姜黃素對2型糖尿病腎病模型大鼠腎臟氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)代謝的保護(hù)作用

馬麗芬 蘇振麗 王文科 閆麗娟

(寶雞市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西 寶雞 721008)

姜黃素對2型糖尿病腎病模型大鼠腎臟氧化應(yīng)激以及脂質(zhì)代謝的保護(hù)作用

馬麗芬 蘇振麗 王文科 閆麗娟

(寶雞市中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，陜西 寶雞 721008)

目的 從氧化應(yīng)激和脂質(zhì)代謝方面探究姜黃素是否可以緩解糖尿病腎病。方法 將動物隨機(jī)分為3組，以Long-Evans-Tokushima-Otsuka大鼠作為正常對照組(CON組)；以O(shè)tsuka-Long-Evans-Tokushima Fatty (OLETF)大鼠作為糖尿病(DM)組；以姜黃素(100 mg·kg-1·d-1)處理OLETF大鼠作為姜黃素處理組(CUR組)，檢測各組大鼠體重和腎臟重量，在45 w時檢測血糖、脂聯(lián)素、總膽固醇(TC)和甘油三酯(TG)水平。用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗檢測尿液中超氧化物歧化酶(SOD)，高效液相色譜檢測尿液中丙二醛(MDA)，電鏡觀察腎臟組織中腎小球基底膜和裂孔，用Western印跡實驗檢測AMPK通路相關(guān)蛋白以及Nrf2相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 姜黃素能夠降低大鼠蛋白尿，降低血清中TG、TC以及游離脂肪酸水平，并且通過AMPK通路降低脂質(zhì)積累；姜黃素可通過Nrf2通路緩解氧化應(yīng)激，逆轉(zhuǎn)葡萄糖引起的腎小球基底膜病理生理改變。結(jié)論 在糖尿病腎病中，姜黃素通過Nrf2和AMPK信號通路抑制氧化應(yīng)激和脂質(zhì)積累，從而發(fā)揮保護(hù)作用。

姜黃素；糖尿病腎??；AMPK信號通路；Nrf2信號通路

糖尿病腎病(DN)是常見的腎臟疾病，也是糖尿病(DM)常見并發(fā)癥，在全球具有較高的死亡率〔1，2〕。在DM早期階段，升高的血糖超過腎臟從超濾液中重吸收葡萄糖的能力〔3〕，導(dǎo)致葡萄糖積累，增加滲透壓和尿液體積。在DM發(fā)展期，高血糖和腎小球高濾過導(dǎo)致蛋白尿，進(jìn)而導(dǎo)致基底膜增厚、腎小球膜擴(kuò)張及腎小球硬化〔4，5〕。2型糖尿病(T2DM)往往伴隨著血脂升高，例如總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)和游離脂肪酸〔6〕。有研究報道腎臟脂質(zhì)積累誘發(fā)的氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致腎臟功能紊亂〔7〕。姜黃素是植物姜黃(Curcuma Longa Linn)根莖主要活性成分，微黃的姜黃素具有抗癌、抗氧化和抗感染的作用〔8，9〕。已有研究報道姜黃素可以用于治療腎病、血管疾病以及視網(wǎng)膜病等〔10～12〕，有報道稱姜黃素的抗氧化作用是通過上調(diào)超氧化物歧化酶(SOD)而實現(xiàn)〔13〕。在脂質(zhì)代謝方面，姜黃素可降低膽固醇以及DM患者中血液和尿中脂質(zhì)氧化物〔14〕。姜黃素可能減少DN脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激。本次研究探討姜黃素是否能夠降低T2DM伴DN大鼠模型中脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激以及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Long-Evans-Tokushima-Otsuka大鼠和Otsuka-Long-Evans-Tokushima Fatty (OLETF) 大鼠購自O(shè)tsuka Pharmaceutical公司，姜黃素購自AnHui New Star Pharmaceutical Development公司，抗p-AMPK，抗AMPK和抗p-ACC抗體購自Cell Signaling Technology公司，抗β-actin、抗Nrf2、抗Keap1、抗HO-1、抗SREBP1、抗SREBP2和抗adipose differentiation related protein (ADRP)、抗血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 動物分組 本次動物實驗均經(jīng)過動物倫理委員會同意。在自然生長第25周取30只動物隨機(jī)分為3組：10只雄性Long-Evans-Tokushima-Otsuka大鼠作為正常對照組(CON組)，20只雄性O(shè)LETF大鼠平均分為糖尿病(DM)組和姜黃素處理(CUR)組。將大鼠飼養(yǎng)在恒溫20℃～22℃、濕度50%～60%環(huán)境中，每天12 h光照，12 h黑暗，喂養(yǎng)水和標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料。25～45 w期間CUR組大鼠用姜黃素灌胃，劑量為100 mg·kg-1·d-1；DM組以同樣劑量和方式灌胃生理鹽水。為創(chuàng)建T2DM模型誘導(dǎo)高血糖和糖尿病，用30%蔗糖溶液喂養(yǎng)DM組和CUR組。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 大鼠在45 w時禁食過夜，腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉。通過心臟穿刺取血，置于用乙二胺四乙酸鈉處理過的小管中，在大鼠死亡前，用生理鹽水灌注并除外左腎。離心血液，將澄清的血漿儲存在-80℃冰箱中。去除腎臟以及附睪脂肪，左腎用液氮快速冷凍。一部分右腎用4%多聚甲醛固定48 h，用石蠟包埋用于組織學(xué)觀察。剩余部分右腎用3%戊二醛在4℃下處理24 h用于超微結(jié)構(gòu)研究。用DRI-CHEM 3500i檢測血脂。

