降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)肺纖維化大鼠肺組織eIF3a、p27表達(dá)的影響*

李先偉， 左東澤， 沈媛媛， 郝 偉

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 安徽 蕪湖 241002)

降鈣素基因相關(guān)肽對(duì)肺纖維化大鼠肺組織eIF3a、p27表達(dá)的影響*

李先偉△， 左東澤， 沈媛媛， 郝 偉

(皖南醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室， 安徽 蕪湖 241002)

目的：觀察降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)對(duì)肺纖維化大鼠肺組織真核翻譯起始因子3a(eIF3a)、p27表達(dá)的影響，探討CGRP在肺纖維化中的作用及機(jī)制。方法：雄性SD大鼠，體重180～220 g，隨機(jī)分為3組(n=8)：對(duì)照組、博萊霉素組、博萊霉素+辣椒素組。采用氣管內(nèi)注射博萊霉素(5 mg/kg)誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型。造模前4 d大鼠皮下注射辣椒素(Capsaicin)(50 mg/kg·d)，造模后第28天處死動(dòng)物，頸動(dòng)脈采血ELISA法測(cè)定血漿CGRP含量。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分6組(n=9)：Control組，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)組，CGRP(1、10、100 nmol/L)組，CGRP8-37 1 μmol/L和CGRP 100 nmol/L組。細(xì)胞用CGRP和(或)CGRP8-37預(yù)處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h。5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)法檢測(cè)細(xì)胞增殖。免疫組化、real-time PCR和(或)Western blot檢測(cè)eIF3a、p27、α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、collagen Ⅰ mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：博萊霉素誘發(fā)肺纖維化動(dòng)物肺組織eIF3a、α-SMA及Ⅰ膠原表達(dá)增高，CGRP及p27的表達(dá)明顯降低。外源性CGRP可劑量依賴性的抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞增殖，明顯抑制eIF3a、α-SMA、Ⅰ膠原的表達(dá)，上調(diào)p27的表達(dá)，這些作用可以被CGRP阻斷劑CGRP8-37所取消。結(jié)論：CGRP在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中起著重要作用，可能通過抑制eIF3a、上調(diào)p27的表達(dá)而抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制肺纖維化的形成與發(fā)展。

降鈣素基因相關(guān)肽；肺纖維化；肺成纖維細(xì)胞；eIF3a；p27；大鼠

【DOI】 10.12047/j.cjap.5444.2017.01.004

肺纖維化(pulmonary fibrosis, PF)是由不同

致病因素(如遺傳、環(huán)境或繼發(fā)于其他肺部疾病等)所致的急、慢性肺疾病的共同結(jié)局，其病理特點(diǎn)是肺部彌漫性炎癥所致肺泡持續(xù)性損傷及細(xì)胞外基質(zhì)的反復(fù)破壞、修復(fù)、重建和過度沉積[1]。其發(fā)病機(jī)制至今仍尚未完全闡明。真核翻譯起始因子3a(eIF3a)是真核翻譯起始因子(eukaryotic initiation factor, eIF)中最大的亞基，目前研究發(fā)現(xiàn)eIF3a可通過多種下游通路調(diào)控細(xì)胞周期從而影響細(xì)胞增殖，如eIF3a通過下調(diào)p27、上調(diào)核糖核苷酸還原酶M2(RRM2)及α-微管蛋白的表達(dá)而影響細(xì)胞周期中的G1、S和M期，進(jìn)而調(diào)節(jié)一系列mRNA的翻譯，在細(xì)胞增殖中起著重要作用[2,3]。eIF3a調(diào)控細(xì)胞增殖的研究以往主要集中在腫瘤細(xì)胞，特別是肺癌細(xì)胞。而我們最新的研究發(fā)現(xiàn)eIF3a通過下調(diào)p27的表達(dá)而參與了肺成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控，與肺纖維化的形成有關(guān)[4,5]。

