受試者工作特征曲線分析在地中海貧血篩查中的應用價值

夏超然 黃 英 任兆瑞

上海交通大學附屬兒童醫(yī)院 上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學醫(yī)學遺傳研究所 衛(wèi)生部醫(yī)學胚胎分子生物學重點實驗室 上海市胚胎與生殖工程重點實驗室（上海 200040）

·論 著·

受試者工作特征曲線分析在地中海貧血篩查中的應用價值

夏超然 黃 英 任兆瑞

上海交通大學附屬兒童醫(yī)院 上海市兒童醫(yī)院 上海交通大學醫(yī)學遺傳研究所 衛(wèi)生部醫(yī)學胚胎分子生物學重點實驗室 上海市胚胎與生殖工程重點實驗室（上海 200040）

目的用受試者工作特征（ROC）曲線評價胎兒血紅蛋白（HbF）和HbA2在兒童地中海貧血篩查和診斷中的臨床應用價值。方法分別采用經(jīng)典法（醋纖法和Singer一分鐘堿變性實驗）和高效液相法（HPLC）對經(jīng)基因檢查確診的200例地貧患兒和62例正常對照者進行HbF和HbA2定量檢測。以基因檢測結果為金標準，采用ROC曲線分析法，分析HbF、HbA2曲線下面積（AUC）以及選擇不同切值對應的靈敏度和特異度，確定可行性篩查方案。結果α-和β-地中海貧血組中，HPLC法定量HbF、HbA2值的AUC均大于對應的經(jīng)典方法定量結果的AUC；β-地中海貧血組中，HPLC法定量HbA2對應的AUC最大，為0.991。采用ROC曲線法分析得到的截斷值，HbF（≥1.05%）、HbA（2≥3.75%）組成的聯(lián)合篩查方案的診斷符合率、靈敏度、特異度可分別達到99.2%、99.0%和100.0%。結論在進行大規(guī)模β-地中海貧血篩查時，采用HPLC定量的截斷值HbF（≥1.05）、HbA（2≥3.75）與血液學有關指標聯(lián)合的篩查方案可提高篩查的靈敏度、符合率和篩查效率。

地中海貧血; 受試者工作特征曲線; 篩查指標; 血紅蛋白

地中海貧血（thalassemia，簡稱地貧）是由于珠蛋白基因異常引起的一組血紅蛋白表達失調的遺傳性血液病，致病突變通過影響珠蛋白不同亞基相對數(shù)目以及血紅蛋白空間結構等導致溶血[1]。在廣東地區(qū)α-地貧和β-地貧的發(fā)病率分別高達12.03%、3.80%[2]。地貧常與結構異常的血紅蛋白變異體相伴存在，它們之間復雜的相互作用導致了更加多樣的臨床表型。因此，相關篩查、診斷技術的完善與發(fā)展意義重大。目前，已有的文獻資料大多是對發(fā)病率較高的區(qū)域進行的地貧流行病學調查，江浙滬地區(qū)兒童中該病的資料較少。近年來隨著人口流動性增加，在原來發(fā)病率相對較低的某些地區(qū)，地貧攜帶者比例呈現(xiàn)上升趨勢。選擇合適的篩查指標，制定快速、高效的聯(lián)合篩查方案，是降低漏診和誤診率的有效措施。對HbA2（α2δ2）、HbF（α2γ2）的定量分析是篩查地貧的重要參考指標，常用方法包括醋酸纖維素薄膜電泳（簡稱醋纖法）、Singer一分鐘堿變性實驗、高效液相色譜（HPLC）等技術[3]。但是，應用HPLC定量檢測HbF、HbA2對江浙滬地區(qū)兒童地貧的篩查評價尚缺乏明確的截斷值（cut-off value），因此，通過相應的實驗研究和統(tǒng)計分析確定這兩個指標的最佳截斷值對于提高該區(qū)域地貧篩查效率有重要價值。本研究對經(jīng)基因診斷確診的200例地貧患兒或雜合子和62名正常兒童進行篩查，即分別采用經(jīng)典篩查方法中醋纖法和Singer一分鐘堿變性實驗定量測定10%溶血液中的HbF和HbA2，采用HPLC法定量測定外周血中的HbF和HbA2，對所有樣本進行紅細胞參數(shù)測定，以基因診斷結果作為臨床診斷的金標準，采用受試者工作特征（ROC）曲線統(tǒng)計分析并比較不同方法定量測定HbF和HbA2的靈敏度、特異度，并確定相應的截斷值，評價最佳截斷值的HbF、HbA2在地貧篩查和診斷中的應用價值，為建立大規(guī)模地貧篩查方案提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選擇2014—2016年間在上海交通大學附屬兒童醫(yī)院經(jīng)基因檢查確診的200例地貧患兒（或雜合子）作為病例組。研究對象入選標準：①年齡18個月～13歲；②經(jīng)基因檢測已確診地貧；③有完整的臨床資料及標本。另選擇來院體檢年齡相匹配的62名正常兒童作為正常對照組。對照組入選標準：①年齡18個月～13歲；②無任何地貧表現(xiàn)；③排除感染、缺鐵性貧血等其他各種疾病。