1.3.2 血糖和胰島素水平檢測 分別在25 w和45 w檢測體重和血糖水平，并且腹腔注射葡萄糖行耐受實驗(IPGTT)以及靜脈注射胰島素耐受實驗(IVITT)。胰島素抵抗指標(biāo)計算公式：血漿葡萄糖消失速率常數(shù)(Kitt)=0.693/T1/2×100。胰島素抵抗穩(wěn)態(tài)模式評估(HOMI-IR)=空腹胰島素(FIN,μU/ml)×空腹葡萄糖(FBS,mmol/ml)/22.5。 胰島素分泌(HOMI-β)=20×FIN(μU/ml)/FBS(mmol/L)-3.5。

1.3.3 丙二醛(MDA)實驗 用高效液相色譜檢測MDA，先用0.1125N PCA和40 mmol/L 2-硫代巴比妥酸處理尿液樣品，97℃加熱1 h形成衍生物。然后將溶液放在冰上20 min終止反應(yīng)，20 min之后加入甲醇和20%三氯乙酸緩沖液。將樣品震蕩混合并且13 000 r/min離心6 min。取上清在熒光檢測器下讀數(shù)，激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射波長為560 nm。

1.3.4 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)實驗 收集24 h尿液檢測白蛋白、肌酐和尿中SOD。血漿中FIN、脂聯(lián)素和游離脂肪酸(FFA)檢測用ELISA試劑盒。

1.3.5 腎皮質(zhì)組織學(xué)觀察 用切片機(jī)將石蠟包埋的組織切為5 μm厚度薄片，之后用蘇木精-伊紅(HE)染色，用光學(xué)顯微鏡以及攝像系統(tǒng)觀察切片。每張切片隨機(jī)選擇10個正切的腎小球，檢測腎小球平均截面積(MGA)，取其平均值作為每個標(biāo)本的MGA ，根據(jù)腎小球平均面積計算腎小球體積(MGV)，MGV=1.25×(MGA)3/2 。

1.3.6 透射電鏡觀察腎小球 腎組織先用4%多聚甲醛固定，然后用2%鋨酸(pH7.4)固定(4℃)，用乙醇丙酮梯度脫水，EDPON-816 環(huán)氧樹脂包埋，將樣品制備成為超薄切片，鈾-鉛雙重染色，透射電鏡觀察腎超微結(jié)構(gòu)，分析腎小球足細(xì)胞足突之間裂孔數(shù)量以及腎小球基底膜厚度。

1.3.7 Western印跡實驗 選取20 mg腎臟組織加入400 μl RIPA裂解液，用勻漿機(jī)將組織勻漿，13 000 r/min離心13 min并取上清。BCA工作液根據(jù)BSA(0.5 mg/ml)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測不同處理細(xì)胞蛋白濃度，制備上樣蛋白(40 μg)。在8% SDS-PAGE凝膠中分離，之后電轉(zhuǎn)到PVDF膜上。PVDF膜用5%脫脂牛奶室在室溫封閉1 h，PBS洗3次，5 min/次，之后孵育相應(yīng)抗體。在4℃環(huán)境下過夜，PBS洗3次，5 min/次。孵育相應(yīng)的二抗，PBS洗3次，5 min/次。在膜上均勻撒ECL化學(xué)發(fā)光液后在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中顯影。

