低氧環(huán)境對(duì)高原鼢鼠不同組織VEGF165b基因表達(dá)量及微血管密度的影響*

趙偉民， 賈桂花， 周婷婷， 拉毛吉

(1． 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院， 西寧 810016； 2． 天?？h賽什斯教育輔導(dǎo)站， 甘肅武威 733209)

低氧環(huán)境對(duì)高原鼢鼠不同組織VEGF165b基因表達(dá)量及微血管密度的影響*

趙偉民1△， 賈桂花2， 周婷婷1， 拉毛吉1

(1． 青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院， 西寧 810016； 2． 天?？h賽什斯教育輔導(dǎo)站， 甘肅武威 733209)

目的：探討高原低氧環(huán)境下高原鼢鼠不同組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165b(VEGF165b)表達(dá)量及微血管密度(MVD)的變化。方法：克隆高原鼢鼠VEGF165b基因并測(cè)定其在不同海拔腦、肺和骨骼肌組織內(nèi)的表達(dá)量；免疫組化法觀察腦、肺和骨骼肌組織內(nèi)微血管并測(cè)定其在不同海拔組織內(nèi)的密度。結(jié)果：高海拔VEGF165b表達(dá)量顯著低于低海拔表達(dá)量(P<0.05)；微血管密度隨海拔高度升高而增加(P<0.05)。結(jié)論：VEGF165b基因調(diào)節(jié)動(dòng)物組織微血管密度是高原動(dòng)物適應(yīng)低氧環(huán)境的重要機(jī)制之一。

高原鼢鼠；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165b；微血管密度

myospalaxbaileyi； VEGF165b； MVD

【DOI】 10.12047/j.cjap.5368.2017.017

高原鼢鼠(myospalaxbaileyi)是青藏高原特有的小型嚙齒動(dòng)物，終生生活在封閉的地下洞道環(huán)境中，長(zhǎng)期低氧環(huán)境促使高原鼢鼠在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理指標(biāo)及基因表達(dá)調(diào)控等方面形成了有利于其生存的一系列適應(yīng)性機(jī)制。

微血管是血液與組織間進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所，微血管密度(microvessel density，MVD)增加是機(jī)體適應(yīng)低氧環(huán)境的重要機(jī)制之一。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是動(dòng)物組織調(diào)節(jié)血管生長(zhǎng)的重要因子之一，其mRNA前體內(nèi)源性剪切6～8外顯子后產(chǎn)生多個(gè)亞型；其中VEGF165是體內(nèi)最多、活性最強(qiáng)的亞型。VEGF165在體內(nèi)剪切外顯子8后形成促進(jìn)微血管生成的VEGF165a和抑制微血管生成的VEGF165b[1,2]。目前，有關(guān)VEGF165b的研究報(bào)道主要集中在其與腫瘤的關(guān)系上，低氧如何通過調(diào)節(jié)VEGF165b基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)MVD使高原土著動(dòng)物適應(yīng)低氧環(huán)境尚未有研究報(bào)道。因此克隆高原鼢鼠VEGF165b基因序列并研究不同低氧環(huán)境條件下該基因mRNA的表達(dá)量以及其與MVD之間的關(guān)系，將有助于進(jìn)一步闡明高原鼢鼠對(duì)低氧環(huán)境的適應(yīng)機(jī)制，也有助于揭示高原土著動(dòng)物的低氧適應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

高原鼢鼠來自于青海省門源縣(海拔約3 200 m)和貴德縣拉雞山頂(海拔約4 000 m)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 VEGF165b基因mRNA在腦、肺和骨骼肌組織中表達(dá)量的測(cè)定 按照RNA提取試劑盒(TaKaRa)說明，分別提取生活于不同海拔環(huán)境條件下的高原鼢鼠腦、肺和骨骼肌組織內(nèi)總RNA，并采用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa)制備cDNA用于基因克隆和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。

從NCBI上下載家鼠和人VEGF165b基因的編碼序列，利用DNAMAN 軟件進(jìn)行對(duì)比分析后用 primer premier 5.0軟件設(shè)計(jì)克隆高原鼢鼠VEGF165b基因片段的特異性引物。使用EX TaqTM(TaKaRa)制備的肺組織cDNA及合成的引物(TaKaRa)克隆高原鼢鼠VEGF165b目的基因片段，PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃ 5 min，(95℃ 30 s、57.2℃ 30 s、72℃ 30 s)，35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。克隆產(chǎn)物經(jīng)電泳回收、轉(zhuǎn)化后測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast對(duì)比后，用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析。高原鼢鼠VEGF165b基因克隆引物(表1)。

