秘魯番茄高效再生體系的研究

薛其勤

摘要：以秘魯番茄的葉片和莖段為外植體，研究不同外植體種類、激素配比對(duì)秘魯番茄愈傷組織誘導(dǎo)、分化和不定芽生根的影響，以期建立秘魯番茄組織培養(yǎng)高效再生體系。結(jié)果表明：秘魯番茄的葉片較莖段更適宜愈傷組織誘導(dǎo)與分化，以葉片為外植體時(shí)，最佳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)1000%；愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA，不定芽的分化率高達(dá)92.4%。以莖段為外植體時(shí)，最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L IAA，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)95.8%；愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA，不定芽的分化率高達(dá)86.5%。不定芽最適宜的生根培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA，生根率達(dá)100.0%。采用草炭土+珍珠巖（體積比1 ∶1）的混合基質(zhì)作為移栽基質(zhì)，移栽成活率可達(dá)90%以上。

關(guān)鍵詞：秘魯番茄；愈傷組織；植株再生；馴化

中圖分類號(hào)：S641.204+.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2017）07-0037-03

番茄（Lycopersion esculentum Mill.）是一種重要的蔬菜作物，其營(yíng)養(yǎng)豐富，在我國(guó)蔬菜周年供應(yīng)中占有非常重要的位置。隨著育種技術(shù)的不斷發(fā)展，番茄品種不斷豐富，番茄產(chǎn)量不斷提高，但隨著設(shè)施番茄種植面積的不斷增加，番茄病害的發(fā)生也逐步加重，特別是番茄病毒病經(jīng)常呈暴發(fā)趨勢(shì)[1-3]，對(duì)番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重危害，并且病害發(fā)生時(shí)往往以復(fù)合侵染的形式危害?，F(xiàn)有番茄品種的抗性已不能滿足現(xiàn)實(shí)的生產(chǎn)需求。同時(shí)，番茄屬于嚴(yán)格的自花授粉作物[4]，經(jīng)過(guò)人類長(zhǎng)期的馴化和選育，其栽培種的遺傳背景已經(jīng)變得越來(lái)越狹窄，僅依靠現(xiàn)有栽培種已很難滿足育種要求。

與栽培番茄資源匱乏相反，番茄屬野生種番茄及番茄近緣野生種類番茄（Solanum lycopersicoides）中卻擁有豐富的優(yōu)良遺傳性狀[5]，能抗多種病蟲(chóng)害，有較高的抗旱性、耐鹽性和可溶性固形物含量等。秘魯番茄（L. peruvianum）是栽培番茄的一種近緣野生種，對(duì)番茄的多種病害均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性或免疫性[6]，在改良番茄抗性方面具有重要的利用價(jià)值，但秘魯番茄與栽培番茄的有性不親和障礙問(wèn)題迄今尚未得到很好解決[7]。通過(guò)原生質(zhì)體融合等遠(yuǎn)緣體細(xì)胞雜交技術(shù)，可以將野生番茄屬植物或者近緣種的遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)入到番茄栽培種中，創(chuàng)造出具有多抗、高品質(zhì)的優(yōu)良性狀種質(zhì)資源，而建立秘魯番茄高效再生體系是利用體細(xì)胞雜交的基礎(chǔ)。本試驗(yàn)以秘魯番茄的葉片和莖段作為外植體，通過(guò)添加不同濃度和配比的激素，建立其高效再生體系，為充分利用秘魯番茄的優(yōu)異性狀奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

秘魯番茄植株由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)李景富教授番茄育種課題組提供。田間取秘魯番茄的腋芽，進(jìn)行表面消毒處理后接種于MS基本培養(yǎng)基獲得無(wú)菌苗。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1外植體的消毒處理田間取剛吐出的秘魯番茄腋芽，先用洗潔精清洗腋芽，除去表面塵土，自來(lái)水沖洗20～30 min，用濾紙吸干水分。移入超凈工作臺(tái)后，先用75%乙醇浸泡15 s，再用0.1% HgCl2浸泡8 min，無(wú)菌水沖洗5～6次，無(wú)菌濾紙吸干水分，接種于MS基本培養(yǎng)基。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)將獲得的秘魯番茄無(wú)菌苗的葉片切成1 cm×1 cm的小塊，將其莖段切成1.0～1.5 cm左右的小段，將這2種外植體分別接種到添加不同濃度ZT（1.0、2.0、3.0 mg/L）和IAA（0.05、0.1、0.2、0.3 mg/L）的培養(yǎng)基上進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。

1.2.3愈傷組織的分化將誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到添加不同濃度ZT（1.0、2.0、3.0 mg/L）和IAA（0.05、0.1、0.2、0.3 mg/L）的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)不定芽的產(chǎn)生。

1.2.4激素對(duì)秘魯番茄生根培養(yǎng)的影響將高1～2 cm的不定芽分切下來(lái)，分別轉(zhuǎn)入附加不同濃度IAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5 mg/L）的MS生根壯苗培養(yǎng)基中，以MS基本培養(yǎng)基為對(duì)照，20 d后觀察統(tǒng)計(jì)生根率。

1.2.5幼苗移栽將高5 cm以上、根系發(fā)達(dá)的健壯幼苗煉苗移栽，每天逐漸打開(kāi)瓶蓋，3 d后完全打開(kāi)瓶蓋，置于通風(fēng)明亮的常溫房間里保持3 d，每天早、中、晚各噴水1次，洗凈附著在根系的培養(yǎng)基，移植在草炭土+珍珠巖（體積比1 ∶1）栽培基質(zhì)上，淋水、罩上透明塑料薄膜保持濕度，7 d后打開(kāi)保濕罩，20 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

2結(jié)果與分析

2.1秘魯番茄愈傷組織的誘導(dǎo)