1.2 方法

1.2.1 標本采集 采用EDTA-K2真空抗凝管常規(guī)采集2 mL研究對象外周靜脈血，分別按照生化實驗和基因檢測實驗要求對血液進行預處理、分離與保存（4℃）。

1.2.2 地貧的基因診斷 采用跨躍斷裂點PCR（GAP-PCR）法檢測α-地貧的缺失[東南亞型（SEA）、3.7/4.2]；采用反向點雜交（RDB）法檢測α-地貧突變[金斯敦型（CS）、廣西型（QS）、威斯密型（WS）]和β-地貧17種中國人群常見突變[3]。

1.2.3 血液學指標檢測 采用 SYSMEX XS-800i全自動血細胞分析儀（日本），按照標準操作規(guī)程對全血細胞Hb、紅細胞平均體積（mean corpuscular volume，MCV）、平均紅細胞血紅蛋白量（mean corpuscular hemoglobin，MCH）和紅細胞平均血紅蛋白濃度（mean corpuscular hemoglobin concentration，MCHC）進行測定，并作好室內質量控制，24 h內完成檢測[3]。

1.2.4 全自動HPLC分析 采用D-10TMDual HbA2/ F/A1cProgram（美國），按照操作說明進行HbA2、HbF和HbA1c含量測定。結果以各組洗脫面積占總洗脫面積的百分比來表示。同時應用Westgard 質控規(guī)則12s /13s 22sR4s進行室內質量控制[3,4]。

1.2.5 HbF Singer一分鐘堿變性實驗 將50 μL 10%的血紅蛋白溶血液和800 μL 0.083 mol/L NaOH（pH值12.7）混合，劇烈振蕩1 min，用酸性半飽和硫酸銨溶液終止反應，于540 nm波長下測定濾液光密度值[3]。

1.2.6 HbA2醋酸纖維薄膜電泳 以醋酸纖維薄膜為支持物，在電壓30 V/cm、硼酸緩沖液中電泳20 min，將對應條帶用ddH2O洗脫，于415 nm波長下測定光密度值[3]。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件，繪制ROC曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）及各參數(shù)截斷值的靈敏度、特異度。偏態(tài)計量資料以中位數(shù)表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；比較不同定量方法檢測HbF、HbA2在經(jīng)驗值、推薦截斷值和ROC最佳截斷值處的靈敏度、特異度。

2 結果

2.1 研究對象一般情況和基因檢測結果

病例組200例樣本，包含β-珠蛋白基因突變115例，其中男69例、女46例，α-珠蛋白基因突變85例，其中男50例、女35例；正常對照組中62例兒童的基因檢測顯示均無α-和/或β-珠蛋白基因異常，其中男22例、女40例。病例組中位年齡6.5歲（18月齡～13歲），正常對照組中位年齡6歲（20月齡～14歲），兩組年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（Z=1.84，P=0.066）。正常對照組與α-地貧組（χ2=0.001，P=0.981）、β-地貧組（χ2=0.005，P=0.945）的性別差異均無統(tǒng)計學意義。

2.2 HbF、HbA2不同定量測定結果的篩查價值

α和β-地貧組中，HPLC法定量HbF、HbA2值的AUC均大于對應的經(jīng)典方法定量結果；β-地貧組中HPLC法定量HbA2的AUC最大，為0.991，表明其對β-地貧診斷的準確性較好，與金標準的符合率較高。β-地貧組中，HPLC法與醋纖法定量HbA2的AUC均高于0.900，高于HPLC法與Singer一分鐘堿變性法定量HbF的AUC。見表1。