利用測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)VEGF165b基因熒光定量引物，同時(shí)用 primer premier 5.0設(shè)計(jì)內(nèi)參基因β-actin的引物。使用SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(TaKaRa)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，PCR擴(kuò)增程序：95℃ 30 s、(95℃ 5 s、60℃ 30 s)40個(gè)循環(huán)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR后用目的基因的濃度對(duì)數(shù)除以內(nèi)參基因的濃度對(duì)數(shù)，換算出VEGF165b基因在不同海拔條件下三種組織內(nèi)的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物(表1)。

Tab. 1 Names and sequences of primers

CP： Cloning primer； FQP： Fluorescent quantitative primer; VEGF: Vascular endothelial growth factor

1.2.2 免疫組化法檢測(cè)MVD 三種組織用4%多聚甲醛室溫固定24 h后制成常規(guī)石蠟切片，切片厚度4 μm。切片常規(guī)脫蠟水化、除去內(nèi)源性過氧化氫酶、微波修復(fù)抗原、5% BSA封閉液室溫封閉20 min后，滴加CD34兔抗大鼠多克隆抗體(1∶100稀釋)4℃過夜；第2天切片恢復(fù)室溫后，滴加生物素化山羊抗兔 IgG(1∶40稀釋)室溫孵育20 min，滴加 SABC室溫孵育20 min，DAB 顯色后用蘇木精復(fù)染；再用1% 鹽酸酒精分化，梯度酒精脫水，吹干后中性樹膠封片并觀察。檢測(cè)時(shí)CD34標(biāo)記的棕黃色顯示為微血管內(nèi)皮細(xì)胞，蘇木精染色的藍(lán)色顯示為細(xì)胞核。

MVD的測(cè)定參照Weidner的方法進(jìn)行[3]：每張切片在200倍光鏡下選擇3個(gè)熱點(diǎn)區(qū)視野計(jì)數(shù)微血管，計(jì)數(shù)后取平均值作為MVD。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 VEGF165b基因在不同海拔高原鼢鼠腦、肺和骨骼肌組織中的表達(dá)水平

2.1.1 目標(biāo)片段克隆及測(cè)序結(jié)果 VEGF165b基因擴(kuò)增片段在150 bp 附近有條帶，與設(shè)計(jì)片段長(zhǎng)度相符(圖1)。克隆所得產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果：GGCTAGAAAATCACTGTGAGCCTTGCTCAGA GCGGAGAAAGCATTTGTTTGTCCAAGATCCGCAGACGTGTAAATG TTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTG AGTTAAACGAACGTACTTGCAGATCTCTCACC。

克隆所得序列與GenBank中小鼠、大鼠和人的VEGF165b基因的同源性達(dá)到98%以上，說明克隆的基因片段是高原鼢鼠VEGF165b基因片段。用DNAMAN軟件進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)543～564堿基位點(diǎn)中高原鼢鼠VEGF165b與VEGF165a有6個(gè)不同堿基，VEGF165b基因543、557、559、560、563及564位堿基分別是A、C、C、T、C、C, VEGF165a基因在這些位點(diǎn)的堿基分別是G、G、G、A、A、G。

Fig. 1 PCR products in lung tissue M: Marker； 1-4 lanes: PCR products

2.1.2 不同海拔高原鼢鼠腦、肺和骨骼肌組織中VEGF165b基因的表達(dá)水平 不同海拔生活的高原鼢鼠VEGF165b基因的相對(duì)表達(dá)量差異顯著，高海拔高原鼢腦和肺組織內(nèi)VEGF165b基因的相對(duì)表達(dá)量顯著低于低海拔高原鼢鼠(P<0.01)，骨骼肌組織內(nèi)相對(duì)表達(dá)量高海拔高原鼢鼠低于低海拔高原鼢鼠(P<0.05)。此外，VEGF165b基因相對(duì)表達(dá)量在不同的組織中表達(dá)有差異性(P<0.05,表2)。

Tab. 2 Relative expression of VEGF165bgene and MVD of different tissues at different altitudes

GroupAltitude(m)RelativeexpressionamountMVD(number/mm2)Brain32001.045±0.053699.51±55.5745000.907±0.027**849.92±111.95*Lung32001.061±0.0683591.79±287.9745000.932±0.033**4491.15±667.47*Skeletalmuscle32001.002±0.1181087.19±45.5345000.938±0.033*#1329.14±60.20*

VEGF: Vascular endothelial growth factor; MVD: Microvessel density

*P<0.05,**P<0.01vs3 200 m groups；##P<0.05vsbrain and lung 4 500 m groups

2.2 不同海拔高原鼢鼠腦、肺和骨骼肌組織MVD

圖2顯示了不同海拔生活高原鼢鼠腦、肺和骨骼肌組織內(nèi)微血管內(nèi)皮細(xì)胞。不同海拔生活的高原鼢鼠三種組織內(nèi)MVD差異顯著，高海拔生活的高原鼢鼠組織內(nèi)MVD高于低海拔生活的高原鼢鼠(P<0.05)，其中骨骼肌組織內(nèi)MVD高海拔顯著高于低海拔(P<0.01，表2)。