降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)是由37個(gè)氨基酸組成的感覺神經(jīng)肽，包括α和β兩種亞型，廣泛分布于中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)、心血管及肺血管床內(nèi)[6]。研究發(fā)現(xiàn)在二氧化硅和石棉誘導(dǎo)的肺損傷并發(fā)肺纖維化的患者中，肺組織CGRP 的表達(dá)明顯降低[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)CGRP通過上調(diào)p27的表達(dá)而抑制了低氧誘導(dǎo)的肺血管平滑肌細(xì)胞的增殖[8]。另外最新研究還發(fā)現(xiàn)CGRP通過ERK信號(hào)通路抑制eIF3a的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化[9]。CGRP是否通過抑制eIF3a的表達(dá)、上調(diào)p27的表達(dá)而參與肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究以博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化為模型，確證內(nèi)源性CGRP在肺纖維化中的作用，在培養(yǎng)的原代肺成纖維細(xì)胞上，探討CGRP抑制肺成纖維細(xì)胞增殖機(jī)制，以期能為肺纖維化發(fā)病機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)、尋找抗纖維化藥物。

1 材料與方法

1.1 材料

健康雄性SD大鼠，體重180～220 g，許可證號(hào)SCXK (滬) 2013-0006。博萊霉素(日本化藥株式會(huì)社)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(美國(guó)RD公司)；BrdU增殖檢測(cè)試劑盒(美國(guó) Roche )；兔抗大鼠α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)多克隆抗體、小鼠抗大鼠collagen I 單克隆抗體(美國(guó)Abcam)；小鼠抗大鼠p27 單克隆抗體、兔抗大鼠eIF3a單克隆抗體(美國(guó)cell signaling)；小鼠抗大鼠GAPDH 單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz)。Masson染色試劑盒(南京凱基)。CGRP ELISA檢測(cè)試劑盒(美國(guó)Creative Diagnostics)。CGRP、 CGRP8-37(美國(guó) Sigma)；Prime ScriptTMRT reagent Kit、Power SYBR Green PCR Master Mix(大連寶生物工程有限公司)，引物設(shè)計(jì)合成(上海生物)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及模型的制備 24只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，按體重隨機(jī)分為3組(n=8)：對(duì)照組(Control)；博萊霉素組(Bleomycin, 5 mg/kg)；博萊霉素+辣椒素組(Bleomycin+Capsaicin)：造模前4 d大鼠皮下注射辣椒素(50 mg/kg·d)，用以耗竭內(nèi)源性CGRP。將大鼠用10%水合氯醛(0.3 ml/100 g)腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥位固定于實(shí)驗(yàn)臺(tái)，分離氣管，Bleomycin組和Bleomycin + Capsaicin組在環(huán)狀軟骨下0.5 cm處用1 ml注射器緩慢注入Bleomycin溶液(5 mg/kg)。迅速直立大鼠旋轉(zhuǎn)，使藥液均勻分布于兩肺。對(duì)照組注入等量的生理鹽水。造模后第28天處死動(dòng)物進(jìn)行病理學(xué)觀察及各指標(biāo)檢測(cè)。

1.2.2 肺組織形態(tài)學(xué)觀察及Masson染色 動(dòng)物處死后取大鼠左肺以4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋切片, HE染色。步驟如下：Mayer’s蘇木素溶液染色10 min(脫色搖床輕搖)；0.5%鹽酸水溶液分化10 s；75%酒精溶液分色30 s，自來水洗滌20 min；0.5%伊紅酒精溶液染色1 min；95%酒精溶液脫水30 s；100%無水乙醇溶液脫水5 min×3次；二甲苯溶液中透明5 min×2次；中性樹膠封片、干燥、拍照分析。肺組織Masson膠原染色按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3 免疫組化檢測(cè)肺組織α-SMA蛋白表達(dá) 肺組織石蠟切片, 厚度約每片4 μm, 常規(guī)脫蠟至水, 抗原修復(fù)液修復(fù)20 min, 封閉液室溫封閉1 h, 抗α-SMA一抗 (1∶400) 4℃過夜, 二抗 (1∶400) 室溫孵育2 h, SABC 室溫孵育1 h, DAB 顯色, 蘇木素復(fù)染, 中性樹膠封片觀察。陽性細(xì)胞表達(dá)呈黃至棕黃色顆粒。

1.2.4 血漿CGRP濃度測(cè)定 腹主動(dòng)脈采血4 ml 集于含10% Na2EDTA 40 μl和抑肽酶40 μl的試管中，3 500 r/min，4°C離心20 min，收集血漿，按CGRP ELISA檢測(cè)試劑盒說明書測(cè)定血漿中CGRP的濃度。