β-地貧組中，HPLC法和Singer一分鐘堿變性法定量HbF的最佳臨界值分別為1.05%、0.805%，前者對應的靈敏度、特異度均高于后者。HPLC法和醋纖法定量HbA2的最佳臨界值分別為3.75%、2.85%，前者對應的靈敏度、特異度均高于后者。α-地貧組中，HPLC法和經(jīng)典法測得的HbF的最佳臨界值分別為2.45%、2.03%，前者對應的靈敏度、特異度均高于后者。見表1、圖1、圖2。

2.3 HbF、HbA2截斷值確立對β-地貧篩查的影響

本研究采用Singer一分鐘堿變性實驗定量HbF的經(jīng)驗值1.31%作為判斷標準，結果高于1.31%判定為異常；采用HbA2醋纖法定量HbA2的經(jīng)驗值3.5%作為判斷標準，結果高于3.5%判定為異常；同時采用HPLC定量測定HbF、HbA2的試劑盒推薦截斷值1.0%、4.0%作為判斷標準，結果高于1.0%和/或4.0%判定為異常。

β-地貧組中，采用醋纖法定量HbA2時，分別將3.5%和ROC曲線分析所得的最佳截斷值2.85%作為判斷標準，對應的約登系數(shù)分別為0.833、0.885；采用最佳截斷值2.85%對應的陽性預測值、陰性預測值均高于采用3.5%時的對應值，且陰性似然比明顯降低。見表2。采用HPLC法定量HbA2時，分別將4.0%和ROC曲線分析的最佳截斷值3.75%作為判斷標準，對應約登系數(shù)由0.936提高到0.961，陰性預測值由0.968提高到0.984。見表2。

2.4 HbF、HbA2截斷值確立對篩查方案效率的影響

圖1 β-地貧組中兩種定量HbF方法的ROC曲線分析

圖2 β-地貧組中兩種定量HbA2方法的ROC曲線分析

采用ROC曲線分析得到的截斷值HbF（≥1.05%）、HbA2（≥3.75%）組成的聯(lián)合篩查方案的符合率、靈敏度、特異度均高于選擇推薦截斷值HbF（≥1.0%）、HbA2（≥4.0%或≥3.5%或≥3.0%）組成的聯(lián)合篩查方案，其基因診斷符合率、靈敏度、特異度可分別達到99.2%、99.0%和100.0%。見表3。

表1 兩種定量檢測方法對應指標的AUC、最佳截斷值及其靈敏度、特異度

3 討論

地中海貧血在我國發(fā)病率較高，攜帶者數(shù)目巨大，且目前尚無有效根治辦法，因此開展地貧篩查并完善篩查方案意義重大。由于地貧經(jīng)常與多樣化的血紅蛋白變體共存，這些數(shù)目異常和/或結構異常的血紅蛋白組分間的相互作用導致地貧有更加多樣的表型，大大增加了其診斷的復雜性。有研究表明，通過對紅細胞參數(shù)，如Hb、MCV、MCH、MCHC等的異常篩查地貧患者是可行的，但其準確性、靈敏度仍較低，容易誤診或漏診[5-7]。DNA分析是診斷地貧的金標準，但是基因檢測目前尚不能覆蓋全部α-或β-珠蛋白基因，患者存在異常血紅蛋白變異、非常見突變的珠蛋白基因和未知突變等情況時則需通過DNA測序來確定；且基因檢測成本高，不適用于大規(guī)模篩查。HbF、HbA2是地貧篩查的重要參考指標，經(jīng)典的定量HbF、HbA2的方法有Singer一分鐘堿變性實驗和醋纖法。近年來基于離子交換原理的HPLC法已被證實在篩查地貧，尤其是β-地貧時具有重要價值[3,8-10]。然而目前應用HPLC定量HbF、HbA2進行地貧篩查尚沒有明確的參考截斷值，因此實驗室確定HPLC定量檢測HbF、HbA2的最佳臨界值是提高地貧篩查效率、完善篩查方案的關鍵。

