)了最佳的手術(shù)治療時(shí)機(jī)，只能通過(guò)內(nèi)分泌治療延緩病程的發(fā)展，經(jīng)過(guò)中位有效的1～3年的治療后，逐步發(fā)展成激素抵抗性BPH，臨床癥狀也隨之惡化，放化療治療不能延長(zhǎng)患者的中位生存期。

IL-6是一種多功能促炎因子，其可由腫瘤組織細(xì)胞合成分泌并釋放，從而對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)和分化進(jìn)行調(diào)節(jié)，不僅有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)的作用，還在抗感染免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。IL-6表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致機(jī)體并發(fā)多種疾病，IL-6發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用是在其低表達(dá)時(shí)，而當(dāng)其在體內(nèi)高表達(dá)時(shí)，因其在體內(nèi)分泌釋放過(guò)多導(dǎo)致其濃度過(guò)高，而病理部位遭受高濃度IL-6刺激可造成損傷，甚至使病情惡化，進(jìn)而在諸多疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用〔3〕。慢性前列腺炎患者的前列腺液中IL-6水平較健康人群高，主要是因其巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生大量IL-6進(jìn)入前列腺液，其旁分泌產(chǎn)生的IL-6經(jīng)IL-6-磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶途徑釋放而激活蛋白激酶，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)和細(xì)胞周期，進(jìn)而引起腫瘤病變，這可能是導(dǎo)致炎癥惡化為腫瘤過(guò)程并維持腫瘤持續(xù)增長(zhǎng)狀態(tài)的重要機(jī)制〔3〕。雄激素非依賴(lài)性(DU-145、PC-3)等細(xì)胞株可大量分泌釋放IL-6，并對(duì)自身癌細(xì)胞生長(zhǎng)具有刺激作用，從而對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)發(fā)育起促進(jìn)作用。顯然PCa的病發(fā)及病情進(jìn)展受到IL-6旁分泌和自分泌的影響。IL-6參與腫瘤血管的生成，且mTORC1途徑的激活受IL-6與其亞基GP130結(jié)合產(chǎn)物作用，并在炎癥惡化為腫瘤的過(guò)程中發(fā)揮重要作用，mTORC1抑制劑的應(yīng)用可使腫瘤組織血管的生成和細(xì)胞增殖減少。He等〔4〕發(fā)現(xiàn)PCa患者Gleason評(píng)分超過(guò)6分或伴有骨轉(zhuǎn)移的組織中出現(xiàn)IL-6高表達(dá)，且與PSA水平和Gleason評(píng)分密切相關(guān)，同本研究結(jié)果相符。

NF-κB作為細(xì)胞質(zhì)表達(dá)的一種核轉(zhuǎn)錄因子，參與免疫應(yīng)答、細(xì)胞凋亡、腫瘤形成和轉(zhuǎn)移等過(guò)程。NF-κB誘導(dǎo)腫瘤的機(jī)制主要是作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)周期，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。機(jī)體組織長(zhǎng)期處于炎癥環(huán)境中可刺激NF-κB高表達(dá)。轉(zhuǎn)錄活化分子(STAT)-3與NF-κB途徑有關(guān)，STAT-3是腫瘤形成的重要因子，而NF-κB上調(diào)可以促進(jìn)STAT-3表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤形成。PSA結(jié)構(gòu)上有4個(gè)NF-κB的作用靶點(diǎn)，而雄激素非依賴(lài)性PCa組織細(xì)胞中存在諸多NF-κB作用靶點(diǎn)，PSA水平受腫瘤細(xì)胞調(diào)控NF-κB表達(dá)水平的影響〔5〕。另外，在PCa中IL-6可通過(guò)磷脂酰肌醇激酶-蛋白激酶途徑促進(jìn)NF-κB表達(dá)，且IL-6因子是通過(guò)NF-κB途徑來(lái)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。

CD40是細(xì)胞表面的白細(xì)胞分化抗原，常在抗原提呈細(xì)胞(APC)中表達(dá)，如B細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等。CD40和單核巨噬細(xì)胞表面受體結(jié)合從而誘導(dǎo)基質(zhì)釋放金屬蛋白酶，從而使腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲〔6〕。NF-κB途徑和JNK途徑是CD40分子介導(dǎo)的多種途徑中兩條最重要的途徑。其中NF-κB途徑在B細(xì)胞增殖、分化、生存及生成抗體過(guò)程發(fā)揮作用。使B細(xì)胞存活基因的表達(dá)上調(diào)，從而促使腫瘤細(xì)胞的增殖，腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲和腫瘤組織血管的生成等〔7〕。

Id4是一個(gè)螺旋環(huán)螺旋(HLH)蛋白的類(lèi)別，在細(xì)胞的分化、增殖、凋亡并在其中發(fā)揮重要作用〔8〕。Id因子不僅可使細(xì)胞周期從G1期向S期發(fā)展，還對(duì)細(xì)胞周期抑制因子(CKIs)p21相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)起抑制作用，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)周期的進(jìn)程起促進(jìn)作用。Id4既可誘發(fā)腫瘤發(fā)生，且同腫瘤血管形成密切相關(guān)，還有對(duì)癌癥抑制作用。正常組織中Id4表達(dá)水平很低或者不表達(dá)，其在BPH組織中發(fā)揮的作用和調(diào)節(jié)機(jī)制目前還尚未明確。本研究結(jié)果中低分化組織中IL-6、NF-κB、CD40和Id4陽(yáng)性表達(dá)水平高于中分化和高分化組織。這可能與各因子的表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生存和對(duì)放化療藥物的抵抗和耐受，而各因子高表達(dá)水平患者平均生存期均較短，可作為部位腫瘤患者預(yù)后的生化指標(biāo)。

CD40和Id4在PCa中的發(fā)病機(jī)制尚不明朗，其在PCa組織中的異常表達(dá)，可能在PCa生物學(xué)行為中起重要作用。因此，IL-6、NF-κB、CD40和Id4的研究可為BPH患者的篩查和治療及預(yù)后判斷提供可靠的生化指標(biāo)。

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〔2016-12-28修回〕

(編輯 袁左鳴)

姜良真(1983-)，男，碩士，主治醫(yī)師，主要從事泌尿外科研究。

R737

A

1005-9202(2017)09-2199-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.054

1 天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院