蝎源活性肽對早期帕金森病大鼠腦源性營養(yǎng)因子及神經(jīng)肽Y的影響*

于德欽， 陳 薇， 殷盛明△， 安 冬， 趙 丹， 孟 旭， 徐 紅， 王冬梅， 孫藝平,， 趙 杰, 張萬琴

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 2. 大連醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗室， 遼寧 大連 116044)

蝎源活性肽對早期帕金森病大鼠腦源性營養(yǎng)因子及神經(jīng)肽Y的影響*

于德欽1， 陳 薇1， 殷盛明1△， 安 冬1， 趙 丹1， 孟 旭1， 徐 紅2， 王冬梅， 孫藝平1,2， 趙 杰1, 張萬琴1

(1. 大連醫(yī)科大學(xué)生理學(xué)教研室， 2. 大連醫(yī)科大學(xué)機(jī)能實(shí)驗室， 遼寧 大連 116044)

目的：研究蝎源活性肽對早期帕金森病(PD)大鼠腦源性營養(yǎng)因子(BDNF)及神經(jīng)肽Y(NPY)的影響。方法：實(shí)驗動物隨機(jī)分為三組(n= 11)，分為早期PD模型組、假手術(shù)對照組和蝎源活性肽治療組。將6羥多巴(6-OHDA, 20 μg/3 μl含0.1%抗壞血酸生理鹽水)注射到SD大鼠右側(cè)紋狀體制備早期PD模型，注射2周后，通過旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測造模是否成功；造模成功的早期PD大鼠，和相應(yīng)的對照組腹腔注射蝎源活性肽(2.20 mg/kg·d)處理1周。3周后，用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腦源性營養(yǎng)因子及神經(jīng)肽Y的免疫反應(yīng)活性。結(jié)果：在6-OHDA給藥側(cè)，PD動物與假手術(shù)對照組相比較，BDNF免疫反應(yīng)活性明顯增強(qiáng)，NPY免疫反應(yīng)活性明顯減少，蝎源活性肽處理可以逆轉(zhuǎn)這些異常改變。結(jié)論：改變PD早期中腦內(nèi)NPY與BDNF的免疫反應(yīng)活性是蝎源活性肽對早期PD大鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)作用機(jī)制之一。

帕金森??；腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子；神經(jīng)肽Y；蝎源活性肽；大鼠

Patkinson’s disease； brain-drived neurotrophic factor； neuropeptide Y； rat

【DOI】 10.12407/j.cjap.5387.2017.007

帕金森病(Parkinson＇s disease, PD)是慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，常見于中老年人。神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病是是指由于神經(jīng)元變性所導(dǎo)致的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，其影響運(yùn)動功能和廣泛的認(rèn)知領(lǐng)域包括執(zhí)行功能[1]，目前尚無有效的治療手段。PD的發(fā)病主要是因為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)進(jìn)行性變性，進(jìn)而導(dǎo)致紋狀體內(nèi)多巴胺水平顯著降低[2]。PD起病緩慢，有報道PD的早期發(fā)病可能長達(dá)10年之久[3]。早期PD的發(fā)病原因尚不清楚,與年齡和環(huán)境等其它因素有關(guān)，其發(fā)病機(jī)制與自由基、炎癥、神經(jīng)營養(yǎng)因子缺乏和凋亡等相關(guān)，這些因素相互作用最終引起神經(jīng)元死亡[4]。蝎源活性肽具有抗氧化活性并減輕PD動物線粒體損傷，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。

腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)在大腦內(nèi)分布廣泛，對多巴胺能神經(jīng)元具有營養(yǎng)和保護(hù)作用。神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)即神經(jīng)肽酪氨酸，由36個氨基酸構(gòu)成，是一種活性多肽，屬于胰多肽家族，在腦內(nèi)和胃腸道含量豐富。NPY在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛的表達(dá)，在重要的生理功能和病理條件如癲癇、慢性疼痛、焦慮和神經(jīng)退行性疾病中起著重要的作用[5]?，F(xiàn)已知的NPY受體亞型為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，共5種，都為G蛋白偶聯(lián)受體。 研究顯示，神經(jīng)肽通過作用于Y1、Y2受體，可參與情緒的調(diào)節(jié)，如抑郁大鼠模型腦組織YI受體顯著減少，Y2受體顯著增加[6]。