1.2.5 大鼠原代肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組 大鼠原代肺成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)按文獻(xiàn)采用組織塊貼壁法制備肺成纖維細(xì)胞。結(jié)果顯示，所有貼壁良好的肺組織塊周圍均5～7內(nèi)有細(xì)胞長(zhǎng)出，細(xì)胞形態(tài)為梭形成纖維樣細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)過傳代純化后第3代細(xì)胞經(jīng)波形蛋白細(xì)胞免疫組化染色鑒定為陽性，說明培養(yǎng)的細(xì)胞為肺成纖維細(xì)胞。因此細(xì)胞實(shí)驗(yàn)用第3代培養(yǎng)的原代細(xì)胞。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分6組(n=9)：(1)Control組；(2)TGF-β1組：細(xì)胞用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h；(3)+CGRP 1 nmol/L組：細(xì)胞用CGRP(1 nmol/L)預(yù)處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h；(4)+CGRP 10 nmol/L組：細(xì)胞用CGRP(10 nmol/L)預(yù)處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h；(5)+CGRP 100 nmol/L組：細(xì)胞用CGRP(100 nmol/L)預(yù)處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h；(6)+CGRP8-37 1 μmol/L和CGRP 100 nmol/L組：細(xì)胞用CGRP8-37(1 μmol/L)和CGRP(100 nmol/L)預(yù)處理1 h，再用TGF-β1(5 ng/ml)處理48 h。

1.2.6 BrdU法測(cè)定細(xì)胞增殖 細(xì)胞以6×103cells/well的密度種于96孔板，貼壁后用1% FBS的DMEM高糖培基處理24 h。細(xì)胞分別根據(jù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行處理，處理結(jié)束時(shí)，每孔加入10 μl BrdU，正常培養(yǎng)條件下孵育4 h，固定液室溫孵育30 min，室溫孵育BrdU抗體90 min，PBS洗滌5 min×3，加入200 μl 底物，室溫反應(yīng)15 min，每孔加入1 mol/L硫酸 25 μl，2 min之內(nèi)在450 nmol/L波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀檢測(cè)光密度值(OD值)。

1.2.7 real Time PCR檢測(cè)CGRP、eIF3a 、p27、α-SMA、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ mRNA的表達(dá) 用Trizol等試劑提取組織或細(xì)胞總RNA后，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行RT反應(yīng)。所得cDNA在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(7500 Real Time PCR System, Applied Biosystem)上進(jìn)行反應(yīng)。按照說明，使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒，以2 μl cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參照，PCR擴(kuò)增基因片段。引物如表1：

Tab. 1 Primer seguence

1.2.8 Western blot檢測(cè)eIF3a、p27、α-SMA、collagen Ⅰ和collagen Ⅲ蛋白表達(dá) 低溫提取組織或細(xì)胞蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離樣品，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別滴加GAPDH(1∶2 000)、eIF3a (1∶1 000)、p27 (1∶1 000)、α-SMA (1∶1 000)、 collagen I (1∶1 000) 一抗4℃過夜。洗膜, 相應(yīng)二抗 (1∶2 000) 室溫孵育1 h。洗膜后將高靈敏的LunimataTMCrescendo發(fā)光劑加到膜的正面，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照用，Image J 1.43(National Institutes of Health)軟件進(jìn)行灰度值分析并比較各組蛋白表達(dá)差異。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 Capsaicin對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織結(jié)構(gòu)的影響

HE染色發(fā)現(xiàn)Control組肺組織結(jié)構(gòu)清晰，肺泡結(jié)構(gòu)完整，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞未見增生。相比之下，Bleomycin組肺組織肺泡壁厚度明顯增加、細(xì)胞外基質(zhì)明顯增厚、肺間隔明顯增寬、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞增生明顯，而Capsaicin + Bleomycin組的這一病理變化進(jìn)一步加重(圖1)。以上結(jié)果表明當(dāng)用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后可以加重博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。

Fig. 1 Effect of capsaicin on lung histology in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats (HE ×100)

2.2 Capsaicin對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠肺組織α-SMA表達(dá)的影響

real time PCR、Western blot及免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Bleomycin組肺組織α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯增高，而辣椒素預(yù)處理組α-SMA mRNA和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增高(P<0.01，圖2、圖3，表2)。以上結(jié)果表明當(dāng)用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后可以加重博萊霉素誘導(dǎo)的α-SMA表達(dá)。

Fig. 2 Effect of capsaicin on α-SMA expression in lung tissue of bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats (arrows indicated α-SMA positive staining) (Immunohistochemisty ×100)