Fig. 2 Immunohistochemical staining of different tissues at different altitudes

3 討論

已有研究顯示，高原鼢鼠骨骼肌中MVD顯著高于SD大鼠[4]，地下鼠骨骼肌中MVD比大鼠高2倍，VEGF165amRNA表達(dá)水平比大鼠高1.6倍[5，6]，低氧訓(xùn)練促使SD大鼠肌肉MVD顯著增加[7，8]，低氧促使Wistar大鼠腦組織VEGF表達(dá)量增加[9]；這些研究揭示了MVD影響著動(dòng)物組織攝取氧的能力，同時(shí)也揭示了VEGF165a對(duì)微血管生長(zhǎng)的調(diào)控作用受環(huán)境氧分壓的影響。國(guó)外研究顯示VEGF165b在正常組織中表達(dá)量高于腫瘤組織，并且可以抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)和新生血管生成[10-12]。本研究顯示，高海拔生活的高原鼢鼠腦、肺和骨骼肌組織內(nèi)VEGF165b相對(duì)表達(dá)量顯著低于低海拔同組織內(nèi)的表達(dá)量，高海拔生活的高原鼢鼠腦、肺和骨骼肌組織內(nèi)MVD高于低海拔相同組織，這與腫瘤組織內(nèi)VEGF165b表達(dá)量低于正常組織且微血管密度受VEGF165b抑制相一致，揭示了組織中微血管密度的生長(zhǎng)、VEGF165b的表達(dá)及VEGF165b對(duì)微血管生長(zhǎng)的調(diào)控受環(huán)境氧含量的影響，同時(shí)也揭示了VEGF165b是MVD重要的調(diào)控因子之一。

[1] Bates DO, Cui TG, Doughty JM，etal. VEGF165b，an lnhibitory Splice Variant of Vascular Endothelial Growth Factor,Is Down-Regulated in Renal Cell Carcinoma[J].CancerRes， 2002， 62(14)： 4123-4131．

[2] 關(guān)云艷， 歐希龍. VEGF165和VEGF165b與腫瘤關(guān)系的研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)， 2006， 34(6)： 447-450．

[3] Weidner N， Folkman J， Pozza F，etal. Tumor angiogenesis： a new signifincant independent prognostic indicator in early stage breast carcinoma[J].JNailCancerInst， 1992， 84(9)： 1875-1887．

[4] 朱世海， 齊新章， 王曉君， 等. 高原鼢鼠和高原鼠兔骨骼肌攝氧功能差異[J]. 生理學(xué)報(bào)， 2009， 61(4)： 373-378．

[5] A Avivi， I Shams， A Joel，etal. Increased blood vessel density provides the mole rat physiolo-gical tolerance to its hypoxic subterranean habitat[J].FASEBJ， 2005， 13： 1-16．

[6] A Avivi， MB Resnick， E Nevo，etal. Adaptive hypoxic tolerance in the subterranean mole rat Spalax ehrenbergi: the role of vascular endothelial growth factor [J].FEBSLETT， 1999， 452(3)： 133-140．

[7] 鄭 瀾， 陸愛云， 周志宏. 低氧訓(xùn)練促進(jìn)大鼠心肌組織血管生成的體視學(xué)研究[J]. 體育科學(xué)， 2005， 25(9)： 49-52．

[8] 黃慶愿， 高鈺琪， 史景泉， 等. 低氧習(xí)服大鼠骨骼肌毛細(xì)血管密度和血流供應(yīng)的變化特點(diǎn)[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2001， 17(3)： 220-223．

[9] 田云梅， 杜 寧， 聶鴻靖， 等. 低氧腦水腫大鼠腦組織VEGF和AQPs基因及蛋白表達(dá)的變化[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2011， 27(1)： 7-11．

[10]Cui T G， Foster RR， Bates DO，etal. Differentiated human podocytes endogenously express an inhibitory isoform of vascular endot helial growth factor(VEGF165b)mRNA and protein [J].AmJphysiolRenalPhysiol， 2004， 286(4)： F767-773．

[11]Rennel ES， Hamdollah-Zadeh MA， Bates DO，etal. Recombinant human VEGF165bprotein is an effective anti-cancer agent in mice[J].EurJCancer， 2008， 44(13)： 1883-1894．[12]Rennel E， Waine E， Harper S，etal. The endogenous anti-angiogenic VEGF isoform，VEGF165binhibits human tumour growth in mice [J].BrJCancer， 2008， 97(7)： 1250-1257．

青海大學(xué)中青年科研基金項(xiàng)目(2012-QNT-2)

2015-10-26 【修回日期】2016-09-06

R364.4

A

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