1.3.8 腎皮質(zhì)中TG含量測定 主要檢測溶解細(xì)胞之后水解TG分子釋放的甘油，TG的濃度根據(jù)甘油的檢測值計算。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行ANOVA或者重復(fù)測量的ANOVA檢驗t檢驗分析兩組之間的差異。用GraphPad Prism5.0進(jìn)行統(tǒng)計作圖。

2 結(jié) 果

2.1 姜黃素對FBS和FIN水平的影響 與CON組相比，DM組顯著升高FBS，并且顯著降低FIN水平。DM組Kitt值、HOMA-β低于CON組(P<0.05)。3組HOMA-IR水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。DM組與CON相比，IVITT和IPGTT差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。然而，DM組和CUR組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

表1 各組血糖和胰島素水平檢測

與CON組比較：1)P<0.05

2.2 姜黃素對尿白蛋白排泄和尿白蛋白肌酐比值水平影響 在45 w時，DM組24 h尿白蛋白排泄〔(28.67±5.11)mg〕和尿白蛋白肌酐比值〔(3.49±1.85)mg/mg Cr〕與CON組〔(1.56±0.18)mg,(0.13±0.05)mg/mg Cr〕相比差異顯著(P<0.05)；而CUR組〔(11.24±2.03)mg,(1.56±1.12)mg/mg Cr〕與DM組相比，其可顯著降低尿白蛋白排泄和尿白蛋白肌酐比值(P<0.05)。

2.3 姜黃素對腎小球損傷的影響 HE染色可見，DM組腎小球肥大，姜黃素處理之后可減輕DM所引起的腎小球肥大。與CON組〔(0.84±0.19)μm3/106〕相比，DM組腎小球體積〔(1.40±0.16)μm3/106〕增加，姜黃素處理之后可減少腎小球體積〔(1.12±0.12)μm3/106〕。與CON組〔(138.26±21.26)nm〕相比，DM組腎小球基底膜厚度〔(190.13±19.54)nm〕增加，同時DM組足細(xì)胞足突融合。DM組腎小球基底膜上足細(xì)胞足突之間裂孔數(shù)量 〔(1 206.64±221.96)個〕與CON組〔(2 315.58±249.88)個〕相比明顯減少(P<0.05)。姜黃素處理之后可逆轉(zhuǎn)DM引起的基底膜厚度增加與裂孔數(shù)量減少〔(155.34±15.56)nm,(1 603.22±236.43)個〕。見圖2。

與CON組比較：1)P<0.05 圖1 各組IVITT和IPGTT結(jié)果

圖2 姜黃素對腎臟組織形態(tài)變化的影響

2.4 姜黃素對氧化應(yīng)激的影響 在收集的24 h尿中，與DM組〔(6.87±1.12)U/ml〕相比，姜黃素處理之后可顯著升高SOD水平〔(10.16±1.23)U/ml,P<0.05〕，CON組尿SOD水平為(8.35±0.81)U/ml。與CON組〔(2.49±1.24)μmol/g Cr〕相比，DM組MDA水平〔(6.68±2.98)μmol/g Cr〕顯著升高(P<0.05)；姜黃素處理之后，MDA水平顯著降低〔(4.06±1.14)μmol/g Cr,P<0.05〕。Nrf2/Keap1與HO-1蛋白表達(dá)在姜

黃素處理之后顯著升高(1.62±0.24，1.37±0.38)，與DM組(0.38±0.14，0.60±0.12)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。CON組Nrf2/Keap1、HO-1蛋白表達(dá)水平分別為0.98±0.13，0.99±0.13，見圖3。

2.5 姜黃素對體重和脂質(zhì)相關(guān)靶分子水平的影響 表2可見，在姜黃素處理之前，即起始體重DM組、CUR組與CON組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而三組最終體重?zé)o顯著差異(P>0.05)。DM組與CUR組腎臟重量與體重比顯著高于CON組(P<0.05)。CUR組附睪脂肪重量與體重的比值與CON組相比顯著減少(P<0.05)。將脂聯(lián)素值除以附睪脂肪重量與體重相比的比值，CUR組所得數(shù)值顯著高于DM組(P<0.05)。CUR組含量顯著高于CON組(P<0.05)。姜黃素處理之后，CUR組TG含量顯著減少，與DM組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。DM組中AMPK蛋白磷酸化(p-AMPK)與ACC磷酸化(p-ACC)表達(dá)減少，與CON組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而姜黃素處理之后發(fā)生逆轉(zhuǎn)，p-AMPK與p-ACC表達(dá)減少(P<0.05)。DM組中SPEBP-1和SREBP-2蛋白表達(dá)較CON組增加(P<0.05)，而姜黃素處理之后顯著抑制SPEBP-1和SREBP-2蛋白表達(dá)(P<0.05)。同樣，ADRP蛋白在DM組中表達(dá)增加，姜黃素處理之后可降低ADRP的表達(dá)(P<0.05)。見圖4。