2.3 Capsaicin對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化肺組織膠原表達(dá)的影響

與Control組相比，Bleomycin處理組Ⅰ型膠原mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯增高(P<0.01)，而辣椒素預(yù)處理組Ⅰ型膠原mRNA及蛋白的表達(dá)進(jìn)一步增高(P<0.05，圖3，表2)。Masson染色發(fā)現(xiàn)Control組肺組織肺泡間隔可見少量膠原纖維，Bleomycin組肺泡間隔可見大量膠原纖維增生，而Capsaicin+Bleomycin組膠原纖維的表達(dá)進(jìn)一步增高(圖4)。以上結(jié)果表明當(dāng)用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后可以加重博萊霉素誘導(dǎo)的肺組織膠原沉積。

Fig. 3 Effect of capsaicin on α-SMA and collagen Ⅰprotein expression in lung tissue of bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats by Western blot CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; α-SMA: α-smooth muscle actin

Groupα-SMAmRNAα-SMAproteincollagenⅠmRNAcollagenⅠproteinCON1.01±0.130.98±0.091.11±0.140.99±0.11BLM2.77±0.21**1.78±0.15**3.44±0.45**2.41±0.32**BLM+CAP3.76±0.48#2.45±0.32#4.77±0.53#3.42±0.38#

CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; α-SMA: α-smooth muscle actin

**P<0.01vscontrol;##P<0.05vsbleomycin

Fig. 4 Effect of capsaicin on collagen accumulation in bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats (Masson ×100)

2.4 Capsaicin對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠CGRP表達(dá)的影響

ELISA和real time PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，Bleomycin組血漿及肺組織CGRP的表達(dá)顯著降低(P<0.01)，而用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠進(jìn)一步降低血漿及肺組織CGRP的表達(dá)(P<0.05，表3)。

GroupCGRP(pg/ml)α-CGRPmRNAβ-CGRPmRNACON45.38±7.281.01±0.131.04±0.21BLM32.08±4.74**0.55±0.27**0.58±0.24**BLM+CAP20.46±5.35#0.38±0.22#0.39±0.33#

CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; CGRP: Calcitonin gene-related peptide

**P<0.01vscontrol;##P<0.05vsbleomycin

2.5 Capsaicin對(duì)博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠肺組織eIF3a、p27表達(dá)的影響

real time PCR和Western blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Bleomycin處理組eIF3a表達(dá)水平明顯增高，p2表達(dá)水平明顯降低(P<0.01)。而用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后能夠進(jìn)一步增加eIF3a的表達(dá)、降低p27的表達(dá)(P<0.05，圖5，表4)。以上結(jié)果表明當(dāng)用辣椒素預(yù)先耗竭內(nèi)源性CGRP后，肺組織eIF3a的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)而p27的表達(dá)進(jìn)一步下調(diào)。

Fig. 5 Effect of capsaicin on eIF3a and p27 protein expression in lung tissue of bleomycin-induced pulmonary fibrosis rats by Western blot CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; eIF3a: Eukaryotic translation initiation factor 3a

GroupIF3amRNAeIF3aproteinp27mRNAp27proteinCON0.97±0.091.08±0.101.01±0.041.04±0.12BLM1.87±0.23**2.32±0.22**0.58±0.05**0.55±0.09**BLM+CAP2.43±0.31#3.11±0.29#0.41±0.11#0.38±0.08#

CON: Control; BLM: Bleomycin; CAP: Capsaicin; eIF3a: Eukaryotic translation initiation factor 3a

**P<0.01vscontrol;##P<0.05vsbleomycin

2.6 CGRP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠原代肺成纖維細(xì)胞eIF3a、p27表達(dá)的影響

real time PCR和Western blot方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能明顯促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞eIF3a的表達(dá)、降低p27的表達(dá)(P<0.01)，CGRP可劑量依賴性的抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的eIF3a的表達(dá)、促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的p27的表達(dá)，而CGRP的抑制劑CGRP8-37可取消此作用(圖6、圖7，表5)。

2.7 CGRP對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠原代肺成纖維細(xì)胞α-SMA、Ⅰ型膠原表達(dá)的影響

real time PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1能明顯促進(jìn)肺成纖維細(xì)胞α-SMA及Ⅰ型膠原的表達(dá)(P<0.01vsControl)，CGRP (1, 10, 100 nmol/L)可劑量依賴性的抑制TGF-β1所誘導(dǎo)的α-SMA和Ⅰ型膠原的表達(dá)，而CGRP的抑制劑CGRP8-37可以取消此作用(圖8、圖9，表6)。