表2 兩種方法定量HbA2在β-地貧篩查時的推薦截斷值、最佳截斷值處的評價

表3 HbF、HbA2截斷值確立對篩查方案效率的影響 （%）

本研究采用ROC曲線分析評估不同方法定量HbF、HbA2在地貧篩查中的價值，比較兩種定量方法對地貧篩查的價值，并確定相應指標的截斷值供臨床實驗室參考。ROC曲線分析不僅反映了不同指標的靈敏度、特異度的關系，還比較了不同實驗方法對某一指標的靈敏度、特異度[11-14]。ROC分析結果顯示，首先，HPLC法定量HbF、HbA2在最佳臨界值處的靈敏度、特異度均高于經(jīng)典法的對應值，說明HPLC法定量HbF、HbA2進行地貧篩查的效果優(yōu)于經(jīng)典方法。其次，兩種定量檢測HbF的方法對β-地貧組的診斷效果和準確性均高于α-地貧組。HPLC法與醋纖法定量HbA2對β-地貧的篩查有較高的準確性；HPLC定量HbA2對β-地貧篩查的準確性較好，與基因診斷結果的符合率最高。第三，本研究重點比較了推薦截斷值和ROC分析最佳截斷值對篩查方案效率的影響，結果顯示采用ROC分析得到的HPLC 法定量HbF（≥1.05%）、HbA2（≥3.75%）的切值可以有效地提高地貧聯(lián)合篩查方案的靈敏度和與金標準的符合率。需要說明的是，由于儀器的測定范圍，如果HbF%在0.8%～16.5%范圍外或檢測的HbA2%在1.5%～11.4%范圍外，測定結果還需結合峰圖綜合分析。

綜上所述，應用對檢測過程的室內質控還可以保證結果的準確性和可靠性。本研究提示，在進行β-地貧篩查時，采用HPLC定量的截斷值HbF（≥1.05）、HbA2（≥3.75）與紅細胞參數(shù)MCV（＜80 fl）、MCH（＜27 pg）組成的聯(lián)合篩查方案，可以有效地提高地貧篩查的效率，為臨床上進行地中海貧血的大規(guī)模篩查提供了參考。

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Clinical signi fi cance of receiver operating characteristic curve analysis in the screening of thalassemia

IA Chaoran,

HUANG Ying, REN Zhaorui
（Shanghai Institute of Medical Genetics; Shanghai Children’s Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine; Key Lab of Medical Embryo Molecular Biology; Ministry of Health, and Shanghai Lab of Embryo and Reproduction Engineering, Shanghai 200040, China）

ObjectiveThe aim of this study was to evaluate the application of receiver operating characteristic (ROC) curve of biochemical indexes of blood for HbF and HbA2on the screening and diagnosis of thalassemia in children.MethodsThe traditional methods (cellulose acetate membrane electrophoresis and single one minute alkaline denaturation) as well as HPLC were used to quantitatively detecting HbF and HbA2in 200 thalassemic cases and 62 normal controls. With DNA analysis as a golden standard for thalassemia diagnosis, ROC was applied to evaluate the indicators of HbF and HbA2including areas under the curve (AUC), sensitivity and speci fi city after different cut-off values chosen.ResultsIn α- and β-thalassemia groups, all of AUC of HbF and HbA2quanti fi ed by HPLC were higher than that detected by the classical method. In the β-thalassemia group, the AUC of HbA2quanti fi ed by HPLC showed the greatest value (0.991). The coincidence rate, sensitivity and speci fi city of the combined screening scheme of the cut-off value HbF (≥1.05%) and HbA2(≥3.75%) analyzed by ROC were 99.2%, 99.0%, and 100%, respectively.ConclusionsIt is suggested that the combined screening scheme, the cut-off value of HbF (≥1.05) and HbA2(≥3.75) measured by HPLC, together with the related hematological indexes, may be applied to the large-scale screening of β-thalassemia. This scheme can improve the sensitivity, coincidence rate and screening ef fi ciency. The internal quality control for the detective process ensured the accuracy and reliability of the results, and reduced the misdiagnosis rates.

thalassemia; receiver operating characteristic curve; screening indicator; hemoglobin

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.05.005

2016-10-24)

(本文編輯：蔡虹蔚)

國家科技支撐計劃資助項目（No.2012BAI09B04）

任兆瑞 電子信箱：zhrren1225@163.com