圖3 姜黃素對腎皮質(zhì)中Nrf2/Keap1和HO-1蛋白表達(dá)的影響

組別起始體重(g)最終體重(g)左腎重量/體重附睪脂肪重量/體重脂聯(lián)素(μg/ml)脂聯(lián)素(μg/ml)/附睪脂肪重量/體重比值TC(mg/dl)TG(mg/dl)CON組46075±387254386±5091025±002234±026761±106325±0367903±14196188±1515DM組61466±60521)58022±7032038±0071)193±059541±1411)271±066100±17751)178±30841)CUR組61089±42291)55042±9033040±0071)163±0661)539±1881)386±1092)8477±995135±44251)2)

與CON組比較：1)P<0.05；與DM組比較：2)P<0.05

3 討 論

DN在臨床上主要表現(xiàn)為蛋白尿、腎小球基底膜增厚和足細(xì)胞足突裂孔數(shù)量減少。另外，通過檢測SOD和MDA以及Nrf2信號相關(guān)分子證明DM誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，AMPK信號相關(guān)蛋白脂質(zhì)分子改變可以提示異常的腎臟脂質(zhì)代謝，然而所有的這些異常改變都可以被姜黃素逆轉(zhuǎn)。

活性氧(ROS)在DN病理生理學(xué)改變中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用〔15〕。高血糖能夠誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而發(fā)展成為DN〔16〕。研究發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠增加尿液中SOD，與此同時，姜黃素可減少尿液中MDA。DN中，Nrf2表達(dá)減少，氧化應(yīng)激增加，Keap1通過Nrf2負(fù)性調(diào)節(jié)有助于增加氧化應(yīng)激〔17〕。DN腎臟皮質(zhì)中HO-1表達(dá)減少可能與Nrf2降低誘導(dǎo)產(chǎn)生ROS有關(guān)〔18〕。姜黃素通過上調(diào)Nrf2表達(dá)進(jìn)而增加HO-1表達(dá)，Nrf2激活可抑制T2DM腎臟脂質(zhì)積累〔19〕。

姜黃素還可以通過脂質(zhì)代謝影響DM并發(fā)癥。已有研究報道姜黃素能夠改善高脂血癥〔20〕，降低TC、TG水平可能與降低DN有關(guān)。T2DM中高TC、高TG和高FFA會導(dǎo)致脂肪在器官中異常累積，當(dāng)脂肪累積在腎臟中就可能導(dǎo)致慢性腎病〔21〕。 在DM組中P-AMPK減少，姜黃素處理之后激活A(yù)MPK磷酸化，說明姜黃素可能調(diào)控AMPK活性。SREBP-1促進(jìn)FFA合成〔22〕，SREBP-2促進(jìn)膽固醇合成〔23〕，在DM腎臟組織中，兩種蛋白表達(dá)升高，當(dāng)姜黃素處理之后降低SREBP-1和SREBP-2蛋白表達(dá)。ADRP是脂滴標(biāo)記物，在糖尿病組中表達(dá)上調(diào)，而姜黃素處理之后下調(diào)ADRP表達(dá)。AMPK調(diào)控脂肪酸關(guān)鍵通路是ACC磷酸化，ACC逆轉(zhuǎn)乙酰輔酶A成為丙二酰輔酶A，阻止脂肪酸氧化。姜黃素使ACC磷酸化，抑制脂肪酸轉(zhuǎn)運以及氧化。本研究發(fā)現(xiàn)涉及姜黃素抑制DN可能的機(jī)制是通過AMPK調(diào)控脂質(zhì)合成?？傊S素能夠降低血清中TG、TC以及FFA，并且通過AMPK通路降低脂質(zhì)積累。姜黃素通過Nrf2通路緩解腎小球病理生理改變以及氧化應(yīng)激。本研究結(jié)果表明姜黃素在DN中發(fā)揮保護(hù)作用可能是通過抗氧化和脂質(zhì)代謝，從而實現(xiàn)緩解病情。

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〔2017-01-02修回〕

(編輯 郭 菁)

馬麗芬(1980-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事內(nèi)分泌研究。

R587.1

A

1005-9202(2017)09-2128-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.020