Fig. 6 Effect of CGRP on TGF-β1-induced the expression of eIF3a in cultured pulmonary fibroblasts

Fig. 7 Effect of CGRP on TGF-β1-induced the expression of p27 in cultured pulmonary fibroblasts

GroupBrdUincorporationeIF3amRNAeIF3aproteinp27mRNAp27proteinControl0.19±0.070.95±0.091.02±0.111.04±0.121.05±0.14TGF-β1(5ng/ml)1.12±0.17**2.96±0.35**3.97±0.41**0.26±0.06**0.38±0.05**+CGRP(1nmol/L)0.72±0.13#2.13±0.22#3.02±0.33#0.49±0.08#0.53±0.07#+CGRP(10nmol/L)0.64±0.15##1.94±0.20##2.63±0.29##0.56±0.11##0.62±0.05##+CGRP(100nmol/L)0.53±0.11##1.64±0.18##2.22±0.23##0.67±0.07##0.75±0.06##+CGRP(100nmol/L)&CGRP8-37(1μmol/L)0.91±0.20△△2.89±0.31△△3.68±0.36△△0.29±0.06△△0.41±0.08△△

CGRP8-37: CGRP receptor inhibitor; TGF-β1: Tumor grouth factor β1

**P<0.01vscontrol;##P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1;#△△P<0.01vsCGRP (100 nmol/L)

Groupα-SMAmRNAα-SMAproteincollagenⅠmRNAcollagenⅠproteinControl1.01±0.111.00±0.141.05±0.120.98±0.14TGF-β1(5ng/ml)4.51±0.61**3.89±0.52**5.24±0.71**4.03±0.55**+CGRP(1nmol/L)3.23±0.34#2.98±0.41#3.51±0.53#2.99±0.42#+CGRP(10nmol/L)2.94±0.37##2.54±0.37##3.15±0.48##2.61±0.38##+CGRP(100nmol/L)2.64±0.29##2.11±0.32##2.86±0.37##2.37±0.31##+CGRP(100nmol/L)&CGRP8-37(1μmol/L)4.08±0.72△△3.65±0.51△△4.87±0.69△△3.85±0.42△△

CGRP8-37: CGRP receptor inhibitor

**P<0.01vscontrol;##P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1;#△△P<0.01vsCGRP (100 nmol/L)

Fig. 8 Effect of CGRP on TGF-β1-induced expression of α-SMA in cultured pulmonary fibroblasts

Fig. 9 Effect of CGRP on TGF-β1-induced expression of type I collagen in cultured pulmonary fibroblasts

3 討論

博萊霉素(bleomycin)是一種細(xì)胞毒性抗惡性腫瘤藥物，該藥的毒副作用之一是引起肺纖維化。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，博萊霉素所致肺纖維化病理組織學(xué)改變與人類肺纖維化非常相似，普遍作為研究肺纖維化的模型[10]。本研究進(jìn)一步證明博萊霉素造模28 d后肺組織肺泡壁厚度明顯增加、大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，成纖維細(xì)胞明顯增生、細(xì)胞外基質(zhì)明顯增厚、膠原和α-SMA表達(dá)明顯增加。最近研究發(fā)現(xiàn)在CO2和石棉誘導(dǎo)的肺損傷并發(fā)肺纖維化的患者中，肺組織CGRP的表達(dá)明顯降低[7]。而在博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型中發(fā)現(xiàn)肺組織CGRP的表達(dá)明顯降低，用capsaicin耗竭內(nèi)源性CGRR后能明顯加重博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化。本研究結(jié)果表明CGRP參與了肺纖維化的發(fā)生與發(fā)展。