神經(jīng)毒素6-羥多巴胺(6 hydroxydopamine,6-OHDA)結(jié)構(gòu)類似于多巴胺,注射6-OHDA于大鼠紋狀體內(nèi)，會使黑質(zhì)發(fā)生退行性變，作用于多巴胺能神經(jīng)元，常用于PD模型的制備[7,8]。本課題組前期工作已發(fā)現(xiàn)蝎源活性肽對MPTP處理小鼠及6-OHDA處理的大鼠PD模型動物的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷具有保護(hù)作用[9,10]。本實(shí)驗制備早期6-OHDA大鼠PD模型，觀察PD模型的中腦內(nèi)BDNF及NPY的表達(dá)情況，進(jìn)一步觀察蝎源活性肽的神經(jīng)保護(hù)作用。為早期PD的發(fā)病機(jī)制及診治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 PD動物模型制備與分組

(1)實(shí)驗分組及處理：蝎源活性肽(提取于東亞鉗蝎，以提取物的蛋白測定量為注射劑量依據(jù)，本課題組專利，ZL01161169)；實(shí)驗動物隨機(jī)分為三組(n= 11)，分為早期PD模型組、假手術(shù)對照組和蝎源活性肽治療組。將6羥多巴(6-OHDA, 20 μg/3 μl含0.1%抗壞血酸生理鹽水)注射到大鼠右側(cè)紋狀體制備早期PD模型，注射2周后，通過旋轉(zhuǎn)行為學(xué)檢測造模是否成功；造模成功的早期PD大鼠腹腔注射蝎源活性肽(2.20 mg/kg·d)處理1周。3周后，用免疫組織化學(xué)法檢測大鼠腦源性營養(yǎng)因子及神經(jīng)肽Y的免疫反應(yīng)活性。所用實(shí)驗動物為雄性健康SD大鼠(大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗中心，許可證號為SCXX Ⅱ2008002)，體重為170～230 g。

(2)麻醉(4%水合氯醛，ip)、固定(腦立體定位儀)、選取靶點(diǎn)(根據(jù)George Paxinos&Charles Watson大鼠腦定位圖譜)。早期 PD組的注射靶點(diǎn)為紋狀體，坐標(biāo)定位為AP=+1.0(前囟前)， R=3.0 mm(向右旁開)，H =-4.5 mm(硬膜下)。早期PD模型組和蝎源活性肽治療組的動物腦內(nèi)注射溶解于Vehicle(0.1%抗壞血酸，0.9% NaCl)的6-OHDA，注射劑量為20 μg/3 μl。緩慢注射，留針3 min后，慢慢退出。在相同條件下假手術(shù)對照組動物，將同等容積的Vehicle注入靶點(diǎn)。蝎源活性肽單獨(dú)對照組和治療組在完成行為學(xué)測試后給予2.20 mg/kg·d的蝎源活性肽腹腔注射1周，其余兩組則給予NS。

1.2 動物行為學(xué)檢測

術(shù)后2周，于SD大鼠頸背部注射阿樸嗎啡(0.5 mg/kg，ih)，溶于0.4 ml NS中，誘發(fā)其旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(30 min)，記錄旋轉(zhuǎn)次數(shù)，每分鐘7轉(zhuǎn)以下的左旋鼠是成功的早期PD大鼠模型。檢測過程中環(huán)境安靜，切勿嘈雜喧鬧。

邁步實(shí)驗：(1)適應(yīng)環(huán)境：大鼠適應(yīng)實(shí)驗環(huán)境3 d，將1.1 m長木板傾斜30°放置與鼠籠相連，訓(xùn)練大鼠爬回籠中。(2)開始實(shí)驗：將大鼠雙后肢固定并緩慢輕輕上提，使其離開木板，隨后將一側(cè)前肢固定，另一側(cè)前肢不離開木板，觀察待其前肢自動移動時，開始計時。(3)記錄時間：記錄大鼠從邁步開始到返回鼠籠所用總時間與大鼠走過整個桌面斜面的總步數(shù)。整個實(shí)驗的測驗順序：左→右，并且重復(fù)2次。

1.3 免疫組織化學(xué)反應(yīng)

實(shí)驗第3周，進(jìn)行腦組織灌流固定，之后蔗糖脫水，冰凍切片后，選取中腦黑質(zhì)腦片，采用漂浮法法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。用PBS漂洗3次后用含1%過氧化氫的PBS處理以消除內(nèi)源性過氧化物酶。山羊血清封閉2 h。分別加入BDNF(Sigma，1∶500)和NPY(Sigma，1∶500)抗體。4℃孵育過夜。用生物素化二抗進(jìn)行室溫孵育2 h，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液進(jìn)行室溫孵育1 h，充分漂洗后，用新鮮配制的顯色劑(DAB)進(jìn)行顯色，適時終止反應(yīng)。將腦片晾干后，再用二甲苯透明，使用中性樹脂封片。對照組使用PBS代替一抗。實(shí)驗中加以陰性對照組(不加入一抗)以確認(rèn)BDNF和NPY免疫反應(yīng)陽性的結(jié)果。