將葉片和莖段2種外植體接種于表1所列的培養(yǎng)基上，接種5 d左右，葉片傷口邊緣陸續(xù)膨大，葉片出現(xiàn)卷曲，莖段兩端迅速膨大，逐漸形成愈傷組織（圖1-A）。由表1可見(jiàn)，不同的激素濃度和配比對(duì)秘魯番茄愈傷組織誘導(dǎo)具有較大影響，以葉片作為外植體，當(dāng)ZT濃度一定時(shí)，隨著IAA濃度的逐漸提高，愈傷組織誘導(dǎo)率基本呈現(xiàn)先提高后降低的趨勢(shì)；當(dāng)IAA濃度一定時(shí)，隨著ZT濃度的增加，愈傷組織誘導(dǎo)率總體也呈先提高后降低的趨勢(shì)，但以葉片和莖段作外植體的誘導(dǎo)愈傷率有一定差異，以葉片為外植體時(shí)，平均愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)75.09%，最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100.0%，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，顏色濃綠，而以莖段為外植體時(shí)，平均愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)69.12%，最佳誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.1 mg/L IAA，愈傷組織誘導(dǎo)率達(dá)95.8%，可見(jiàn)秘魯番茄以葉片作為外植體更易誘導(dǎo)愈傷組織。

2.2秘魯番茄愈傷組織分化

將生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織轉(zhuǎn)移至相同的培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)，8 d左右愈傷組織上開(kāi)始出現(xiàn)綠色芽點(diǎn)（圖1-B、1-C），接種4周后統(tǒng)計(jì)愈傷組織分化率。試驗(yàn)結(jié)果表明，不同濃度配比的ZT、IAA對(duì)愈傷組織的分化率具有較大影響，采用葉片和莖段作為外植體的愈傷組織分化率也有一定差異。愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA，以葉片為外植體時(shí)，不定芽的分化率高達(dá)92.4%，平均分化率為70.97%；以莖段為外植體時(shí)，不定芽分化率最高達(dá)86.5%，平均分化率為64.52%（表2）。

2.3激素對(duì)秘魯番茄生根培養(yǎng)的影響

將高2 cm的不定芽分切下來(lái)，分別轉(zhuǎn)入附加IAA和NAA的MS生根壯苗培養(yǎng)基中。秘魯番茄不定芽生根相對(duì)較容易，在不添加激素的MS培養(yǎng)基上生根率達(dá)56.7%，但添加IAA或者NAA對(duì)生根率具有明顯的影響，特別是添加NAA后，生根率明顯提高，根系數(shù)量多且粗壯，最佳生根培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L NAA，生根率達(dá)100.0%，平均生根數(shù)達(dá)12.9條（表3），根系粗壯，葉色濃綠，植株健壯，適宜移栽馴化（圖1-D、1-E）。

2.4試管苗的馴化移栽

選取植株健壯、根系發(fā)達(dá)的秘魯番茄試管苗進(jìn)行煉苗馴化，煉苗后移栽到草炭土 ∶珍珠巖體積比=1 ∶1的花盆中，移栽前應(yīng)對(duì)基質(zhì)進(jìn)行消毒。移栽后注意保濕遮陰，開(kāi)始時(shí)可罩上1層塑料薄膜，1周后除去薄膜。通過(guò)以上措施，秘魯番茄試管苗的移栽成活率可達(dá)90%以上（圖1-F）。

3結(jié)論與討論

普通栽培番茄組織培養(yǎng)中的外植體一般采用子葉、下胚軸、葉片、葉柄等，尤其以子葉作為外植體的居多[8-9]。本試驗(yàn)過(guò)程中沒(méi)有秘魯番茄種子材料，只能取植株上的葉片和莖段作為外植體。試驗(yàn)結(jié)果表明，采用秘魯番茄的葉片和莖段作為外植體均能建立其高效再生體系，但以葉片作為外植體更適合愈傷誘導(dǎo)和不定芽的分化。激素在植物組織培養(yǎng)再生體系中占有重要作用，一般采用細(xì)胞生長(zhǎng)素和分裂素結(jié)合的方式誘導(dǎo)植株再生[10-11]。本試驗(yàn)表明，以ZT和IAA的激素組合對(duì)建立秘魯番茄再生體系具有較好的作用，以葉片作為外植體時(shí)，最佳的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA，愈傷組織誘導(dǎo)率高達(dá)100.0%，愈傷組織結(jié)構(gòu)緊密，顏色濃綠；愈傷組織分化的最佳培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.2 mg/L IAA，不定芽的分化率高達(dá)92.4%，平均分化率為70.97%。

番茄不定芽一般生根較容易[12]，在不添加激素的MS培養(yǎng)基上也能生根，但所生的根系細(xì)長(zhǎng)，生根數(shù)量也較少，移栽不易成活。本試驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，在MS基本培養(yǎng)基上，秘魯番茄的生根率低，根系數(shù)量少，平均僅為3.8條。番茄組織培養(yǎng)中，最常用的誘導(dǎo)生根激素為NAA和IAA。于明禮等發(fā)現(xiàn)，在添加IAA的培養(yǎng)基上，栽培番茄不定芽誘導(dǎo)生根的效果最好[10]；裴華麗等發(fā)現(xiàn)，在添加NAA的MS培養(yǎng)基上，3個(gè)栽培番茄品種均達(dá)到了最佳生根效果[9]。本試驗(yàn)比較了不同濃度的NAA和IAA對(duì)秘魯番茄不定芽誘導(dǎo)生根的影響，發(fā)現(xiàn)添加NAA后的秘魯番茄的生根效果要好于添加IAA后的生根效果。本研究所建立的秘魯番茄再生體系為番茄體細(xì)胞雜交創(chuàng)新種質(zhì)資源提供了一定的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

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