肺纖維化過程中，細(xì)胞因子或炎性因子誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞增殖的機(jī)制尚未完全闡明。文獻(xiàn)報(bào)道，真核翻譯起始因子(如eIF2α、eIF4E等)參與了不同組織成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控，如過表達(dá)eIF4E能夠促進(jìn)大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的增殖[11,12]。近年來的研究表明eIF3的多個(gè)亞基在腫瘤細(xì)胞中存在異常表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲、分化及預(yù)后相關(guān)[2]。eIF3a是eIF3中最大的亞基，于1976年從兔網(wǎng)狀細(xì)胞中分離得到，分子量為170 kD[13]。研究表明抑制eIF3a可下調(diào)p27的表達(dá)，抑制cyclin-CDK復(fù)合物磷酸化，使細(xì)胞生長(zhǎng)停滯在G1期，從而抑制細(xì)胞增殖[14]。p27作為一種CDKI，能夠通過多種方式調(diào)控細(xì)胞周期，其結(jié)果是抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。p27對(duì)細(xì)胞周期的控制主要是通過與cyclin E/CDK2的相互作用而使得細(xì)胞周期阻滯于G1/S[15]。最新的研究發(fā)現(xiàn)eIF3a通過下調(diào)p27的表達(dá)而參與了肺成纖維細(xì)胞增殖的調(diào)控，與肺纖維化的形成有關(guān)[5]。本研究發(fā)生在博萊霉素誘導(dǎo)發(fā)肺纖維化大鼠模型中，eIF3a的表達(dá)明顯升高而p27表達(dá)顯著降低，當(dāng)用capsaicin耗竭內(nèi)源性CGRR后，肺組織eIF3a的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)而p27表達(dá)進(jìn)一步降低。而外源性CGRP能夠劑量依賴性抑制TGF-β1誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞eIF3a的表達(dá)，上調(diào)p27的表達(dá)，而CGRP的抑制劑CGRP8-37可取消此作用。這些結(jié)果提示，CGRP可能通過抑制eIF3a，進(jìn)而上調(diào)p27的表達(dá)，從而抑制了肺纖維化的形成。

綜上所述， CGRP在博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化中起著重要作用，其可能通過抑制eIF3a、上調(diào)p27的表達(dá)而抑制肺成纖維細(xì)胞的增殖，進(jìn)而抑制肺纖維化的形成與發(fā)展。

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Effects of calcitonin gene-related peptide on eIF3a and p27 expression in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats

LI Xian-wei△, ZUO Dong-ze, SHEN Yuan-yuan, HAO Wei

(Department of Pharmacology, Wannan Medical College, Wuhu 241002, China)

Objective: To observe the effects of calcitonin gene-related peptide (CGRP) on eukaryotic translation initiation factor 3a (eIF3a) and p27 expression in bleomycin-induced pulmonary fibrosis of rats and its possible mechanism. Methods: Twenty-four male SD rats weighing 180～220 g were randomly divided into three groups (n=8): control group, bleomycin group, bleomycin plus capsaicin group. Bleomycin (5 mg/kg) was used to induce pulmonary fibrosis rat model. Rats were given capsaicin (50 mg/kg·d) by subcutaneous injections 4 days before to deplete endogenous CGRP. At the end of experiments, blood samples were collected from carotid artery to determinate the plasma levels of CGRP by ELISA. The cells were divided into 6 groups as follows: control group, transforming growth factor-β1 (TGF-β1) group, +CGRP (1, 10, 100 nmol/L) group, +CGRP 100 nmol/L and CGRP8-37 1 μmol/L group respectively(n=9). TGF-β1 (5 ng/ml) stimulated proliferation of pulmonary fibroblasts and proliferation was measured by BrdU marking. The expression levels of eIF3a, p27, α-smooth muscle actin (α-SMA) and collagen Ⅰ were detected by immunohistochemisty, real-time PCR or Western blot. Results: The expressions of eIF3a, α-SMA, and collagen I were increased and the expression of p27 was decreasing in pulmonary fibrosis rats induced by bleomycin. Exogenous application of CGRP significantly inhibited TGF-β1-induced proliferation and differentiation of pulmonary fibroblasts and the expressions of α-SMA, collagen I and eIF3a, and upregulated the expression of p27. All these effects of CGRP were abolished in the presence of CGRP8-37. Conclusion: These results suggest that endogenous CGRP is related to the development of pulmonary fibrosis induced by bleomycin, and the inhibitory effect of CGRP on proliferation of lung fibroblasts involves the eIF3a/p27 signaling pathway.

calcitonin gene-related peptide; pulmonary fibrosis; pulmonary fibroblasts; eIF3a; p27; rat

安徽省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(1408085QH168)

2016-04-07 【修回日期】2016-10-12

R966

A

1000-6834(2017)01-016-06

△【通訊作者】Tel: 0553-3932459; E-mail: wnmclixianwei69@163.com