1.4 免疫染色陽性細(xì)胞的計數(shù)

定量分析BDNF-IR和NPY-IR的陽性細(xì)胞數(shù)，采用病理圖文分析系統(tǒng)。各組選取大鼠6只。根據(jù)George Paxinos &Charles Watson的The RateBrain選取定位，首先在低倍物鏡下觀察，定位黑質(zhì)致密部(SNR)，測量面積是20 000 μm2(100 μm×200 μm)，選取四個部位計數(shù)并取其平均值。計算框內(nèi)BDNF-IR和NPY-IR陽性細(xì)胞的個數(shù)，而后隨機(jī)選6個BDNF-IR和NPY-IR陽性細(xì)胞，將其胞漿的平均灰度測出。

1.5 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

邁步實(shí)驗中，與對照組相比，早期PD大鼠回到鼠籠時間與總步數(shù)無明顯差異(表1)。

GroupTime(S)1std2ndd3rddStep1std2ndd3rddControl5.00±0.564.83±0.563.42±0.349.00±0.9010.00±0.759.00±0.67PD5.14±0.645.00±0.464.07±0.979.00±0.529.00±0.368.00±0.73

PD: Parkinson’s disease

2.2 BDNF和NPY免疫組化結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示，與對照組相比，6-OHDA處理的早期PD大鼠黑質(zhì)BDNF免疫反應(yīng)陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)量和平均光密明顯度增多，而黑質(zhì)致密部NPY免疫反應(yīng)陽性表達(dá)細(xì)胞平均光密度明顯減少；而蝎源活性肽一定程度上逆轉(zhuǎn)了異常的BDNF和NPY免疫反應(yīng)陽性表達(dá)細(xì)胞的免疫反應(yīng)活性(圖1，表2，圖1見彩圖頁Ⅱ)。單獨(dú)蝎源活性肽對照組與假手術(shù)對照組相比，無明顯差異，所以結(jié)果中未展示。

GroupBDNFNPYControl8.34±0.525.50±1.10PD14.00±0.894.00±0.05Scorpionvenom5.33±0.055.50±0.29

PD: Parkinson’s disease; BDNF: Brain-derived neurotrophic factor; NPY: Neuropeptide Y

3 討論

PD是慢性神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，常見于中老年人。發(fā)病主要是因為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元出現(xiàn)進(jìn)行性變性。蝎源活性肽具有抗氧化活性并減輕PD動物線粒體損傷，進(jìn)而保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元[11]。

BDNF在大腦內(nèi)分布廣泛，對多巴胺能神經(jīng)元具有營養(yǎng)和保護(hù)作用。當(dāng)多巴胺能神經(jīng)元受到損傷時，可能引起其代償性的表達(dá)增多，進(jìn)而試圖以此來保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元避免或加重其損傷。蝎源活性肽通過早期保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元后，降低了BDNF的這種代償性的表達(dá)增多。NPY即神經(jīng)肽酪氨酸，由36個氨基酸構(gòu)成，是一種活性多肽，屬于胰多肽家族，在腦內(nèi)和胃腸道含量豐富。近年研究顯示，采用PD藥物治療的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制與BDNF密切相關(guān)。Baquet ZC 等[12]發(fā)現(xiàn)，BDNF對于中腦多巴胺能神經(jīng)元的生存和分化有促進(jìn)作用。BDNF能改善6-OHDA造成的PD大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目減少及超微結(jié)構(gòu)影響[13]。BDNF基因工程方法制備的PD大鼠模型，PD大鼠紋狀體內(nèi)DA代謝率顯著降低，DA水平有所提高，改善了PD大鼠的主動活動性[14]。NPY在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有廣泛的表達(dá)，在重要的生理功能和病理條件如癲癇、慢性疼痛、焦慮和神經(jīng)退行性疾病中起著重要的作用[15]。

臨床上多采用影像學(xué)檢測和回顧性PD患者尸檢等方法[16]研究PD臨床期。動物模型更適用于PD早期研究[13]。將6-OHDA注入腦內(nèi)，改變注藥部位和注藥量的不同，可以模擬PD患者的病理改變，已被廣泛用于PD研究[11]?；谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)，本研究觀察早期PD模型的中腦內(nèi)BDNF及NPY的表達(dá)情況，進(jìn)一步觀察蝎源活性肽的神經(jīng)保護(hù)作用。這為早期PD的發(fā)病機(jī)制及診治提供理論依據(jù)。

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